Summary
يوصف تقنية لزرع four
Abstract
التسجيل من الأعصاب والعضلات الرئيسية لل
Protocol
1. التصنيع الكهربائي
- لإنشاء قطب ، واستخدام المقص لقطع قطعة من المينا المغلفة سلك قطره 0.001 بوصة الفولاذ المقاوم للصدأ حوالي 2 أقدام طويلة. نعلق كرة صغيرة من المعجون على كل طرف من السلك ، سلك أضعاف في النصف ، وتدور في تاريخ لإنشاء زوج الملتوية ، ويسمى القطب التفاضلية.
- الشريط طرفي السلك لمنع الانهيار. جعل أقطاب الفرق الأربعة ، باستخدام لون مختلف من الشريط الكهربائي لكل الفرق لأغراض تحديد الهوية (الشكل 1A).
- مبرومة تطور اثنين من أقطاب الفرق معا ، وترك اثنين بوصة واحدة على نهاية و1 بوصة على الطرف الآخر. كرر مع زوج من الأقطاب الكهربائية الفرق المتبقية (1B الشكل).
- تطور هاتين المجموعتين من أقطاب الفرق اثنين معا ، والتأكد من أن ينتهي تبقى مبرومة. تصمد التجميع الكهربائية والمنزلية تطبيق الغراء سيليكون عند تقاطع الأقطاب الفرق الأربعة ، ترك نهايات الخطوط. شنق والسماح ليجف الغراء لمدة لا تقل عن 4 ساعات (الشكل 1C).
- لعزل الفروع ، ووضع التجمع الكهربائي باستمرار على شقة ، والسطح ، ومنقولة مثل قطعة من الخشب. مروحة من الغايات وتأمينها مع الشريط. استخدام قطعة صغيرة من البلاستيك لرفع التجمع الكهربائي فقط قبل أن الفروع ، وآمن انه مع الشريط.
- في مجهر تشريح ، واستخدام ملقط لمعطف فروع الغراء مع السيليكون. وسوف ينتهي 1 بوصة طويلة تكون داخل الحيوان ، ولذلك ينبغي أن يكون طبقة رقيقة جدا من الصمغ. السماح للالغراء لتجف لمدة لا تقل عن 3 ساعات.
- تقصير نهاية 1 بوصة طويلة من القطب الفرق 1-2 سنتيمترات. على كل الأسلاك ، وإزالة 1cm من السيليكون والمينا. حليقة أحد الأسلاك العارية في ربط للتسجيل. ثني الأسلاك الأخرى وحتى بعيدا من ورطتها ، وهذا سيكون بمثابة الأسلاك الارض. تكرار للأقطاب الثلاثة المتبقية.
- حدد أحد الأقطاب الأربعة في نهاية 2 بوصة. استخدام ملقط لكشط قبالة السيليكون والمينا ، وفضح 1cm العارية من الفولاذ المقاوم للصدأ على كل من أسلاك 2. لحام الذهب موصل إلى كل من السلكين. استخدام قطعة من الشريط لتأمين مختبر النهاية والحفاظ على المسافة الفاصلة بين الأرض ودبابيس التسجيل. تكرار للأقطاب الثلاثة المتبقية.
- إرفاق الكرة 1 - 2cm من الغراء سيليكون لكابل ، على بعد حوالى 1.5 بوصة من نهاية ربط لترسيخ الأقطاب داخل الحيوان. السماح لتجف لمدة ساعة على الأقل (1D الشكل).
الشكل 1. التصنيع الكهربائي الجمعية. (A) واحدة القطب الفرق التي تتألف من أسلاك مطوية والملتوية مع غاياتها المضمون مع الشريط. (ب) الملتوية أقطاب الفرق اثنين معا ، وترك مساحة في نهايات مبرومة. وينبغي استخدام الشريط أو وضع علامات ملونة مختلفة أخرى لتحديد الغايات. (ج) جميع أقطاب الفرق four دمجها في التجمع قطب واحد تشكيل كابل واحد مع فروع مستقلة من الأقطاب الكهربائية الفردية في كل نهاية ، التي تحمل ألوان متميزة من الشريط. (د) الشكل النهائي التجمع الكهربائي. على اليسار ، وهناك تسجيلات لكرة لولبية من السنانير والأسلاك الأرضية لكل الفرق الكهربائي. على اليمين ، وقد تم ملحوم دبابيس من ذهب للموصل الأسلاك للتوصيل مكبر للصوت. كما تم على الكرة رسو الغراء السيليكون توضع نحو الجانب الأيسر من التجمع.
2. إعداد الحيوانية للزراعة
- حدد حيوان الصحية التي تزن حوالي 450g - 350. ردا على قطع صغيرة من الأعشاب البحرية ، وينبغي أن تولد لدغات الحيوانات على فترات تتراوح بين 3 إلى 5 ثوان. وينبغي لعملية جراحية كاملة مع زرع قطب كهربائي يستغرق نحو ساعة.
- لتخدير الحيوانات ، وذلك مع ضخ 30 ٪ ث / ت 2 MgCl متساوي التوتر. لمنع فقدان الدملمف وMgCl 2 ، يمكن المغلفة في موقع الحقن superglue قبل إزالة الإبرة.
الشكل 2. رسم تخطيطي يظهر كيفية دبس الحيوان لزرع قطب كهربائي ، وموقع للشق (المشار إليها بواسطة شريط). - وضع تخدير الحيوان في علبة مع تشريح القدم إلى أسفل. يواجه رئيس الحيوانية ، والتحول إلى منطقة الخياشيم مثل يسارك أن هذا الحيوان هو جزئيا على جانبها ، ويميل بعيدا. دبوس باستمرار مخالب الأمامي (الشكل 2).
- مكان درج على مرحلة مجهر تشريح. دعم الدرج في زاوية 20 درجة تقريبا لرفع الرأس وجمع الدملمف في الذيل ، وبعيدا عن الشق.
- باستخدام مقص تشريح ، بدء شق قليلا إلى يمينك لبقعة العين وتمديده من 1 إلى 1.5cm الأمامية. استخدام الكامشات تعلق على حواف علبة لعقد فتح شق (الشكل 2 ؛ بار بالقرب علما شق بقعة العين تشير).
- لفضح الشامل الشدق ، استخدم ملقط لرفع واضحة تحت الغشاءالجلد واستخدام مقص لقطع فتح شق التصفح الرئيسية. شد حواف الغشاء في الكامشات.
3. زرع قطب كهربائي
- مكان التجميع الكهربائي على micromanipulator وتحريكه عبر شق الحيوان.
- العصب radular هو الأكثر صعوبة في الوصول ، وينبغي معالجتها أولا. هناك خياران للوصول إلى العصب radular.
- الخيار الأول ، وهو الأفضل ، هو أن ننظر تحت العقدة بين الشدق BN1 وBN2. إذا فرع من العصب radular مرئيا ، غرامة استخدام الملقط ذات الرؤوس منحنية الى ربط لاخراج لفرع (الشكل 3 ، حلقة من RN تحت العقدة المسماة 1).
- إذا فرع من العصب radular لا يمكن الوصول إليه أعلاه في العضلات ، والخيار الثاني هو الوصول إليه عن طريق شق صغير في I2 بجوار النسيج الضام في قاعدة العقدة الشدق (الشكل 3 ، RN تحت العضلات المسمى 2). يجب أن يكون في شق I2 تذهب من خلال طبقتين من العضلات I2. التمسك حافة شق العضلات مع ملقط على التوالي ، واستخدام الملقط لسحب مكلب بغصن RN.
- في حين عقد العصبية مع ملقط مدمن مخدرات ، واستخدام مجموعة مختلفة من ملقط لمعالجة ربط الكهربائي على العصب.
- استخدام micromanipulator لرفع هوك بحيث يتم رفع العصب حتى بعيدا عن الكتلة الشدق واضحة في أي الأعصاب أو الأنسجة. لا تنهك الأعصاب.
- تجفيف الكهربائي باستخدام كيم مسح أو شفط السوائل الزائدة قبالة مع حقنة. يمكن أن يسبب التوتر الماء عصب للانهيار على نفسه ، أو ختم الماء لتكوين تحت العصبية. في كلتا الحالتين ، يجب أن تكون المنطقة جافة تماما قبل تطبيق الغراء.
- تطبيق الداب صغيرة من حيث superglue قاعدة هوك على اتصال مع الجزء السفلي من العصبية. تطبيق قطرة من المياه المالحة أو Aplysia الدملمف لتعيين superglue. عندما الغراء هو شيء يجب أن يتم نقل الرطب حيث أن الحصول على الغراء بين الأسلاك وإحصار العصب الربط الكهربائي.
- تجفيف ربط مرة أخرى. مزيج كويك سيل الغراء ، على وضع كيس من الثلج.
- استخدام غيض من دبوس لتطبيق كمية صغيرة من الغراء ، كويك سيل ، التي تغطي تماما أي سلك مكشوف من ورطتها ، ولكن ليس السلك الأرض.
- السماح للالغراء لتعيين لنحو 5 دقائق ، وإعادة تعديل الغراء اذا ابتعدت عن أجزاء من ورطتها. تم تعيين الغراء عندما لم يعد العصي عندما تطرق مع دبوس (الشكل 4 يبين التكوين النهائي).
- حالما يتم تعيين القطب radular العصب ، ويمكن الوصول إلى العضلات I2. في المنطقة الواقعة بين BN1 وBN2 ، استخدم ملقط مكلب ربط وفصل 2 عصابات عضلة I2 عن باقي العضلات عن طريق سحب بلطف صعودا العصابات. إرفاق الكهربائي باستخدام نفس الإجراء.
- يتم الوصول إليها بسهولة الأعصاب الشدق 2 و 3 ، وترفق مع أقطاب نفس الإجراء.
- مرة واحدة فقط هي التي تعلق الأقطاب ، الشريحة التجميع الكهربائي في الحيوان حتى مرساة السيليكون.
- خياطة الفتحة مغلقة حول كابل كهربائي جاحظ ، والحفاظ على الربط داخل الحيوان. Superglue الغرز لضمان ختم جيدة.
- إدراج نصائح موصل الذهبية في الطرف الآخر من القطب الى كتلة صغيرة من الراتنج. عودة الحيوان إلى الخزان الرئيسي في حاوية العزلة الهوائية ليلة وضحاها الانتعاش.
الشكل 3. رسم تخطيطي لجهاز تغذية Aplysia المعروفة باسم كتلة الشدق. أظهرت هي الأعصاب الشدق (BN1 ، BN2 ، BN3) ، العصب radular (RN) أن يخرج من أسفل العقدة الشدق ، ثم يغرق تحت العضلات ، والموقع على العضلات I2 حيث يعلق القطب.
الشكل 4. رسم تخطيطي للقطب واحد يعلق على العصب (أو العضلات) ولصقها في المكان. علما ان المنطقة دي معزول من كرة لولبية من ورطتها في اتصال مباشر مع العصب (أو العضلات) التي ترسو في مكان مع superglue ، ومعزولة كهربائيا من المتوسط السائل باستخدام كويك السيل. نلاحظ أيضا أن ما يتعرض له من طرف deinsulated القطب الأرض إلى المتوسطة السوائل.
4. تسجيل
- يتأقلم هذا الحيوان في وعاء الهوائية بينما تعلق على معدات لتسجيل ما لا يقل عن 1.5 ساعة. رصد إشارة بينما الحيوان هو التأقلم للتحقق من أن جميع أقطاب يعملون وأن مستويات الضوضاء المنخفضة.
- استخدام كاميرا فيديو لتسجيل سلوك التغذية أثناء استخدام جهاز الكمبيوتر لتسجيل الاشارات العصبية من الأقطاب والعضلات. مزامنة الفيديو والتسجيلات الكهربائي باستخدام إشارة الموجة التي تسيطر على الساحة الرقمية في عداد عرض الكاميرا في حين سجلت في نفس الوقت على أنها قناة إضافية على الكمبيوتر في Axoscope.
- التغذية والسلوكيات التي تسببها التقنيات ديscribed في مورتون وChiel 1993.
على الرغم من الحيوانات اللافقارية لا تتطلب موافقة رسمية من قبل المؤسسات واستخدام الحيوانات لجنة الرعاية ، ولقد تأكدنا من أن كل العلاجات من Aplysia تقليل الضرر والمعاناة على الحيوان ، والتي تتم كل التقنيات الجراحية في حين أن الحيوان هو تخدير كامل.
ممثل النتائج
الشكل 5 : (أ) في وقت واحد وأربعة من تسجيلات قناة العضلات (العضلات منقلة I2) ، وأعصاب من ثلاثة الشدق (العصب radular ، RN ، الشدق العصب 2 ، BN2 ، والعصبية الشدق 3 ، BN3) خلال استجابة البلع. (ب) الإطار لا يزال من تسجيل فيديو في وقت واحد من الحيوانات تتصرف بحرية كما يبتلع الشريط قبل القطع الأعشاب البحرية (0.5 سم في العرض) ، والتي تميزت في فترات 0.5 سم مع شرائط بيضاء بحيث تحركاتها يمكن تصور بسهولة كما والأعلاف الحيوانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومن المبتكرات الرئيسية التي جعلت من هذه التسجيلات الناجحة هي التي تجمع بين الأقطاب في كابل واحد. وقد استخدمت تسجيلات القطب اثنين من قبل ، ولكن التوسع إلى أربعة أقطاب الفردية أسفرت عن تشكيل الالتصاقات الجراحية التي كثيرا ما تمنع الحيوان من صنع الحركات التغذية الطبيعية. الجمع بين الأقطاب في كابل واحد يقلل من الجزء الأكبر من أقطاب داخل الحيوان ، وهذا بدوره يقلل من رد الفعل المناعي للحيوان ، ويسمح لمزيد من التحرك بحرية.
على الجانب الآخر مبتكرة من هذا الإجراء هو مزيج من Superglue وكويك سيل إلى نعلق الأقطاب في العصب أو العضلة. سابقا ، كانت تستخدم Superglue فحسب ، بل مزيج من المواد اللاصقة عملين أكثر موثوقية ويمكن أن تستمر عدة أيام أطول من Superglue ، الذي ينهار في حوالي 3 أيام عند تعرضها للماء.
أظهرنا أنه من الممكن زرع أقطاب كهربائية في الحيوانات خارج الخلية ، يتصرف سليمة لتسجيل أو التحفيز من أجسام الخلايا العصبية الفردية المحددة [Warman وChiel ، 1995 ؛ لو وآخرون ، 2008]. وبالتالي يمكن للتقنية متعددة القطب التي وصفناها في هذه الورقة يمكن استخدامها لتسجيل واحد من ومعالجتها بنشاط الخلايا العصبية المختلفة الأربعة المحددة ، أو مزيج من العضلات والخلايا العصبية والأعصاب.
لقد تم استخدام هذا الاسلوب مع أربعة أقطاب ، ولكن من المرجح أنها ستعمل على أقطاب كهربائية إضافية عديدة. علاوة على ذلك ، في تجربة غير منشورة ، واستخدمت هذه الأقطاب لتسجيل من العصب الفرجية من الفئران ، مما يشير إلى أن بعض جوانب هذه التقنية قد تكون مفيدة في الحيوانات الفقارية والبشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نحن نعترف بامتنان الدعم من المعاهد الوطنية للصحة (لمجلس القضاء الأعلى NS047073). ونحن ممتنون لكيهل كاترين لتجاربها في وقت مبكر مع كويك السيل ، والذي شجعنا على استخدامه لطلبنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
