Summary
Een techniek is beschreven voor het implanteren van vier
Abstract
Het opnemen van belangrijke zenuwen en spieren van de
Protocol
1. Electrode Fabrication
- Voor het maken van de elektrode, gebruik van een schaar om een stuk van de email-coating 0,001 inch diameter roestvrij staaldraad ongeveer 2 meter lang snijden. Bevestig een kleine bal van stopverf aan elk uiteinde van de draad, vouw de draad in de helft, en draai de uiteinden om een twisted pair te creëren, een zogenaamde differentieel elektrode.
- Tape de beide uiteinden van de draad te ontrafelen voorkomen. Maak vier differentiële elektroden, het gebruik van een andere kleur van de tape voor elke differentiële elektrode voor identificatie (Figuur 1A).
- Twist twee van de differentiële elektroden bij elkaar, waardoor er twee centimeter getwist aan de ene kant en 1 cm aan de andere kant. Herhaal dit met de resterende paar van differentiële elektroden (figuur 1B).
- Samen Twist beide sets van twee differentiële elektroden, en zorg ervoor dat de uiteinden nog getwist. Houden de elektrode in de montage en toe te passen huishoudelijke siliconen lijm op de kruising van de vier differentieel elektroden, zodat de uiteinden vrij. Hang en laat de lijm drogen minstens 4 uur (figuur 1C).
- Te isoleren van de takken, leg de elektrode montage op een plat, beweegbaar, oppervlak, een stuk hout. Ventilator uit de uiteinden en zet ze met tape. Gebruik een klein stukje plastic om de elektrode montage verheffen vlak voor takken, en dat met tape veilig te stellen.
- Op een dissectiemicroscoop een tang om de vacht van de takken met siliconen lijm. De 1-inch lange uiteinden zullen worden in het dier, dus ze moeten een zeer dunne laag lijm hebben. Laat de lijm drogen gedurende minstens 3 uur.
- Verkorten van de 1-inch lange uiteinde van een differentieel elektrode tot twee centimeter. Op elke draad, verwijder dan 1 cm van siliconen en email. Curl een blote draad in een haak voor opname. Buig de andere draad omhoog en weg van de haak, deze zal dienen als de aarddraad. Herhaal dit voor de resterende drie elektroden.
- Selecteer een van de vier elektroden op het 2 inch einde. Gebruik een tang om siliconen schrapen en uit glazuur, het blootstellen van 1 cm van de blote roestvrij staaldraad op elk van de twee draden. Soldeer een gouden connector aan elk van de twee draden. Gebruik een stukje plakband lab aan het einde een veilige en een scheiding tussen de grond en het opnemen van pinnen te houden. Herhaal dit voor de resterende drie elektroden.
- Bevestig een 1-2cm bal van de siliconen lijm op de kabel, ongeveer 1,5 centimeter van de haak einde aan de elektroden verankeren binnen het dier. Laten drogen ten minste een uur (figuur 1D).
Figuur 1. Elektrodesamenstellen Fabrication. (A) Single differentieel elektrode bestaande uit een gevouwen en gedraaide draad met de uiteinden vastgezet met tape. (B) Twee differentieel elektroden elkaar gedraaide, waardoor er niet getwist ruimte aan de uiteinden. Verschillende kleuren tape of een andere markering moet worden gebruikt om de uiteinden te identificeren. (C) Alle vier differentieel elektroden gecombineerd in een enkele elektrode montage vormt een enkele kabel met aparte takken van de afzonderlijke elektroden op elk uiteinde, gemarkeerd met verschillende kleuren van de tape. (D) definitieve vorm van de elektrode montage. Aan de linkerkant, zijn er gekruld haken voor opnames en de grond draden voor elk differentieel elektrode. Aan de rechterkant, hebben gouden connector pinnen is gesoldeerd aan de kabels voor aansluiting op de versterker. Een verankering bal van siliconen lijm is ook geplaatst naar de linkerkant van de montage.
2. De voorbereiding van Animal voor implantatie
- Selecteer een gezond dier dat weegt ongeveer 350-450g. In reactie op kleine stukjes van zeewier, moet het dier te genereren bijt met intervallen van tussen de 3 tot 5 seconden. De complete operatie met elektrode implantatie duurt ongeveer een uur.
- Om het dier verdoven, te injecteren met 30% w / v isotone MgCl 2. Om te voorkomen dat het verlies van hemolymfe en MgCl 2, kan de plaats van injectie worden gecoat in superlijm voordat u de naald.
Figuur 2. Schematische weergave van hoe het dier is gespeld voor de elektrode implantatie, en de locatie van de incisie (aangegeven met een bar). - Leg de verdoofde dier in een dissectie bakje met haar voet naar beneden. Tegenover het dier hoofd op, verschuiving van de kieuw gebied aan uw linkerhand zodanig dat het dier is gedeeltelijk op zijn kant, leunend weg. Vastpinnen de voorste tentakels (figuur 2).
- Plaats de lade op het podium van een dissectiemicroscoop. Het faillissement van de lade op ongeveer een 20 graden hoek naar het hoofd verheffen en de hemolymfe in de staart te verzamelen, weg van de incisie.
- Met behulp van dissectie schaar, lichtjes beginnen een incisie aan uw rechterkant van de Eyespot en uit te breiden tot een 1,5 cm naar voren. Gebruik retractors aan de randen van de lade om de incisie open te houden (zie figuur 2; opmerking bar bij Eyespot aangeeft incisie).
- Bloot te leggen van de buccale massa, een tang om het heldere membraan eronder liftde huid en te gebruiken schaar om een opening die overeenkomen met de belangrijkste incisie te snijden. Tuck de randen van het membraan in de oprolmechanismen.
3. Electrode Implantatie
- Plaats de elektrode montage op een micromanipulator en verplaats het over incisie van het dier.
- De radular zenuw is het meest moeilijk te bereiken, en moet eerst worden benaderd. Er zijn twee opties voor toegang tot de radular zenuw.
- De eerste optie, die de voorkeur verdient, is om te kijken onder de buccale ganglion tussen BN1 en BN2. Als er een tak van de radular zenuw zichtbaar is, gebruik fijne punt pincet gebogen in een haak op te tillen uit de tak (figuur 3, lus van RN onder ganglion label 1).
- Als er een tak van de radular zenuw is niet toegankelijk boven de spier, een tweede optie is om toegang te krijgen via een kleine incisie in I2 naast het bindweefsel aan de voet van de buccale ganglion (figuur 3, RN onder spier label 2). De incisie in I2 moet gaan door middel van twee lagen van het I2 spier. Vasthouden aan de rand van de spier incisie met rechte tang en gebruik de tang verslaafd te trekken uit een RN tak.
- Terwijl u de zenuw met de aangesloten tang, gebruik dan een andere set van een tang om de elektrode haken op de zenuwen te manipuleren.
- Gebruik de micromanipulator aan de haak te verhogen, zodat de zenuw wordt opgetild uit de buurt van de buccale massa en duidelijk van andere zenuwen of weefsel. Niet uitrekken van de zenuw.
- Droog de elektrode met behulp van een Kim-wipe of zuig de overtollige vloeistof met een spuit. Water spanning kan de zenuw te storten op zichzelf, of een waterslot te vormen onder de zenuw. In beide gevallen moet het gebied volledig worden gedroogd alvorens lijm wordt toegepast.
- Breng een kleine schar van superlijm, waar de basis van de haak is in contact met de bodem van de zenuw. Breng een druppel Aplysia zoutoplossing of hemolymfe naar de secondelijm in te stellen. Als de lijm nat is er niets moet worden verplaatst als het krijgen van lijm tussen de draad en zenuw zou blokkeren de elektrische aansluiting.
- Weer droog de haak. Mix Kwik-Sil lijm op een ice-pack.
- Gebruik de punt van een pen om een kleine hoeveelheid van de Kwik-Sil lijm toe te passen, volledig bedekt alle blootgestelde draad van de haak, maar niet de aarde draad.
- Laat de lijm op te zetten voor ongeveer 5 minuten, bijstelling van de lijm als deze trekt weg van delen van de haak. De lijm wordt ingesteld als het niet meer plakt bij aanraking met de pen (Figuur 4 toont de uiteindelijke configuratie).
- Zodra de radular zenuw elektrode is ingesteld, kan de I2 spier worden benaderd. In het gebied tussen BN1 en BN2, gebruikt u de aangesloten tang te haken en om twee banden van de I2 spier te scheiden van de rest van de spier door zachtjes te trekken de banden omhoog. Bevestig de elektrode volgens dezelfde procedure.
- Buccale zenuwen 2 en 3 zijn gemakkelijk toegankelijk en elektroden zijn bevestigd met dezelfde procedure.
- Als alle elektroden zijn bevestigd, schuift u de elektrode assemblage in het dier tot aan de siliconen anker.
- Suture de incisie gesloten rond de uitstekende elektrode-kabel, waardoor het anker in het dier. Superlijm de steken om een goede afdichting te garanderen.
- Steek de gouden connector tips op het andere uiteinde van de elektrode in een kleine blok van piepschuim. Ga terug het dier naar de hoofdtank in een belucht isolatie container voor het herstel 's nachts.
Figuur 3. Een schematische voorstelling van de Aplysia voedselopname-apparaat bekend als de buccale massa. Getoond worden de buccale zenuwen (BN1, BN2, BN3), de radular zenuw (RN), die uit de bodem van de buccale ganglion, dan duikt onder de spier, en de locatie op de I2 spier waar de elektrode is aangesloten.
Figuur 4. Schematische weergave van een elektrode bevestigd aan een zenuw (of spier) en gelijmd op hun plaats. Merk op dat de de-geïsoleerde regio van de gekrulde haak is in direct contact met de zenuw (of spier), verankerd op zijn plaats met superlijm, en elektrisch geïsoleerd van het vloeibaar medium met behulp van Kwik-Sil. Merk ook op dat de deinsulated tip van de massa-elektrode is blootgesteld aan de vloeistof medium.
4. Opname
- Wennen de dieren in een container belucht hij is aangesloten om de opname apparatuur voor minimaal 1,5 uur. Monitor van het signaal, terwijl het dier acclimatiseren om te controleren of alle elektroden werken en dat het geluidsniveau laag zijn.
- Gebruik een videocamera om eetgedrag te nemen tijdens het gebruik van de computer naar signalen van de neurale en gespierd elektroden op te nemen. Synchroniseer de video-en elektrode-opnamen met behulp van een blokgolf signaal dat een digitaal loket in de camera te bekijken controles, terwijl er tegelijkertijd wordt opgenomen als een extra kanaal op de computer in Axoscope.
- Feeding gedrag wordt uitgelokt door de technieken die debeschreven in Morton en Chiel 1993.
Hoewel ongewervelde dieren geen formele goedkeuring van een institutioneel gebruik van dieren en zorg commissie, hebben we ervoor gezorgd dat alle behandelingen van Aplysia schade te minimaliseren en lijden van het dier, en dat alle chirurgische technieken worden uitgevoerd terwijl het dier volledig verdoofd.
Representatieve resultaten
Figuur 5. (A) Gelijktijdig vier kanaals recording van een spier (de gradenboog spier I2), en van drie buccale zenuwen (de radular zenuw, RN, buccale zenuw 2, BN2 en buccaal zenuw 3, BN3) tijdens een slikken reactie. (B) Een stilstaand beeld uit de gelijktijdige video-opname van de vrij te gedragen dier als hij slikt een voorgesneden zeewier strip (0,5 cm breed), die is gemarkeerd op 0,5 cm intervallen met witte banden, zodat de bewegingen gemakkelijk gevisualiseerd als Het dier voedt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een belangrijke innovatie die heeft deze opnames succesvol is het combineren van de elektroden in een kabel. Twee elektrode opnames zijn gebruikt geweest, maar uitbreiding naar vier afzonderlijke elektroden resulteerde in de vorming van chirurgische adhesies die vaak het dier voorkomen van het maken van normale voeding bewegingen. Het combineren van de elektroden in een kabel vermindert het grootste deel van de elektroden in het dier, dat op zijn beurt vermindert de immuunrespons en laat het dier te bewegen vrijer.
Het andere vernieuwende aspect van deze procedure is de combinatie van Superglue en Kwik-Sil naar de elektroden hechten aan de zenuw of spier. Voorheen hadden alleen Superlijm is gebruikt, maar de combinatie van de twee lijmen werkt meer betrouwbaar en kan duren enkele dagen langer dan Superlijm, die afbreekt in ongeveer 3 dagen bij blootstelling aan water.
We hebben laten zien dat het mogelijk is om extracellulaire elektroden implantaat in intact, gedragen dieren voor opname of stimulatie van de cellichamen van de individuele geïdentificeerde neuronen [Warman en Chiel, 1995;. Lu et al., 2008]. De meervoudige elektrode techniek die we hebben beschreven in dit artikel kan dus worden gebruikt om gelijktijdig opnemen en manipuleren van de activiteit van de vier verschillende geïdentificeerde neuronen, of een combinatie van neuronen, spieren en zenuwen.
We zijn met behulp van de techniek met vier elektroden, maar het is waarschijnlijk dat het zou werken voor een aantal extra elektroden. Bovendien, in een niet-gepubliceerde experiment werden deze elektroden gebruikt voor het opnemen van de pudental zenuw van de rat, wat aangeeft dat aspecten van deze techniek kan nuttig zijn bij gewervelde dieren en bij mensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij dankbaar erkennen de steun van de NIH (NS047073 tot HJC). We zijn ook dankbaar dat Catherine Kehl voor haar vroege experimenten met Kwik-Sil, die moedigde ons aan om het te gebruiken voor onze applicatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
