Summary
Una técnica se describe para la implantación de cuatro
Abstract
Grabación de los nervios y los músculos clave de
Protocol
1. Fabricación de electrodos
- Para crear el electrodo, use tijeras para cortar un trozo de esmaltado 0.001 alambre de acero inoxidable de diámetro alrededor de 2 pies de largo. Coloque una pequeña bola de masilla a cada extremo del cable, doble el alambre a la mitad, y el giro de los extremos para crear un par trenzado, llamado electrodo diferencial.
- Tape ambos extremos del alambre para evitar que desentrañar. Hacer cuatro electrodos diferenciales, usando un color diferente de la cinta para cada electrodo diferencial para fines de identificación (Figura 1).
- Giro de dos de los electrodos diferenciales juntos, dejando dos pulgadas de torsión en un extremo y 1 pulgada en el otro extremo. Repita con el resto de par de electrodos diferenciales (fig. 1B).
- Gire los dos conjuntos de dos electrodos diferenciales juntos, asegurándose de que los extremos quedan sin torsión. Levante el conjunto de electrodos y aplicar la goma de pegar de silicona en la unión de los cuatro electrodos diferenciales, dejando los extremos libres. Cuelgue y deje que el pegamento se seque por lo menos durante 4 horas (fig. 1C).
- Para aislar las ramas, estaba el conjunto de electrodos hacia abajo sobre una superficie plana, muebles, un trozo de madera. Fan de los extremos y fijarlos con cinta adhesiva. Use una pequeña pieza de plástico para elevar el conjunto de electrodos justo antes de que las ramas, y seguro que con la cinta.
- En un microscopio de disección, el uso de fórceps para cubrir las ramas con pegamento de silicona. Los extremos de 1 pulgada de largo será en el interior del animal, por lo que debe tener una capa muy fina de pegamento. Deje que el pegamento se seque por lo menos 3 horas.
- Acortar el extremo largo de 1 pulgada de electrodo diferencial de uno a dos centímetros. En cada alambre, quite 1 cm de silicona y el esmalte. Curl un cable pelado en un gancho para la grabación. Doble el otro cable hacia arriba y lejos del gancho, lo que servirá como cable a tierra. Repita el procedimiento para las otras tres electrodos.
- Seleccione uno de los cuatro electrodos en la parte 2 pulgadas. El uso de fórceps para raspar el esmalte de silicona y apagado, la exposición de 1 cm de cable desnudo de acero inoxidable en cada uno de los dos cables. Soldar un conector de oro a cada uno de los dos cables. Use un pedazo de cinta de laboratorio para asegurar el final y mantener una separación entre el suelo y los pasadores de grabación. Repita el procedimiento para las otras tres electrodos.
- Coloque una bola de 1-2cm de la cola de silicona para el cable, alrededor de 1,5 pulgadas del extremo del gancho para fijar los electrodos dentro del animal. Deje secar por lo menos durante una hora (Figura 1D).
Figura 1. Fabricación de electrodos de la Asamblea. (A) Electrodo diferencial único, compuesto de un alambre doblado y retorcido, con sus extremos asegurados con cinta adhesiva. (B) dos electrodos diferenciales entrelazadas, dejando un espacio sin torsión en los extremos. Cintas de diferentes colores o marcado otro debe ser utilizado para identificar los extremos. (C) Todos los electrodos diferenciales cuatro combinados en un único conjunto de electrodos que forman un solo cable, con ramas separadas de los electrodos individuales en cada extremo, marcados con distintos colores de la cinta. (D) Forma definitiva del conjunto de electrodos. A la izquierda, no se enroscan los ganchos para las grabaciones y los cables de tierra para cada electrodo diferencial. A la derecha, alfileres de oro conector han sido soldadas a los cables para la conexión al amplificador. Una bola de anclaje de silicona pegamento también se ha colocado hacia el lado izquierdo de la asamblea.
2. Preparación de animales para la Implantación
- Seleccione un animal sano y pesa alrededor de 350-450g. En respuesta a pequeños trozos de algas marinas, el animal debe generar las picaduras a intervalos de entre 3 a 5 segundos. La cirugía completa con la implantación de electrodos debe tomar alrededor de una hora.
- Para anestesiar al animal, que se inyectan con un 30% w / v isotónica MgCl 2. Para evitar la pérdida de hemolinfa y MgCl 2, el sitio de inyección se pueden revestir de pegamento antes de retirar la aguja.
Figura 2. Diagrama esquemático que muestra cómo el animal se fija para la implantación de electrodos, y la ubicación de la incisión (indicado por una barra). - Coloque el animal anestesiado en una bandeja de disección con su pie en el suelo. Frente a la cabeza de animal en, desplace el área de enmalle a la izquierda tal que el animal es parte de su lado, apoyándose de distancia. Precisar los tentáculos anterior (Figura 2).
- Coloque la bandeja en el escenario de un microscopio de disección. Sostener la bandeja en un ángulo de 20 grados para elevar la cabeza y recoger la hemolinfa en la cola, lejos de la incisión.
- Usando tijeras de disección, iniciar una incisión ligeramente a la derecha de la mancha ocular y su ampliación del 1 al 1,5 cm hacia delante. Utilice separadores unido a los bordes de la bandeja para mantener la incisión abierta (Figura 2, un bar cerca de la incisión nota indicando mancha ocular).
- Para exponer la masa bucal, el uso de fórcepss para levantar la membrana transparente debajo de la piel y las tijeras para cortar el uso de una abertura correspondiente de la incisión principal. Meta los bordes de la membrana en los separadores.
3. La implantación de electrodos
- Coloque el conjunto de electrodos en un micromanipulador y moverlo sobre la incisión del animal.
- El nervio rádula es de más difícil acceso, y se debe abordar en primer lugar. Hay dos opciones para acceder a los nervios radular.
- La primera opción, que es preferible, es buscar en el ganglio vestibular entre BN1 y BN2. Si una rama del nervio radular es visible, use unas pinzas de punta fina doblada en forma de gancho para levantar la rama (Figura 3, el bucle de RN en ganglio marcado 1).
- Si una rama del nervio radular no es accesible por encima del músculo, una segunda opción es acceder a ella a través de una pequeña incisión en I2 al lado del tejido conectivo en la base del ganglio vestibular (Figura 3, RN por debajo de los músculos marcados 2). La incisión en I2 debe pasar por dos capas del músculo I2. Sostenga el borde de la incisión del músculo con pinzas rectas y el uso de las pinzas de gancho para tirar de una rama de RN.
- Mientras mantiene el nervio con la pinza de gancho, utilizar un conjunto diferente de pinzas para manipular el gancho del electrodo en el nervio.
- Utilice el micromanipulador para elevar el gancho para que el nervio se levanta lejos de la masa bucal y libre de cualquier otros nervios o el tejido. No estire demasiado el nervio.
- Seque el electrodo con un Kim-Wipe o succión de el exceso de líquido con una jeringa. Tensión del agua puede causar que el nervio se derrumbe sobre sí misma, o un sello de agua para formar en el nervio. En cualquier caso, el área debe estar completamente seca antes de pegamento se aplica.
- Aplicar una cantidad muy pequeña de pegamento en la base del gancho está en contacto con la parte inferior del nervio. Aplique una gota de solución salina o hemolinfa Aplysia para establecer el pegamento. Cuando el pegamento no es húmedo se debe mover como conseguir unión entre el cable y el nervio se bloquea la conexión eléctrica.
- Seque el gancho. Mezcla de Kwik-Sil pegamento en una bolsa de hielo.
- Use la punta de un alfiler para aplicar una pequeña cantidad de pegamento Kwik-Sil, cubriendo completamente los cables expuestos del gancho, pero no el cable a tierra.
- Deje que el pegamento para fijar durante unos 5 minutos, el reajuste de la cola si se aleja de las secciones del gancho. La cola se establece cuando se pega cuando ya no se tocó con el pasador (Figura 4 muestra la configuración final).
- Una vez que el electrodo nervio rádula está establecido, el músculo I2 se puede acceder. En la zona entre BN1 y BN2, utilice las pinzas gancho para conectar y separar dos bandas del músculo I2 del resto de los músculos tirando suavemente de las bandas hacia arriba. Conecte el electrodo utilizando el mismo procedimiento.
- Nervios bucales 2 y 3 son de fácil acceso y los electrodos están conectados con el mismo procedimiento.
- Una vez que todos se coloquen los electrodos, deslice el conjunto de electrodos en el animal hasta el anclaje de silicona.
- Sutura la incisión se cierra alrededor del cable del electrodo que sobresale, manteniendo el anclaje en el interior del animal. Superglue los puntos para asegurar un buen sello.
- Inserte las puntas del conector de oro en el otro extremo del electrodo en un pequeño bloque de espuma de poliestireno. Devolver el animal al tanque principal en un contenedor de aislamiento celular durante la noche para la recuperación.
Figura 3. Un diagrama del aparato de alimentación Aplysia se conoce como la masa bucal. Se muestran los nervios vestibulares (BN1, BN2, BN3), el nervio rádula (RN) que sale de la parte inferior del ganglio vestibular, luego se sumerge por debajo del músculo, y la ubicación en el músculo I2 donde está conectado el electrodo.
Figura 4. Esquema de electrodo conectado a un nervio (o músculo) y pegados en su lugar. Tenga en cuenta que la región de aislamiento del gancho curvado está en contacto directo con el nervio (o músculo), anclado en su lugar con pegamento, y aislados eléctricamente del medio líquido utilizando Kwik-Sil. Tenga en cuenta también que la punta deinsulated del electrodo de masa está expuesto al medio líquido.
4. Grabación
- Aclimatar al animal en un recipiente aireado mientras se está conectado al aparato de control durante al menos 1,5 horas. Monitorizar la señal mientras el animal está aclimatando a verificar que todos los electrodos están funcionando y que los niveles de ruido son bajos.
- Utilice una cámara de video para registrar el comportamiento de alimentación mientras se utiliza el ordenador para grabar las señales de los electrodos neurales y musculares. Sincronizar las grabaciones de vídeo y el electrodo con una señal de onda cuadrada que controla un contador digital en la vista de la cámara mientras se graban simultáneamente como un canal adicional en el equipo en Axoscope.
- Comportamientos de alimentación son provocadas por las técnicas descritas en Morton y Chiel 1993.
Aunque los animales invertebrados no requieren la aprobación formal por parte de un uso de los animales y el comité institucional de atención, nos hemos asegurado de que todos los tratamientos de Aplysia minimizar el daño y sufrimiento a los animales, y que todas las técnicas quirúrgicas se realizan mientras el animal esté totalmente anestesiado.
Resultados representante
Figura 5. (A) En forma simultánea las grabaciones de cuatro canales a partir de un músculo (el músculo del transportador I2), y de tres nervios vestibulares (el nervio radular, RN, nervio bucal 2, BN2, y el nervio vestibular 3, BN3) durante la respuesta a la deglución. (B) Una imagen fija de la grabación simultánea de vídeo del animal libre se comportan como se traga una tira de algas precortadas (0,5 cm de ancho), que ha estado marcada a intervalos de 0,5 cm con bandas blancas para que sus movimientos pueden ser fácilmente visualizados como el animal se alimenta.
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Discussion
Una innovación clave que ha hecho de estas grabaciones de éxito es la combinación de los electrodos en un cable. Dos grabaciones de electrodos se han usado antes, pero ampliando a cuatro electrodos individuales dio lugar a la formación de adherencias quirúrgicas que a menudo impide al animal hacer los movimientos normales de alimentación. La combinación de los electrodos en un cable reduce la mayor parte de los electrodos en el interior del animal, que a su vez reduce la respuesta inmune y permite que el animal se mueva con mayor libertad.
El otro aspecto innovador de este procedimiento es la combinación de pegamento y Kwik-Sil para conectar los electrodos a los nervios o músculos. Anteriormente, sólo se había utilizado un pegamento, pero la combinación de las dos colas de las obras más fiable y puede durar algunos días más de Superglue, que se descompone en unos 3 días cuando se expone al agua.
Hemos demostrado que es posible implantar electrodos extracelulares en animales intactos, comportándose de la grabación o la estimulación de los cuerpos celulares de las neuronas individuales identificadas [Warman y Chiel, 1995;. Lu et al, 2008]. La técnica de electrodos múltiples que hemos descrito en este documento podría utilizarse para grabar de forma simultánea desde y manipular la actividad de cuatro diferentes neuronas identificadas, o una combinación de las neuronas, músculos y nervios.
Hemos estado usando la técnica de cuatro electrodos, pero lo más probable es que sería el trabajo de varios electrodos adicionales. Por otra parte, en un experimento inédito, estos electrodos se utilizaron para grabar desde el nervio pudental de la rata, lo que indica que los aspectos de esta técnica podría ser útil en los animales vertebrados y en los seres humanos.
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Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de los NIH (NS047073 a HJC). También estamos agradecidos a Catherine Kehl por sus primeros experimentos con Kwik-Sil, que nos animó a usarlo para nuestra aplicación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
