Summary
चार दाखिल करने के लिए एक तकनीक वर्णित है
Abstract
कुंजी तंत्रिकाओं और मांसपेशियों से रिकॉर्डिंग
Protocol
1. इलेक्ट्रोड निर्माण
- इलेक्ट्रोड बनाने के लिए, कैंची का उपयोग करने तामचीनी - लेपित 0.001 इंच व्यास स्टेनलेस स्टील के बारे में 2 फीट लंबे तार का एक टुकड़ा काट. पोटीन की एक छोटी सी गेंद को तार के प्रत्येक के अंत में संलग्न हैं, आधे में तार गुना, और समाप्त होता है एक मुड़ जोड़ी बनाने के स्पिन, एक अंतर इलेक्ट्रोड कहा जाता है.
- टेप दोनों unraveling रोकने के तार के समाप्त होता है. चार अंतर इलेक्ट्रोड, पहचान प्रयोजनों के लिए प्रत्येक अंतर इलेक्ट्रोड (चित्रा 1 ए) के लिए टेप की एक अलग रंग का उपयोग करें.
- अंतर इलेक्ट्रोड एक साथ, दो इंच छोड़ने के दो ट्विस्ट दूसरे छोर पर एक छोर और 1 इंच पर untwisted. अंतर इलेक्ट्रोड के शेष जोड़ी (चित्रा 1 बी) के साथ दोहराएँ.
- दो अंतर इलेक्ट्रोड के दोनों सेट के साथ ट्विस्ट, यकीन है कि समाप्त होता है untwisted रहना. इलेक्ट्रोड विधानसभा पकड़ो और चार अंतर इलेक्ट्रोड के जंक्शन पर घरेलू सिलिकॉन गोंद लागू करने के लिए, समाप्त होता है मुक्त छोड़ने. रुको और गोंद कम से कम 4 घंटे के लिए (चित्रा 1C) शुष्क करने की अनुमति.
- शाखाओं बचाने के लिए, इलेक्ट्रोड विधानसभा रखना नीचे एक फ्लैट, चल सतह पर लकड़ी के इस तरह के एक टुकड़ा. फैन बाहर समाप्त होता है और उन्हें टेप के साथ सुरक्षित. यह शाखाओं से पहले सिर्फ इलेक्ट्रोड विधानसभा, तरक्की और सुरक्षित है कि टेप के साथ प्लास्टिक का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करें.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप, सिलिकॉन गोंद के साथ शाखाओं कोट संदंश का उपयोग करें. 1 इंच लंबे समय समाप्त होता है जानवर के अंदर हो सकता है, तो वे गोंद की एक बहुत पतली कोट होना चाहिए. गोंद कम से कम 3 घंटे के लिए सूखी करने के लिए अनुमति दें.
- दो सेंटीमीटर करने के लिए एक अंतर इलेक्ट्रोड के 1 इंच लंबे अंत छोटा. प्रत्येक तार पर, सिलिकॉन और तामचीनी के 1cm हटा दें. रिकॉर्डिंग के लिए एक हुक में एक नंगे तार कर्ल. अन्य तार ऊपर बेंड और हुक से दूर, इस जमीन तार के रूप में सेवा करेंगे. शेष तीन इलेक्ट्रोड के लिए दोहराएँ.
- 2 इंच के अंत पर चार इलेक्ट्रोड का चयन करें. सिलिकॉन परिमार्जन और बंद तामचीनी, 2 तारों के प्रत्येक पर नंगे स्टेनलेस स्टील के तार के 1cm उजागर संदंश का प्रयोग करें. मिलाप दो तारों में से प्रत्येक के लिए एक सोने संबंधक. प्रयोगशाला टेप का एक टुकड़ा का उपयोग करने के लिए अंत सुरक्षित है और जमीन और रिकॉर्डिंग पिन के बीच एक अलगाव बनाए रखने के लिए. शेष तीन इलेक्ट्रोड के लिए दोहराएँ.
- केबल के लिए 1-2cm सिलिकॉन गोंद की एक गेंद संलग्न, के बारे में हुक अंत से 1.5 इंच जानवर भीतर इलेक्ट्रोड लंगर के लिए. कम से कम एक घंटे (चित्रा 1D) के लिए शुष्क करने की अनुमति दें.
1 चित्रा इलेक्ट्रोड विधानसभा निर्माण. (ए) एकल अंतर इलेक्ट्रोड अपने टेप के साथ सुरक्षित के साथ समाप्त होता है एक जोड़ और मुड़ तार से मिलकर. (बी) के दो अंतर इलेक्ट्रोड के साथ मुड़, सिरों पर untwisted जगह छोड़कर. अलग अलग रंग टेप या दूसरे अंकन समाप्त होता है की पहचान करने के लिए किया जाना चाहिए. (सी) सभी चार अंतर इलेक्ट्रोड एक एकल इलेक्ट्रोड विधानसभा प्रत्येक के अंत पर व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड के अलग - अलग शाखाओं, टेप के विशिष्ट रंग के साथ चिह्नित के साथ एक एकल केबल के गठन में संयुक्त. (डी) इलेक्ट्रोड विधानसभा के अंतिम रूप में. बाएँ पर, रिकॉर्डिंग और प्रत्येक अंतर इलेक्ट्रोड के लिए जमीन तारों के लिए हुक कर्ल करवाने हैं. सही पर, सोने संबंधक पिन एम्पलीफायर को कनेक्शन के लिए किया गया है तारों को soldered. सिलिकॉन गोंद का एक प्रस्तोता गेंद भी विधानसभा के बाईं ओर की ओर रखा गया है.
2. पशु के आरोपण के लिए तैयार
- एक स्वस्थ पशु है कि बारे में 350 450g वजन का चयन करें. समुद्री शैवाल के छोटे टुकड़े करने के लिए प्रतिक्रिया में, जानवर के बीच 3 से 5 सेकंड के अंतराल पर काटने उत्पन्न करनी चाहिए. इलेक्ट्रोड आरोपण के साथ पूरा सर्जरी एक घंटे के बारे में लेना चाहिए.
- जानवर anesthetize करने के लिए, यह 30% w / ध् isotonic MgCl 2 के साथ इंजेक्षन. Hemolymph और MgCl 2 के नुकसान को रोकने के इंजेक्शन साइट सुई को हटाने से पहले superglue में लेपित किया जा सकता है.
चित्रा 2 योजनाबद्ध आरेख, दिखा कैसे जानवर इलेक्ट्रोड आरोपण के लिए टिकी है और चीरा के स्थान (एक बार द्वारा इंगित) . - Anesthetized जानवर अपने पैर के साथ एक विच्छेदन नीचे ट्रे में बाहर लेटाओ. पशु सिर का सामना करना पड़ पर, आपके छोड़ दिया जैसे गिल क्षेत्र शिफ्ट कि जानवर अपने पक्ष पर आंशिक रूप से है, दूर झुकाव. नीचे पूर्वकाल जाल (चित्रा 2) पिन.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर ट्रे प्लेस. के बारे में एक 20 डिग्री के कोण पर ट्रे प्रोप सिर तरक्की और पूंछ में hemolymph इकट्ठा, चीरा से दूर.
- विच्छेदन कैंची का प्रयोग, एक चीरा थोड़ा eyespot के अपने अधिकार के लिए और शुरू 1.5cm के लिए यह एक पूर्व से विस्तार. ट्रे के किनारों से जुड़ी चीरा खुला पकड़ retractors (; eyespot संकेत चीरा के निकट नोट पट्टी चित्रा 2) का उपयोग करें.
- मुख जन को बेनकाब करने के लिए, संदंश का उपयोग करने के लिए नीचे स्पष्ट झिल्ली लिफ्टत्वचा और उपयोग कैंची एक मुख्य चीरा मिलान खोलने में कटौती करने के लिए. Retractors में झिल्ली के किनारों टक.
3. इलेक्ट्रोड आरोपण
- Micromanipulator पर इलेक्ट्रोड विधानसभा प्लेस और यह जानवर चीरा पर चलते हैं.
- radular तंत्रिका सबसे का उपयोग करने के लिए मुश्किल है, और पहले से संपर्क किया जाना चाहिए. वहाँ radular तंत्रिका तक पहुँचने के लिए दो विकल्प हैं.
- पहला विकल्प है, जो बेहतर है BN1 और BN2 के बीच मुख नाड़ीग्रन्थि के अंतर्गत लग रहा है. यदि radular तंत्रिका की एक शाखा दिखाई देता है, ठीक - इत्तला दे दी संदंश का उपयोग तुला एक हुक में बाहर शाखा लिफ्ट (चित्रा 3, 1 लेबल नाड़ीग्रन्थि के तहत आर.एन. के पाश).
- यदि radular तंत्रिका की एक शाखा मांसपेशियों ऊपर सुलभ नहीं है, एक दूसरा विकल्प यह I2 में एक छोटा सा चीरा मुख नाड़ीग्रन्थि (3 2 लेबल मांसपेशियों के नीचे, चित्रा आर.एन.) के आधार पर संयोजी ऊतक करने के लिए अगले के माध्यम से पहुँच है. I2 में चीरा I2 मांसपेशियों की दो परतों के माध्यम से जाना चाहिए. सीधे संदंश के साथ मांसपेशियों चीरा के किनारे पर पकड़ो और कांटे की शकल संदंश का उपयोग करने के लिए एक आर.एन. शाखा बाहर खींच.
- जबकि कांटे की शकल संदंश के साथ तंत्रिका पकड़े, संदंश का एक अलग सेट का उपयोग करने के लिए तंत्रिका पर इलेक्ट्रोड हुक में हेरफेर.
- Micromanipulator प्रयोग हुक बढ़ाने इतना है कि तंत्रिका मुख जन से दूर ऊपर उठा लिया है और किसी अन्य नसों या ऊतक के स्पष्ट है. तंत्रिका overstretch मत करो.
- एक सिरिंज के साथ अधिक तरल पदार्थ से दूर एक किम पोछो या चूषण का उपयोग कर इलेक्ट्रोड सूखी. जल तनाव पर ही पतन तंत्रिका, या एक पानी की मुहर तंत्रिका के तहत फार्म पैदा कर सकता है. या तो मामले में, इस क्षेत्र को पूरी तरह से पहले गोंद लागू किया जाता है सूख चाहिए.
- Superglue की एक छोटी थपका लागू जहां हुक के आधार तंत्रिका के नीचे के साथ संपर्क में है. Aplysia खारा या hemolymph की एक बूंद के लिए superglue सेट लागू करें. जब गोंद गीला कुछ भी नहीं के रूप में स्थानांतरित किया जाना चाहिए तार और तंत्रिका के बीच हो रही गोंद बिजली कनेक्शन ब्लॉक होगा.
- हुक को फिर से सूखी. मिक्स Kwik - एसआईएल एक आइस पैक पर गोंद.
- Kwik - एसआईएल गोंद की एक छोटी राशि लागू करने के लिए एक पिन की नोक, पूरी तरह से हुक के किसी भी उजागर तार को कवर, जमीन तार नहीं है, लेकिन का उपयोग करें.
- गोंद के बारे में 5 मिनट के लिए सेट करने के लिए, गोंद readjusting अगर यह हुक के वर्गों से दूर खींचती दें. गोंद जब यह अब चिपक जाती है जब पिन के साथ छुआ है (चित्रा 4 अंतिम विन्यास से पता चलता है) के लिए सेट कर दिया जाता है.
- एक बार radular तंत्रिका इलेक्ट्रोड सेट कर दिया जाता है, I2 मांसपेशियों तक पहुँचा जा सकता है. BN1 और BN2 के बीच क्षेत्र में हुक करने के लिए कांटे की शकल संदंश का उपयोग करें और पेशी के बाकी हिस्सों से धीरे बैंड ऊपर की तरफ खींच कर अलग I2 मांसपेशियों के 2 बैंड. उसी प्रक्रिया का उपयोग कर इलेक्ट्रोड संलग्न.
- मुख 2 और 3 नसों को आसानी से पहुँचा रहे हैं और इलेक्ट्रोड एक ही प्रक्रिया के साथ जुड़े होते हैं.
- एक बार सभी इलेक्ट्रोड संलग्न हैं, सिलिकॉन लंगर जानवर में इलेक्ट्रोड विधानसभा स्लाइड.
- सीवन चीरा उभड़नेवाला इलेक्ट्रोड केबल के आसपास बंद कर दिया, जानवर अंदर लंगर रखने. टांके superglue के लिए एक अच्छा मुहर सुनिश्चित.
- स्टायरोफोम की एक छोटी सी ब्लॉक में इलेक्ट्रोड के दूसरे छोर पर सोने संबंधक युक्तियाँ डालें. वसूली रात भर के लिए एक वातित अलग कंटेनर में मुख्य टैंक के लिए जानवरों की वापसी.
चित्रा 3. Aplysia खिला मुख मास के रूप में जाना जाता तंत्र के एक चित्र. दिखाया मुख नसों (BN1, BN2 BN3), radular तंत्रिका (आर एन) कि बाहर निकलता है मुख नाड़ीग्रन्थि के नीचे, तो मांसपेशियों के नीचे डालता है, और जहां इलेक्ट्रोड संलग्न है I2 मांसपेशियों स्थान पर हैं.
चित्रा 4 एकल एक तंत्रिका करने के लिए संलग्न (या मांसपेशी) और जगह में सरेस से जोड़ा हुआ इलेक्ट्रोड के योजनाबद्ध आरेख. ध्यान दें कि कर्ल करवाने हुक के डी अछूता क्षेत्र तंत्रिका (या मांसपेशी), superglue के साथ जगह में लंगर के साथ सीधे संपर्क में है, और विद्युत द्रव Kwik - एसआईएल का उपयोग कर के माध्यम से अछूता है. नोट भी है कि जमीन इलेक्ट्रोड की deinsulated टिप द्रव माध्यम से अवगत कराया है.
4. रिकॉर्डिंग
- एक वातित कंटेनर में पशु acclimate है जबकि कम से कम 1.5 घंटे के लिए रिकॉर्डिंग उपकरणों के लिए संलग्न. संकेत मॉनिटर सत्यापित करें कि सभी इलेक्ट्रोड और काम कर रहे हैं और हैं कि शोर के स्तर कम कर रहे हैं, जबकि पशु acclimating है.
- खिला व्यवहार रिकॉर्ड है, जबकि कंप्यूटर का उपयोग करने के लिए तंत्रिका और मांसपेशियों इलेक्ट्रोड से संकेत रिकॉर्ड एक वीडियो कैमरा का उपयोग. वीडियो और इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग एक वर्ग तरंग संकेत है कि कैमरे के दृश्य में एक डिजिटल काउंटर नियंत्रण, जबकि इसके साथ ही Axoscope में एक कंप्यूटर पर अतिरिक्त चैनल के रूप में दर्ज है का उपयोग सिंक्रनाइज़ करें.
- व्यवहार दूध पिलाने डी तकनीक के द्वारा हासिल कर रहे हैंमोर्टन और Chiel 1993 में मानते.
हालांकि पशुओं invertebrate एक संस्थागत जानवर का उपयोग करें और देखभाल समिति द्वारा औपचारिक मंजूरी की आवश्यकता नहीं है, हम यह सुनिश्चित किया है कि Aplysia के सभी उपचार नुकसान को कम करने और जानवरों को दुख, और सभी सर्जरी तकनीक कर रहे हैं जबकि जानवर पूरी तरह से anesthetized है.
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 5 (ए) एक साथ एक मांसपेशी (चांदा I2 मांसपेशी) से चार चैनल रिकॉर्डिंग, और एक निगलने प्रतिक्रिया के दौरान तीन मुख नसों (radular तंत्रिका, आर.एन., मुख 2 तंत्रिका, BN2, और मुख तंत्रिका 3, BN3) से. . (बी) आज़ादी बर्ताव जानवर के साथ - साथ वीडियो रिकॉर्डिंग से एक अभी भी फ्रेम के रूप में यह एक precut समुद्री शैवाल (चौड़ाई में 0.5 सेमी) पट्टी है, जो सफेद बैंड के साथ 0.5 सेमी अंतराल पर चिह्नित किया गया है ताकि अपनी गतिविधियों को आसानी से के रूप में देखे जा सकते हैं निगल के रूप में जानवर फ़ीड.
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Discussion
एक महत्वपूर्ण नवीनता है कि इन रिकॉर्डिंग को सफल बना दिया है एक केबल में इलेक्ट्रोड के संयोजन है. दो इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग से पहले प्रयोग किया गया है, लेकिन चार व्यक्ति इलेक्ट्रोड के लिए विस्तार है कि अक्सर सामान्य भोजन आंदोलनों करने से जानवर रोका शल्य adhesions के गठन में हुई. एक केबल में इलेक्ट्रोड मेल जानवर है, जो बारी में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम कर देता है अंदर इलेक्ट्रोड के थोक को कम कर देता है और जानवर और अधिक आसानी से स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है.
इस प्रक्रिया के अन्य नवीन पहलू superglue और Kwik - एसआईएल के संयोजन तंत्रिका या मांसपेशी इलेक्ट्रोड संलग्न है. पहले, केवल superglue इस्तेमाल किया गया था, लेकिन दो glues के संयोजन और अधिक मज़बूती से काम करता है और कई दिनों superglue, जो के बारे में 3 दिन में टूट जाती है जब पानी के संपर्क में में की तुलना में अब पिछले कर सकते हैं.
हम पता चला है कि यह संभव है रिकॉर्डिंग या व्यक्तिगत पहचान न्यूरॉन्स के सेल शरीर से उत्तेजना के लिए बरकरार, बर्ताव पशुओं में बाह्य इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण [Warman और Chiel, 1995, लू एट अल, 2008] एकाधिक इलेक्ट्रोड तकनीक है कि हम इस पत्र में वर्णित है इस तरह से एक साथ रिकॉर्ड और चार अलग अलग पहचान न्यूरॉन्स, या न्यूरॉन्स, मांसपेशियों और नसों का एक संयोजन की गतिविधि में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम चार इलेक्ट्रोड के साथ किया गया है तकनीक का उपयोग करते हुए, लेकिन यह संभावना है कि यह कई अतिरिक्त इलेक्ट्रोड के लिए काम करेंगे. इसके अलावा, एक अप्रकाशित प्रयोग में इन इलेक्ट्रोड चूहे के pudental तंत्रिका से रिकॉर्ड इस्तेमाल किया गया, यह दर्शाता है कि इस तकनीक के पहलुओं हड्डीवाला जानवरों में और मानव में उपयोगी हो सकता है है.
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Acknowledgments
हम कृतज्ञता एनआईएच (NS047073 HJC) से समर्थन स्वीकार करते हैं. हम भी Kwik - एसआईएल, जो हमें यह हमारे आवेदन के लिए उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित के साथ उसे जल्दी प्रयोगों के लिए कैथरीन Kehl के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
