Summary
Une technique est décrite pour l'implantation de quatre
Abstract
Enregistrement à partir de nerfs et des muscles clés du
Protocol
1. Fabrication des électrodes
- Pour créer l'électrode, utiliser des ciseaux pour couper un morceau de 0,001 émaillé fils d'acier de diamètre pouces inox d'environ 2 pieds de long. Fixez une petite boule de pâte à chaque extrémité du fil, pliez le fil en deux, et de spin les extrémités pour créer une paire torsadée, dite électrode différentielle.
- Bande aux deux extrémités du fil pour prévenir leur effilage. Faire quatre électrodes différentielles, en utilisant une couleur différente de ruban pour chaque électrode différentielle des fins d'identification (figure 1A).
- Twist deux des électrodes différentielles ensemble, laissant deux pouces sans torsion sur une extrémité et 1 pouce sur l'autre extrémité. Répéter avec le reste de la paire d'électrodes différentielles (figure 1B).
- Twist deux séries de deux électrodes différentielles ensemble, en s'assurant que les extrémités restent sans torsion. Hold up l'assemblage d'électrodes et d'appliquer la colle silicone ménages à la jonction de quatre électrodes différentielles, laissant les extrémités libres. Hang et permettre à la colle de sécher pendant au moins 4 heures (figure 1C).
- Pour isoler les branches, poser l'ensemble électrode vers le bas sur un plat, mobile, de surface comme un morceau de bois. Ventilateur sur les extrémités et les fixer avec du ruban adhésif. Utiliser un petit morceau de plastique à élever l'ensemble d'électrodes juste avant qu'elle branches, et sécurisé avec des bandes.
- Lors d'une loupe binoculaire, l'utilisation de pinces pour bien enrober les branches avec de la colle silicone. Les extrémités de 1 pouce de long sera l'intérieur de l'animal, ils doivent donc avoir une très fine couche de colle. Laissez la colle sécher pendant au moins 3 heures.
- Raccourcir la fin 1-pouce de long d'une électrode différentielle à deux centimètres. Sur chaque fil, enlever 1cm de silicone et de l'émail. Curl un fil dénudé dans un crochet pour l'enregistrement. Pliez l'autre fil haut et loin de l'hameçon, ce qui servira de fil de terre. Répétez l'opération pour les trois autres électrodes.
- Sélectionnez l'un des quatre électrodes sur la fin de 2 pouces. Utilisez une pince à gratter de silicone et de l'émail, exposant 1cm de fil d'acier inox nu sur chacun des 2 fils. Souder un connecteur d'or à chacun des deux fils. Utilisez un morceau de ruban de laboratoire pour assurer la fin et de maintenir une séparation entre le sol et les broches d'enregistrement. Répétez l'opération pour les trois autres électrodes.
- Fixer une boule 1 à 2 cm de la colle silicone pour le câble, soit environ 1,5 cm de l'extrémité du crochet d'ancrage des électrodes au sein de l'animal. Laisser sécher au moins une heure (figure 1D).
Figure 1. Fabrication des électrodes Assemblée. (A) d'électrode différentielle unique constituée d'un fil plié et tordu avec ses extrémités avec du ruban adhésif sécurisé. (B) Deux électrodes différentielles tordus ensemble, en laissant un espace sans torsion à l'extrémité. Différentes bandes de couleur ou d'une autre marque doit être utilisée pour identifier les extrémités. (C) Toutes les électrodes différentielles quatre combinés en un ensemble d'électrode unique, formant un seul câble avec des branches séparées des électrodes individuelles à chaque extrémité, repérés par des couleurs distinctes de ruban. (D) sous forme finale de l'assemblage de l'électrode. Sur la gauche, il ya enroulée crochets pour les enregistrements et les fils de terre pour chaque électrode différentielle. Sur la droite, broches en or ont été soudées aux fils pour le raccordement à l'amplificateur. Une boule d'ancrage de la colle silicone a également été placé vers le côté gauche de l'assemblée.
2. Préparation des animaux pour l'implantation
- Sélectionnez un animal sain, qui pèse environ 350-450g. En réponse à de petits morceaux d'algues, l'animal devrait générer des piqûres à des intervalles de 3 à 5 secondes. La chirurgie avec implantation d'électrodes devrait prendre environ une heure.
- Pour anesthésier l'animal, y injecter 30% p / v isotonique MgCl 2. Pour éviter la perte d'hémolymphe et MgCl 2, le site d'injection peuvent être revêtus de la superglue avant de retirer l'aiguille.
Figure 2. Schéma montrant comment l'animal est épinglé pour l'implantation d'électrodes, et l'emplacement de l'incision (indiqué par une barre). - Lay l'animal anesthésié dans un bac de dissection avec son pied par terre. Face à la tête d'animal sur la, décaler la zone Gill à votre gauche telles que l'animal est partiellement sur son côté, penche du côté opposé. Pin le long des tentacules antérieur (figure 2).
- Placez le plateau sur la scène d'un microscope à dissection. Caler le plateau à un angle de 20 degrés d'élever la tête et de recueillir l'hémolymphe dans la queue, loin de l'incision.
- Avec des ciseaux de dissection, commencez une incision légèrement sur votre droite du piétin-verse et l'étendre de 1 à 1,5 cm vers l'avant. Utilisez écarteurs fixés sur les bords du plateau pour maintenir l'ouverture incision (figure 2; barre de note près de l'incision piétin-verse indiquant).
- Pour exposer la masse buccale, l'utilisation forceps pour soulever la membrane claire sous la peau et les ciseaux pour couper l'utilisation d'une ouverture correspondant de l'incision principale. Tuck les bords de la membrane dans les écarteurs.
3. L'implantation d'électrodes
- Placez l'assemblage d'électrodes sur un micromanipulateur et le déplacer sur l'incision de l'animal.
- Le nerf est radular plus difficiles d'accès, et devraient être abordés en premier. Il ya deux possibilités pour accéder au nerf radular.
- La première option, qui est préférable, c'est de regarder sous le ganglion buccal entre BN1 et BN2. Si une branche du nerf radular est visible, utilisez une pince à pointe fine recourbée en crochet pour sortir la branche (figure 3, la boucle de la RN sous ganglionnaires étiquetés 1).
- Si une branche du nerf radular n'est pas accessible au-dessus du muscle, une deuxième option est d'y accéder via une petite incision dans I2 à côté du tissu conjonctif, à la base du ganglion buccal (figure 3, RN-dessous du muscle étiquetés 2). L'incision dans I2 doit passer par deux couches de muscle I2. Tenez le bord de l'incision musculaire avec une pince droite et utilisez la pince accrochée à une branche sortir RN.
- Tout en maintenant le nerf avec la pince accroché, utiliser un ensemble différent de pince pour manipuler le crochet électrode sur le nerf.
- Utilisez le micromanipulateur pour élever le crochet de sorte que le nerf est soulevé loin de la masse buccale et claire de toute autres nerfs ou des tissus. Ne pas étirer le nerf.
- L'électrode à sec en utilisant un Kim-Wipe ou aspiration hors de l'excès de liquide avec une seringue. Tension de l'eau peut causer le culot de s'effondrer sur lui-même, ou un sceau d'eau pour former sous le nerf. Dans les deux cas, la zone doit être complètement sèche avant de la colle est appliquée.
- Appliquez une noisette de colle où la base du crochet est en contact avec le fond du nerf. Appliquez une goutte de solution saline ou de l'aplysie hémolymphe de définir la superglue. Quand la colle est rien humide doit être déplacé que l'obtention de la colle entre le fil et le nerf pourrait bloquer la connexion électrique.
- Sécher le crochet de nouveau. Mélanger Kwik-Sil colle sur un sac de glace.
- Utilisez la pointe d'une épingle à appliquer une petite quantité de colle Kwik-Sil, couvrant complètement toute fil exposé de l'hameçon, mais pas le fil de terre.
- Laissez la colle ensemble pendant 5 minutes environ, le réajustement de la colle si elle se détache des sections de l'hameçon. La colle est réglée quand elle s'en tient plus quand on la touche avec la broche (figure 4 montre la configuration finale).
- Une fois l'électrode nerveuse radular est réglé, le muscle I2 peut être consulté. Dans la zone entre BN1 et BN2, utilisez la pince accrochée à crochet et à séparer deux bandes du muscle I2 du reste du muscle en tirant doucement sur les bandes vers le haut. Fixez l'électrode en utilisant la même procédure.
- Nerfs buccaux 2 et 3 sont facilement accessibles et les électrodes sont fixées à la même procédure.
- Une fois que toutes les électrodes sont attachées, faites glisser l'assemblage d'électrodes dans l'animal à l'ancre en silicone.
- Suture de l'incision fermée autour du câble de l'électrode en saillie, en gardant le point d'ancrage intérieur de l'animal. Superglue les points de suture pour assurer une bonne étanchéité.
- Insérez le connecteur d'or conseils à l'autre bout de l'électrode dans un petit bloc de polystyrène. Retour à l'animal de la cuve principale dans un récipient d'isolation aéré pour la nuit de récupération.
Figure 3. Un schéma de l'appareil d'alimentation aplysie connue comme étant la masse buccale. Indiqués sont les nerfs buccaux (BN1, BN2, BN3), le nerf radular (RN) qui sort du fond du ganglion vestibulaire, puis plonge sous le muscle, et l'emplacement sur le muscle I2 où l'électrode est attaché.
Figure 4. Schéma de principe d'électrode unique attaché à un nerf (ou musculaires) et collés en place. Notez que la région de-isolée du crochet enroulée est en contact direct avec le nerf (ou musculaires), ancré en place avec la superglue, et électriquement isolée du milieu liquide en utilisant Kwik-Sil. Notez également que la pointe de l'électrode deinsulated sol est exposé au fluide.
4. Enregistrement
- Acclimate l'animal dans un récipient aéré alors attaché à l'appareil de contrôle pendant au moins 1,5 heures. Surveiller le signal alors que l'animal est acclimatation de vérifier que toutes les électrodes sont de travail et que les niveaux sonores sont bas.
- Utiliser une caméra vidéo pour enregistrer le comportement alimentaire tout en utilisant l'ordinateur pour enregistrer des signaux provenant des électrodes neurales et musculaires. Synchroniser les enregistrements vidéo et de l'électrode en utilisant un signal carré qui contrôle un compteur numérique dans la vue caméra alors qu'elle est simultanément enregistré comme un canal supplémentaire sur l'ordinateur dans Axoscope.
- Nourrir les comportements sont suscitées par les techniques décrites dans Morton et Chiel 1993.
Bien que les animaux invertébrés ne nécessitent pas une approbation formelle par l'utilisation des animaux institutionnels et comité des soins, nous avons veillé à ce que tous les traitements de l'aplysie minimiser les dommages et la souffrance à l'animal, et que toutes les techniques chirurgicales sont effectuées alors que l'animal est totalement anesthésié.
Les résultats représentatifs
Figure 5 (A). Simultanée des enregistrements à quatre canaux à partir d'un muscle (le muscle I2 rapporteur), et de trois nerfs buccaux (le nerf radular, RN, nerf buccal 2, BN2, et nerf buccal 3, BN3) lors d'une intervention à avaler. (B) Un cadre toujours de l'enregistrement vidéo simultanés de l'animal librement se comporter comme il l'avale d'une bande d'algues prédécoupés (0,5 cm de largeur), qui a été marquée à intervalles de 0,5 cm avec des bandes blanches afin que ses mouvements peuvent être facilement visualisés comme l'animal se nourrit.
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Discussion
Une innovation clé qui a fait ces enregistrements succès est la combinaison des électrodes dans un seul câble. Deux enregistrements d'électrodes ont été utilisées avant, mais en élargissant à quatre électrodes individuelles conduit à la formation d'adhérences chirurgicales qui ont souvent empêché l'animal de faire des mouvements alimentation normale. Combinant les électrodes dans un seul câble réduit la majeure partie des électrodes à l'intérieur de l'animal, qui à son tour réduit la réponse immunitaire et permet à l'animal de se déplacer plus librement.
L'autre aspect innovant de cette procédure est la combinaison de la superglue et Kwik-Sil pour attacher les électrodes sur le nerf ou de muscle. Auparavant, seuls les Superglue avait été utilisé, mais la combinaison des deux colles fonctionne de façon plus fiable et peut durer plusieurs jours plus Superglue, qui se décompose en environ 3 jours lorsqu'ils sont exposés à l'eau.
Nous avons montré qu'il est possible d'implanter des électrodes extracellulaires intactes, des animaux au comportement pour l'enregistrement ou la stimulation des corps cellulaires des neurones individuels identifiés [Warman et Chiel, 1995;. Lu et al, 2008]. La technique d'électrodes multiples que nous avons décrites dans ce document pourrait donc être utilisé pour enregistrer simultanément à partir et à manipuler l'activité de quatre différents neurones identifiés, ou une combinaison des neurones, les muscles et les nerfs.
Nous avons utilisé la technique avec quatre électrodes, mais il est probable que cela fonctionne pour plusieurs électrodes supplémentaires. Par ailleurs, dans une expérience inédite, ces électrodes ont été utilisés pour enregistrer à partir du nerf honteuses du rat, ce qui indique que les aspects de cette technique pourrait être utile dans les animaux vertébrés et chez les humains.
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Acknowledgments
Nous remercions le soutien du NIH (NS047073 au CSM). Nous sommes également reconnaissants à Catherine pour son Kehl premières expériences Kwik-Sil, qui nous a encouragés à l'utiliser pour notre application.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
