Elektrod Fabrication och implantation i Aplysia californica För flera kanaler Neural och muskulös Inspelningar i intakt, fritt bete Djur

Summary

En teknik beskrivs för implantering fyra

Abstract

Inspelning från viktiga nerver och muskler

Protocol

1. Elektrod Fabrication

1. För att skapa elektroden, använd sax för att klippa en bit av emalj belagda 0,001 tums diameter tråd av rostfritt stål ca 2 meter lång. Fäst en liten boll av spackel i varje ände av kabeln, vik tråden på mitten och snurra ändarna för att skapa en partvinnad, en så kallad differentiell elektrod.
2. Tape båda ändar av kabeln för att förhindra att rivas upp. Gör fyra differentiella elektroder, med en annan färg på tejpen för varje differentiella elektrod för identifikation (Figur 1A).
3. Twist två av skillnaden elektroderna och lämnar två inches utan snodd i ena änden och en tum på den andra änden. Upprepa med de resterande par differential elektroder (Figur 1B).
4. Twist båda två differentiella elektroder tillsammans, se till att ändarna förblir utan snodd. Håll upp elektroden montering och applicera limmet hushåll silikon vid korsningen av de fyra differentiella elektroderna och lämnar ändarna gratis. Häng och låt limmet torka i minst 4 timmar (Figur 1C).
5. Att isolera grenarna låg elektroden montering nedåt på en plan, flyttbar, yta, en träbit. Fan ut ändarna och fäst dem med tejp. Använd en liten plastbit för att höja elektroden församlingen strax före den grenar, och säkra det med tejp.
6. Vid en dissekera mikroskop, använder pincett att belägga grenar med silikon lim. Den 1-tums långa ändarna kommer att vara inne i djuret, så de bör ha ett mycket tunt lager lim. Låt limmet torka i minst 3 timmar.
7. Korta av 1-tums långa änden av en differentiell elektrod till två centimeter. På varje tråd, ta bort 1 cm av silikon och emalj. Curl en metalltråd i en krok för inspelning. Böj den andra kabeln uppåt och bort från kroken, detta kommer att fungera som jordledningen. Upprepa för de återstående tre elektroderna.
8. Välj en av de fyra elektroder på 2 tum slutet. Använd pincett för att skrapa silikon och emalj av, exponera 1cm av nakna tråd av rostfritt stål på varje av de 2 trådarna. Löd en guld-kontakt för att var och en av två ledare. Använd en bit lab tejp för att säkra slut och upprätthålla en separation mellan marken och stiften inspelning. Upprepa för de återstående tre elektroderna.
9. Fäst en 1-2cm bollen i silikon lim för att kabeln ca 1,5 inches från kroken slut för att förankra elektroder i djuret. Låt torka i minst en timme (Figur 1D).
   
   
   Figur 1. Elektrod Montering Fabrication. (A) Single differential elektrod bestående av en vek och vred tråd med sina ändar säkras med tejp. (B) Två differential elektroder vridna och lämnar utan snodd utrymme i ändarna. Olikfärgade band eller annan märkning bör användas för att identifiera de slutar. (C) Alla fyra differentiella elektroder kombineras till en enda elektrod församling bildar en enda kabel med separata grenar av den enskilda elektroder i varje ända, märkta med olika färger på band. (D) Slutlig form av elektrod montering. Till vänster finns det böjda krokar för inspelningar och jordledningar för varje differential elektrod. Till höger har guld kontaktstiften varit lödda på kablarna för anslutning till förstärkare. En förankring boll av silikon lim har också lagts till den vänstra sidan av församlingen.

2. Beredning av animaliska för implantation

1. Välj ett friskt djur som väger ca 350-450g. Som svar på små bitar av tång, bör djuret generera biter med intervall på mellan 3 till 5 sekunder. Den kompletta kirurgi med elektrod implantation bör ta cirka en timme.
2. Att söva djuret, injicera den med 30% w / v isoton MgCl _2. För att förhindra förlust av hemolymph och MgCl _2, kan injektionsstället bli behandlad i superlim innan du tar bort nålen.
   
   Figur 2. Skiss som visar hur djuret är låst för elektrod implantation och placering av snittet (anges med en bar).
   
   
3. Lägg bedövas djuret i en dissektion bricka med dess fot ner. Möta djurhuvud på, flytta Gälyta till vänster så att djuret är delvis på sin sida, lutar bort. Pin ner främre tentakler (Figur 2).
4. Placera plattan på scenen av en dissekera mikroskop. Stötta facket på ungefär en 20 graders vinkel för att lyfta huvudet och samla hemolymph i svansen, bort från snittet.
5. Använda dissektion sax, startar ett snitt något till höger om ögonfläck och utvidga det 1 till 1,5 cm anteriorly. Använd upprullningsdon fäst kanterna av facket för att hålla snittet öppen (Figur 2, notera bar nära ögonfläck visar snitt).
6. Att exponera buckala massa Använd pincett för att lyfta den genomskinliga hinnan underhuden och saxen använda för att klippa en öppning matcha de främsta snittet. Vik in kanterna på membranet i upprullningsdon.

3. Elektrod Implantation

1. Placera elektroden församlingen om ett mikromanipulator och flytta den över djurets snittet.
2. Den radular nerv är svårast att komma åt, och bör behandlas först. Det finns två alternativ för åtkomst till radular nerv.
3. Det första alternativet, som är att föredra, är att titta under buckala ganglion mellan BN1 och BN2. Om en gren av radular nerv är synlig, använd spetsig pincett böjd till en krok för att lyfta ut den gren (Figur 3, slinga av RN i ganglion märkt 1).
4. Om en gren av radular nerven inte är tillgänglig ovanför muskeln, är ett andra alternativ för att komma åt den via ett litet snitt i I2 bredvid bindväv vid basen av buckala ganglion (Figur 3, RN under muskel märkt 2). Snittet i I2 måste gå igenom två lager av I2 muskeln. Håll i kanten på muskeln snittet med raka pincett och använda hooked pincett för att dra ut en RN gren.
5. Håll nerven med fast pincett, använda en annan uppsättning pincett för att manipulera elektroden kroken på nerven.
6. Använd mikromanipulator att höja kroken så att nerven lyfts upp från buckala massa och klara av alla andra nerver eller vävnad. Inte tänja nerven.
7. Torka elektroden med en Kim-Torka eller sug bort överflödig vätska med en spruta. Vatten spänning kan orsaka nerv att kollapsa på sig själv, eller ett vattenlås för att bilda under nerv. I båda fallen skall området vara helt torr innan limmet appliceras.
8. Applicera en liten klick superlim där basen av kroken är i kontakt med botten av nerven. Applicera en droppe Aplysia koksaltlösning eller hemolymph att ställa in superlim. När limmet är vått ingenting bör flyttas så få lim mellan tråd och nerv skulle blockera den elektriska anslutningen.
9. Torka kroken igen. Blanda Kwik-Sil lim på en kylpåse.
10. Använd spetsen på en knappnål att tillämpa en liten del av Kwik-Sil lim, helt täcker varje blottade ledningar av kroken, men inte jordledningen.
11. Låt limmet att sätta i ca 5 minuter, justerar limmet om det drar sig undan från delar av kroken. Limmet är inställd när det inte längre fastnar vid beröring med stiftet (Figur 4 visar den slutliga utformningen).
12. När radular nerven elektroden är inställd, kan I2 muskeln nås. I området mellan BN1 och BN2 använder hooked pincett för krok och för att separera två band av I2 muskler från resten av muskeln genom att försiktigt dra banden uppåt. Fäst elektroden med samma förfarande.
13. Buckala nerver 2 och 3 är lättillgängliga och elektroder är fästa med samma förfarande.
14. När alla elektroderna är anslutna, skjut elektroden enheten i djuret upp till silikon ankare.
15. Sutur snittet stängt runt utskjutande elektrodkabeln, hålla ankaret inne i djuret. Superlim stygnen att säkerställa en god tätning.
16. Sätt i guld anslutningskontakter i andra änden av elektroden i ett litet block av cellplast. Tillbaka djuret till huvudtanken i en luftad isolerad behållare för återvinning natten.

Figur 3. Ett diagram av Aplysia utfodring apparaten kallas buccal massa. Här visas den buckala nerver (BN1, BN2, BN3), den radular nerven (RN) som kommer ut från botten av buckala ganglion, då störtar under muskeln, och plats på I2 muskler där elektroden är ansluten.

Figur 4. Skiss av enda elektrod fäst vid en nerv (eller muskel) och limmade på plats. Observera att de-isolerade regionen i böjda kroken är i direkt kontakt med nerven (eller muskel), förankrad på plats med superlim, och elektriskt isolerade från den flytande mediet med hjälp av Kwik-Sil. Notera också att deinsulated spets jordelektroden utsätts för flytande medium.

4. Inspelning

1. Vänja djuret i en luftad behållare och samtidigt knuten till färdskrivare i minst 1,5 timmar. Övervaka signalen medan djuret acclimating att kontrollera att alla elektroder fungerar och att bullernivåerna är låga.
2. Använd en videokamera för att spela ätbeteende när du använder datorn för att spela in signaler från neurala och muskulös elektroder. Synkronisera video och inspelningar elektroden med hjälp av en fyrkantsvåg-signal som styr en digital räknare i kameran för när den är samtidigt redovisas som en ytterligare kanal på datorn i Axoscope.
3. Utfodring beteenden som framkallades av de tekniker som debeskrivs i Morton och Chiel 1993.

Även ryggradslösa djur inte kräver formellt godkännande av en institutionell djur användning och skötsel kommitté, har vi säkerställt att alla behandlingar av Aplysia minimera skador och lidande för djuret, och att alla kirurgiska tekniker görs medan djuret är helt sövd.

Representativa resultat

Figur 5. (A) Samtidig fyra kanals inspelningar från en muskel (den gradskiva muskel I2), och från tre buckala nerver (den radular nerv, RN, buccal nerv 2, BN2 och buckala nerv 3, BN3) under en svälja svar. (B) En stillbild från den samtidiga videoupptagning av fritt beter sig djuret som den sväljer en remsa färdigskurna tång (0,5 cm i bredd), vilket har märkts på 0,5 cm mellanrum med vitt band så att dess rörelser lätt kan visualiseras som i djurfoder.

Discussion

En viktig nyhet som har gjort dessa inspelningar framgångsrik är att kombinera elektroder i en kabel. Två elektrod inspelningar har använts tidigare, men expanderar till fyra enskilda elektroder resulterade i bildandet av kirurgiska sammanväxningar som ofta hindrade djuret från att göra vanlig mat rörelser. Kombinera de elektroder i en kabel minskar huvuddelen av elektroderna inne i djuret, vilket i sin tur minskar immunförsvaret och gör det möjligt för djuret att röra sig mer fritt.

Den andra innovativa aspekten av detta förfarande är kombinationen av Superlim och Kwik-Sil för att fästa elektroderna till nerv eller muskel. Tidigare hade endast Superlim använts, men kombinationen av de två lim fungerar mer tillförlitligt och kan pågå flera dagar längre än Superlim, som bryter ner i ca 3 dagar när de utsätts för vatten.

Vi har visat att det är möjligt att implantera extracellulära elektroder i intakta, beter djur för inspelning eller stimulans från cellen kroppar enskilda identifierade nervceller [Warman och Chiel, 1995;. Lu et al, 2008]. De många elektroden teknik som vi har beskrivit i denna uppsats skulle därmed kunna användas för att samtidigt spela in från och manipulera verksamheten i fyra identifierade olika nervceller, eller en kombination av nervceller, muskler och nerver.

Vi har använt tekniken med fyra elektroder, men det är troligt att det skulle fungera för flera ytterligare elektroder. Dessutom i en opublicerad experiment var dessa elektroder som används för att spela in från pudental nerv i råtta, vilket visar att delar av denna teknik skulle kunna vara användbar i ryggradsdjur och hos människor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enamel coated stainless steel wire	California Fine Wire Company		0.001D, coating h
Household Silicone II Glue	GE Healthcare
Kwik-Sil Adhesive	World Precision Instruments, Inc.
Duro Qwik-Gel superglue	Henkel Corp
A-M Systems model 1700 amplifier	A-M Systems		Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle
Axoscope 10.1	Molecular Devices
Gold Connector Pins	Bulgin	SA3148/1
Gold Connector Sockets	Bulgin	SA3149/1