Summary
기술은 넷 이온 주입에 대한 설명
Abstract
의 주요 신경 및 근육에서 녹음
Protocol
1. 전극 제작
- 전극을 만들려면, 약 2 미터 정도의 에나멜 코팅 0.001 인치 직경 스테인레스 스틸 와이어의 한 조각을 잘라 가위를 사용합니다. , 와이어의 각 끝에 퍼티의 작은 공을 첨부 절반 와이어를 접어, 그리고 트위스트 페어를 만들 끝을 스핀, 차등 전극했다.
- 테이프는 별을 이루는 물질을 방지하기 위해 전선의 끝을 모두. 식별을 위해 각 차동 전극 (그림 1A)에 대한 테이프의 다른 색상을 사용하여 네 미분 전극을 확인하십시오.
- 이인치를 떠나 함께 미분 전극의 트위스트 두 상대방에 한쪽 끝을 1 인치에 untwisted. 차동 전극의 나머지 쌍 (그림 1B)와 반복합니다.
- 엔드 untwisted 남아 있는지 확인하고, 두 차동 전극의 두 세트를 트위스트. 전극 어셈블리를 잡고 끝까지 무료로 떠나, 네 개의 차동 전극의 교차점에서 가정용 실리콘 접착제를 적용합니다. 잠깐 만요 및 접착제는 최소한 4 시간 (그림 1C)에 대한 건조하실 수 있습니다.
- 가지를 보온하려면, 나무 같은 조각은 평평, 이동, 표면에있는 전극 어셈블리를 내려 놓 아라. 끝을 밖으로 팬 테이프를 확보. 그냥 가지 전에 전극 어셈블리를 강화하고, 그 테이프 확보 플라스틱의 작은 조각을 사용합니다.
- 해부 현미경에서 실리콘 접착제로 코팅 나뭇가지를 집게를 사용합니다. 1 인치 길이 끝이 동물 내부 것입니다, 그래서 그들은 접착제의 매우 얇은 코팅이 있어야합니다. 접착제 적어도 3 시간 동안 건조하실 수 있습니다.
- 이cm 하나의 차동 전극의 1 인치 길이 끝이 짧게. 각각의 와이어에 실리콘과 에나멜의 1cm를 제거합니다. 레코딩을위한 후크 하나의 나선 컬. 후크의 다른 전선을 구부 멀리, 이것은 접지 와이어 역할을합니다. 나머지 세 전극에 대해 반복합니다.
- 2 인치 엔드에 네 개의 전극 중 하나를 선택합니다. 실리콘을 다쳤고, 그리고 2 개의 와이어의 각 베어 스테인레스 스틸 와이어의 1cm를 노출에서 에나멜을 집게를 사용하십시오. 두 와이어 각 솔더 골드 커넥터. 끝부분을 확보하고 지상과 녹음 핀 사이의 분리를 유지하기 위해 실험실 테이프의 조각을 사용합니다. 나머지 세 전극에 대해 반복합니다.
- 훅 엔드에서 약 1.5 인치 동물 이내에 전극을 고정하는 케이블에 실리콘 접착제의 1~2cm 볼을 연결합니다. 적어도 한 시간 (그림 1D)에 대한 건조하실 수 있습니다.
그림 1. 전극 어셈블리 제조. (A) 단일 차동 전극은 테이프와 함께 보안의 끝을 함께 접힌과 뒤틀린 와이어로 구성된. (B) 두 개의 차동 전극 끝에 untwisted 공간을 떠나 함께 트위스트. 다른 색깔의 테이프 또는 다른 표시는 끝을 식별하는 데 사용해야합니다. (C) 네개의 차동 전극 테이프가 독특한 색깔로 표시된 각 끝에있는 각각의 전극 별도의 지점과 함께 하나의 케이블을 형성 단일 전극 어셈블리로 결합. (D) 최종 전극 어셈블리의 형식입니다. 왼쪽에서, 각 차동 전극을위한 녹음 및 접지 와이어에 대한 갈고리를이 모습을 드러냅니다 있습니다. 오른쪽, 골드 커넥터 핀은 앰프에 연결하기위한 전선에 납땜했습니다. 실리콘 접착제의 고정 공은 또한 어셈블리의 왼쪽으로 배치되었습니다.
2. 이식을 위해 동물의 준비
- 350~450그램에 대한 무게 건강한 동물을 선택합니다. 다시마 작은 조각에 대응, 동물은 5 ~ 3시 사이에 초 간격으로 물기를 생성해야합니다. 전극 이식과 전체 수술은 한 시간 정도 소요됩니다.
- 동물을 마취시키기 위해서, 30 % W / V isotonic MgCl 2를 주사. hemolymph 및 MgCl 2의 손실을 방지하기 위해 사출 사이트는 바늘을 제거하기 전에 superglue에 코팅하실 수 있습니다.
그림 2. 도식 동물 전극 이식에 대한 고정된 방법을 보여주는 다이어그램과 절개의 위치 (막대로 표시). - 아래의 발에 절개 트레이에 anesthetized 동물을 배치. 동물 머리에 직면, 동물이 거리에 기대고, 그 측면에 부분입니다 왼쪽 등에 길 영역을 이동. 앞쪽에 촉수 (그림 2) 아래 핀.
- 해부 현미경의 무대에 트레이를 놓습니다. 머리를 제고하고 멀리 절개에서 꼬리에 hemolymph를 수집하기 위해 약 20도 각도에서 트레이를 프로프.
- 해부 가위를 사용하면, eyespot의 오른쪽에 약간의 절개를 시작하고 anteriorly 1.5cm로 1 확장. 절개 오픈을 보유하기 위해 트레이의 가장자리에 부착된 견인기 (; eyespot 나타내는 절개 근처에 참고 막대 그림 2)를 사용합니다.
- 구강 미사를 노출하려면 아래 맑은 멤브레인 올려 포셉를 사용하여피부 및 사용 가위는 기본 절개와 일치하는 열기를 잘라합니다. 견인기에 막의 가장자리를 넣어.
3. 전극 이식
- micromanipulator에 전극 어셈블리를 배치하고 동물의 절개를 통해 그것을 이동합니다.
- radular 신경에 액세스하는 가장 어려운이며, 첫번째 접근해야합니다. radular 신경에 액세스하기위한 두 가지 옵션이 있습니다.
- 바람직합니다 첫 번째 옵션은, BN1과 BN2 사이의 구강 신경절에 따라 볼 수 있습니다. radular 신경의 지점이 표시되면 (그림 3, 1 라벨 신경절 이하 RN의 루프) 지점을 리프트에 갈고리로 구부러진 미세 밀고 집게를 사용합니다.
- radular 신경의 지점이 근육 이상 액세스할 수없는 경우 두 번째 옵션은 구강 신경절의 기초 (2 분류 근육 아래에 그림 3, RN)에있는 결합 조직 옆에 I2의 작은 절개를 통해 액세스할 수 있습니다. I2의 절개는 I2 근육의 두 레이어를 통과해야합니다. 스트레이트 집게와 근육 절개의 가장자리에 잡고 RN 지점을 잡아 줬습니다 집게를 사용합니다.
- 갈고리 포셉로 신경을 잡고 있지만, 신경에 전극 후크를 조작하는 포셉의 다른 세트를 사용합니다.
- 신경이 떨어져 구강 대량부터 해제되도록 후크를 마련하기 위해 micromanipulator를 사용하여 다른 신경이나 조직의 취소합니다. 신경을 overstretch하지 마십시오.
- 주사기로 초과 유체에서 김 - 닦고 또는 흡입을 사용하여 전극을 건조. 워터 긴장 자체에 붕괴하는 신경, 또는 신경 아래의 양식에 물이 인감 발생할 수 있습니다. 접착제가 적용되기 전에 각각의 경우에,이 지역이 완전히 건조되어야합니다.
- 후크의 기본은 신경의 바닥과 접촉에 superglue의 작은 소량을 적용합니다. superglue을 설정 Aplysia 호수 또는 hemolymph의 드롭을 적용합니다. 접착제이 젖었 아무것도로 이동해서는 안됩니다 때 와이어와 용기 사이에 접착제를 받고하면 전기 연결을 차단합니다.
- 다시 미끼를 건조시킵니다. 얼음 팩 믹스 퀵 - 실 접착제.
- 완전히 후크의 노출된 전선을 덮고있는 퀵 - 실 접착제의 작은 금액을 적용 핀의 팁,하지만 접지 와이어를 사용하십시오.
- 접착제가이 미끼의 섹션에서 멀리 끌어 경우 접착제를 readjusting 5 분 정도로 설정되어 수 있습니다. 그것 더 이상 스틱은 (그림 4 최종 구성을 보여줍니다) 핀 만졌을 때 때 접착제가 설정됩니다.
- radular 신경 전극이 설정되면, I2 근육에 액세스할 수 있습니다. BN1과 BN2 사이의 영역에서 후크에 푹 집게를 사용하여 부드럽게 위쪽으로 밴드를 당겨 근육의 나머지 부분에서 I2 근육의 2 밴드를 분리합니다. 동일한 절차를 사용하여 전극을 부착합니다.
- 구강 신경 2와 3은 쉽게 액세스할 수 있으며, 전극은 같은 절차에 첨부됩니다.
- 일단 모든 전극은 실리콘 앵커까지 동물에 전극 어셈블리를 슬라이드, 첨부합니다.
- 절개는 동물 내부의 앵커를 유지, 튀어나온 전극 케이블 주위에 폐쇄 봉합해. 좋은 도장을 보장하기 위해 바늘을 Superglue.
- 스티로폼의 작은 블록으로 전극의 다른 끝에있는 금색 커넥터 조언을 넣습니다. 복구 하룻밤에 대한 aerated 격리 컨테이너의 주요 탱크에 동물을 반환합니다.
그림 3. 구강 덩어리로 알려진 Aplysia 먹이 장치의 도표. 구강 신경 (BN1, BN2, BN3), 종료 구강 신경절의 하단은 다음 근육 아래 틈을되는 radular 신경 (RN)와 전극이 연결된 I2 근육의 위치를 표시합니다.
그림 4. 신경에 연결된 (또는 근육)과 장소에서 접착 단일 전극의 도식 다이어그램. 모습을 드러냅니다 후크의 드 절연 지역 superglue과 장소에 고정 신경 (혹은 근육)과 직접 접촉하고, 전기 퀵 - 실상을 사용하여 액체 매체에서 절연합니다. 접지 전극의 deinsulated 끝에이 유체 매체 노출되는도 있습니다.
4. 녹음
- 최소 1.5 시간 동안 녹음 장비에 연결된 동안 aerated 컨테이너에있는 동물을 순응. 동물이 모든 전극 작동 및 소음 것을 적은 있는지 확인합니다 acclimating하는 동안 신호를 모니터링합니다.
- 신경 및 근육 전극의 신호를 기록하기 위해 컴퓨터를 사용하는 동안 먹이 동작을 기록하기 위해 비디오 카메라를 사용합니다. 가 동시에 Axoscope에서 컴퓨터에 추가 채널로 기록되는 동안 카메라보기 디지털 카운터를 제어 평방 웨이브 신호를 사용하여 비디오 및 전극 기록을 동기화합니다.
- 비헤이 비어를 수유하는 데 기술에 의해 elicited 아르모턴 앤드 Chiel 1993 년 scribed.
무척추 동물은 기관 동물 사용 및 관리위원회의 공식 승인을 필요로하지 않지만, 우리는 Aplysia의 모든 트리 트먼트가 손상을 최소화하고 동물에 고통, 그리고 동물이 완전히 anesthetized하는 동안 모든 수술 기법이 완료되는 것을 보장합니다.
대표 결과
그림 5. (A) 근육 (분도기 근육 I2)의 동시 4 채널 레코딩, 그리고 삼키는 응답 중 세 구강 신경 (radular 신경, RN, 구강 신경 2 BN2 및 구강 신경이 3 BN3)에서. 자유롭게 행동 동물의 동시 비디오 녹화에서 (B) 여전히 프레임이 제비의 움직임과 같이 쉽게 시각 수 있도록 흰색 밴드 0.5 cm 간격으로 표시되었습니다 precut의 해초 스트립 (가로 0.5 ㎝)로 동물 피드.
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Discussion
이 음반이 성공적으로 만들었 주요 혁신 하나의 케이블로 전극을 결합합니다. 두 전극 기록은 이전에 사용 아니고 넷 개인 전극을 확대하는 것은 종종 정상적인 먹이의 움직임을 만들기에서 동물을 방해 수술 adhesions의 형성 결과되었습니다. 한 케이블에 전극을 결합하면 차례로 면역 반응을 감소 동물, 내부 전극의 대량 감소하고 동물보다 자유롭게 이동할 수 있습니다.
이 절차의 또 다른 혁신적인 측면은 신경이나 근육에 전극을 부착 Superglue과 퀵 - 실의 조합입니다. 이전 단지 Superglue 사용했다지만, 두 glues의 조합이 더 안정적으로 작동하고 더 이상 물에 노출되면 약 3 일 이내에 고장 Superglue보다 몇 일간 지속될 수 있습니다.
우리는 그것이 개인 식별 뉴런의 세포 기관에서 기록 또는 자극에 대해 그대로, 행동 동물 세포 전극을 이식 수 있습니다 것을 보여주 [워맨와 Chiel, 1995;. 류 외, 2008]. 우리가이 종이에 설명되어있는 여러 전극 기술은 따라서 동시에부터 기록하고 네 가지 식별 뉴런 또는 신경, 근육과 신경의 조합의 활동을 조작하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 네 개의 전극과 기술을 사용하고 있지만, 그것이 몇 가지 추가적인 전극 위해 일할 것이라고 가능성이 높습니다. 또한, 게시되지 않은 실험에,이 전극은이 기술의 측면은 척추 동물과 인간에 유용하게 사용될 수 있다고 나타내는 쥐 pudental 신경에서 기록하는 데 사용되었습니다.
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Acknowledgments
우리는 기꺼이 NIH (NS047073에 HJC)의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 우리의 어플 리케이션을 위해 사용하는 것이 좋습니다 퀵 - 실상과 그녀의 초기 실험 캐서린 캘에 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
