Summary
A técnica é descrita para a implantação de quatro
Abstract
Gravar a partir de nervos e músculos da chave
Protocol
1. Fabricação de eletrodos
- Para criar o eletrodo, use a tesoura para cortar um pedaço do esmalte revestido polegadas de diâmetro do fio de aço inoxidável 0,001 a cerca de 2 metros de comprimento. Anexar uma pequena bola de massa em cada extremidade do fio, dobre o fio ao meio, e gire as pontas para criar um par trançado, chamado eletrodo diferencial.
- Fita ambas as extremidades do fio para evitar o desfiamento. Fazer quatro eletrodos diferenciais, usando uma cor diferente da fita para cada eletrodo diferencial para fins de identificação (Figura 1A).
- Torção dois dos eletrodos diferenciais juntos, deixando duas polegadas sem torção em uma extremidade e uma polegada na outra extremidade. Repita com o restante par de eletrodos diferenciais (Figura 1B).
- Torça os dois conjuntos de dois eletrodos diferenciais juntos, certificando-se que as extremidades permanecem sem torção. Segurar o conjunto de eletrodos e aplicar cola de silicone casa na junção de quatro eletrodos diferenciais, deixando as extremidades livres. Pendurar e permitir que a cola secar por pelo menos 4 horas (Figura 1C).
- Para isolar os ramos, coloque o conjunto de eletrodos para baixo em uma superfície plana, como móveis um pedaço de madeira. Espalham as pontas e prenda-os com fita adesiva. Use um pequeno pedaço de plástico para elevar o conjunto de eletrodos pouco antes de ramos, e seguro que, com fita.
- Em um microscópio de dissecação, utilize uma pinça para revestir os ramos com cola silicone. Os fins de 1 polegada tempo vai estar dentro do animal, para que eles devem ter uma camada muito fina de cola. Permitir que a cola secar por pelo menos 3 horas.
- Encurtar o fim de 1 centímetro de comprimento de um eletrodo diferencial a dois centímetros. Em cada fio, retire um centímetro de silicone e esmalte. Enrolar um fio desencapado em um gancho para a gravação. Dobre o outro fio para cima e longe do gancho, o que servirá de fio terra. Repita o procedimento para os restantes três eletrodos.
- Selecionar um dos quatro eletrodos na extremidade de 2 polegadas. Use uma pinça para raspar silicone e esmalte, expondo uma centímetros de fio de aço inoxidável nua em cada um dos dois fios. Conector de solda de ouro a cada um dos dois fios. Use um pedaço de fita de laboratório para garantir o fim e manter uma separação entre o solo e os pinos de gravação. Repita o procedimento para os restantes três eletrodos.
- Anexar uma bola de 1-2cm da cola de silicone para o cabo, cerca de 1,5 cm da extremidade do gancho para ancorar os eletrodos dentro do animal. Deixe secar por pelo menos uma hora (Figura 1D).
Figura 1. Fabricação Assembléia Electrode. (A) eletrodo único diferencial consiste de um fio dobrado e torcido, com suas extremidades presa com fita adesiva. (B) Dois eletrodos diferenciais torcidos juntos, deixando espaço sem torção nas extremidades. Fita de cor diferente ou outra marcação deve ser usado para identificar as extremidades. (C) Todos os eletrodos diferenciais quatro combinados em um único conjunto de eletrodos formando um único cabo, com filiais em separado dos eletrodos individuais em cada extremidade, marcados com cores distintas da fita. (D) a forma final da montagem do eletrodo. À esquerda, há enrolado ganchos para gravações e fios de aterramento para cada eletrodo diferencial. À direita, pinos de ouro foram soldados aos fios para conexão com o amplificador. Uma bola de ancoragem de cola de silicone também foi colocado para o lado esquerdo da assembléia.
2. Preparação de animais para Implantação
- Selecione um animal saudável, que pesa cerca de 350-450g. Em resposta a pequenos pedaços de algas, o animal deve gerar mordidas em intervalos de 3 a 5 segundos. A cirurgia completa com implante de eletrodos deve levar cerca de uma hora.
- Para anestesiar o animal, injetá-lo com 30% w / v isotônica MgCl 2. Para evitar a perda de hemolinfa e MgCl 2, o local da injeção podem ser revestidos em superglue antes de remover a agulha.
Figura 2. Diagrama esquemático mostrando como o animal é fixado para a implantação de eletrodos, ea localização da incisão (indicado por um bar). - Coloque o animal anestesiado em uma bandeja de dissecação com o seu pé para baixo. De frente para a cabeça de animal em diante, deslocar a área de emalhar para o tal esquerda que o animal é parcialmente de lado, se inclinando para longe. Pino para baixo os tentáculos anterior (Figura 2).
- Coloque a bandeja sobre o estágio de um microscópio de dissecação. Escorar a bandeja em um ângulo de 20 graus para elevar a cabeça e recolher o hemolinfa na cauda, longe da incisão.
- Com uma tesoura de dissecção, iniciar uma incisão ligeiramente para a direita do eyespot e estendê-lo 1 a 1,5 cm anteriormente. Use retratores anexado às bordas da bandeja para manter a incisão aberta (Figura 2; bar nota perto incisão eyespot indicando).
- Para expor a massa bucal, utilize uma pinça para levantar a membrana transparente por baixoa pele e use a tesoura para cortar uma abertura correspondente a incisão principal. Tuck as bordas da membrana para os afastadores.
3. Implantação de eléctrodos
- Coloque o conjunto do eletrodo em um micromanipulador e movê-lo ao longo da incisão do animal.
- O nervo radular é mais difícil acesso, e devem ser abordados em primeiro lugar. Existem duas opções para acessar o nervo radular.
- A primeira opção, que é preferível, é olhar sob o gânglio bucal entre BN1 e BN2. Se um ramo do nervo radular é visível, use uma pinça de ponta fina dobrado em um gancho para levantar o ramo (Figura 3, alça de RN sob gânglio rotulados 1).
- Se um ramo do nervo radular não é acessível acima do músculo, a segunda opção é para acessá-lo através de uma pequena incisão na I2 ao lado do tecido conjuntivo na base do gânglio vestibular (Figura 3, RN abaixo do músculo rotulados 2). A incisão na I2 deve passar por duas camadas de músculo I2. Segure a borda da incisão do músculo com uma pinça em linha reta e use a pinça para retirar enganchado um ramo RN.
- Enquanto mantém o nervo com a pinça viciado, use um conjunto diferente de uma pinça para manipular o gancho eletrodo para o nervo.
- Use o micromanipulador para levantar o gancho para que o nervo é levantado fora da massa bucal e desembaraçadas de quaisquer outros nervos ou tecido. Evite esticar o nervo.
- Seque o eletrodo usando um Kim-Wipe ou sucção fora o excesso de líquido com uma seringa. Tensão de água pode causar a coragem de colapso sobre si mesmo, ou um selo de água para formar com o nervo. Em ambos os casos, a área deve ser completamente seca antes de cola é aplicada.
- Aplique uma pequena bagatela de super cola onde a base do gancho entra em contato com a parte inferior do nervo. Aplique uma gota de solução salina ou Aplysia hemolinfa para definir a supercola. Quando a cola não é nada molhado deve ser movida como a obtenção de cola entre o fio eo nervo bloquearia a conexão elétrica.
- Seque o gancho novamente. Mix cola Kwik-Sil em um bloco de gelo.
- Use a ponta de um alfinete para aplicar uma pequena quantidade da cola Kwik-Sil, cobrindo completamente qualquer fio exposta do gancho, mas não o fio terra.
- Permitir a cola para definir por aproximadamente 5 minutos, reajustando a cola se afasta das seções do gancho. A cola é definida quando ele adere já não quando tocado com o pino (Figura 4 mostra a configuração final).
- Uma vez que o eletrodo nervo radular está definido, o músculo I2 pode ser acessado. Na área entre BN1 e BN2, use a pinça agarrado ao anzol e para separar duas bandas do músculo I2 do resto do músculo puxando para cima as bandas. Anexar o eletrodo usando o mesmo procedimento.
- Nervos bucal 2 e 3 são facilmente acessados e os eletrodos são fixados com o mesmo procedimento.
- Uma vez que todos os eletrodos são conectados, deslize o conjunto de eletrodos dentro do animal até a âncora silicone.
- Suturar a incisão fechada em torno do cabo eletrodo salientes, mantendo a âncora dentro do animal. Supercola os pontos para garantir uma boa vedação.
- Insira as pontas de conector de ouro na outra extremidade do eletrodo em um pequeno bloco de isopor. Devolver o animal para o tanque principal em um recipiente de isolamento aerado para pernoite de recuperação.
Figura 3. Um diagrama do aparelho de alimentação Aplysia conhecida como a massa bucal. Mostrados são os nervos bucal (BN1, BN2, BN3), o nervo radular (RN), que sai do fundo do gânglio vestibular, então mergulha abaixo do músculo, ea localização sobre o músculo I2 onde o eletrodo está conectado.
Figura 4. Esquema do eletrodo único anexado a um nervo (ou músculo) e colado no lugar. Note-se que a região de isolamento do gancho ondulado está em contato direto com o nervo (ou músculo), ancorado no lugar com supercola, e eletricamente isolados do meio fluido usando Kwik-Sil. Note também que a ponta do eletrodo deinsulated solo é exposto ao meio fluido.
4. Gravação
- Aclimatar o animal em um recipiente arejado quando estiver ligado ao equipamento de gravação de pelo menos 1,5 horas. Monitorar o sinal enquanto o animal está se aclimatando para verificar se todos os eletrodos estão funcionando e que os níveis de ruído são baixos.
- Use uma câmera de vídeo para registrar o comportamento alimentar durante o uso do computador para gravar sinais dos eletrodos neural e muscular. Sincronizar o vídeo e as gravações do eletrodo usando um sinal de onda quadrada que controla um contador digital na visualização da câmera enquanto é simultaneamente registrada como um canal adicional no computador Axoscope.
- Alimentação comportamentos são extraídas pelas técnicas dedescrito na Morton e Chiel 1993.
Embora os animais invertebrados não exigem aprovação formal por um uso de animais institucional e da comissão de cuidados, temos assegurado que todos os tratamentos de Aplysia minimizar os danos e sofrimento para o animal, e que todas as técnicas cirúrgicas são feitas enquanto o animal está totalmente anestesiado.
Resultados representante
Figura 5. (A) de quatro canais simultâneos gravações de um músculo (o músculo transferidor I2), e de três nervos bucal (o nervo radular, RN, bucal do nervo 2, BN2 e nervo bucal 3, BN3) durante uma resposta de deglutição. (B) Um quadro ainda da gravação de vídeo simultâneas do animal livremente se comportando como se engole uma tira de alga precut (0,5 cm de largura), que foi marcado em intervalos de 0,5 cm, com faixas brancas para que seus movimentos podem ser facilmente visualizados como o animal se alimenta.
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Discussion
A principal inovação que fez estas gravações de sucesso é a combinação dos eletrodos em um único cabo. Duas gravações eletrodo tem sido utilizado antes, mas expandindo para quatro eletrodos individuais resultou na formação de aderências cirúrgicas, que muitas vezes impediu o animal de fazer movimentos de alimentação normal. Combinando os eletrodos em um cabo reduz a maior parte dos eletrodos dentro do animal, que por sua vez reduz a resposta imune e permite que o animal se mover mais livremente.
O outro aspecto inovador deste processo é a combinação de Superglue e Kwik-Sil para prender os eletrodos no nervo ou músculo. Anteriormente, apenas Superglue tinha sido usado, mas a combinação das duas colas funciona de forma mais confiável e pode durar vários dias mais de Superglue, que decompõe em cerca de 3 dias, quando exposto à água.
Nós mostramos que é possível implantar eletrodos no extracelular intacta, os animais se comportando para a gravação ou a estimulação dos corpos celulares dos neurônios individuais identificados [Warman e Chiel, 1995;. Lu et al, 2008]. A técnica de eletrodos múltiplos que descrevemos neste trabalho poderiam ser utilizados ao mesmo tempo, gravar e manipular a atividade de quatro diferentes neurônios identificados, ou uma combinação de neurônios, músculos e nervos.
Temos vindo a utilizar a técnica com quatro eletrodos, mas é provável que ele iria trabalhar para vários eletrodos adicionais. Além disso, em um experimento inédito, esses eletrodos foram usados para gravar a partir do nervo pudendo do rato, o que indica que os aspectos desta técnica poderia ser útil em animais vertebrados e nos seres humanos.
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Acknowledgments
Agradecemos o apoio do NIH (NS047073 para HJC). Nós também somos gratos a Catherine Kehl para ela primeiras experiências com o Kwik-Sil, que nos incentivou a usá-lo para a nossa aplicação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
