マウス背根神経節凍結切片の手順

Summary

ここでは、高品質な後根神経節クライオスタット切片を安定的に取得するための開発を紹介します。

Abstract

高品質のマウス後根神経節(DRG)クライオスタット切片は、炎症性および神経因性疼痛、かゆみ、その他の末梢神経疾患の研究における適切な免疫化学染色およびRNAscope研究に不可欠です。しかし、DRG組織のサンプルサイズが小さいため、高品質で無傷かつ平坦なクライオスタット切片をスライドガラス上に一貫して取得することは依然として課題です。これまでのところ、DRG凍結切片の最適なプロトコルを説明した記事はありません。このプロトコルは、DRG凍結切片に関連する頻繁に遭遇する問題を解決するための段階的な方法を提示します。本稿では、DRG組織サンプルから周囲の液体を除去し、DRG切片をスライド上に同じ向きで配置し、スライドガラス上の切片を湾曲せずに平らにする方法を説明します。このプロトコルはDRGサンプルの凍結切片用に開発されましたが、サンプルサイズが小さい他の多くの組織の凍結切片にも適用できます。

Introduction

後根神経節(DRG)には、一次感覚ニューロン、組織マクロファージ、および一次感覚ニューロンを取り囲む衛星細胞が含まれています1,2,3,4。これは、無害で有害な信号を処理する際の重要な解剖学的構造であり、痛み、かゆみ、およびさまざまな末梢神経障害に重要な役割を果たします5,6,7,8,9,10,11,12,13。マウス脊髄からDRG組織を解剖する方法はいくつか開発されているが14,15,16、DRG組織は非常に小さく、DRG試料のクライオスタット切片はロール状に湾曲する傾向があり、クライオスタット切片をスライドガラス上に適切に移すことが困難であるため、DRG組織の凍結切片は依然として困難である。しかし、DRG組織の適切な凍結切片は、免疫組織化学研究とDRG感覚ニューロンの構造にとって非常に重要です17,18,19,20,21,22,23。さらに、単一細胞RNAシーケンシングの結果、ヒト²⁴とマウス²⁵の両方でDRG感覚ニューロンの顕著な不均一性が明らかになったため、DRG組織の適切な凍結切片は、さまざまな生理学的および病理学的状態におけるさまざまなDRG細胞の機能的役割を調査するために重要です。

組織透明化技術は、DRG凍結切片の代替技術として^DRG26 の3D再構成を調査するために適用されていますが、組織透明化技術は時間と労力がかかります。それに比べて、DRGの凍結切片は迅速かつ比較的簡単に実行できるため、DRGおよび中枢神経系の他の領域の免疫組織化学および構造研究にとって重要な技術であることに変わりはありません。しかし、DRGや特定の脳領域などの組織のサンプルサイズが小さいため、スライドガラス上に高品質で無傷の平らなクライオスタット切片を得ることは、神経科学研究における課題であり、マウスDRGなどの小さなサイズの組織サンプルを凍結切片化するための最適なプロトコルを現時点では説明していません。

このプロトコルは、マウスDRGのクライオスタット切片作成のための簡単なステップバイステップの手法を提供し、その後のDRG研究のためにスライド上の高品質のDRG切片をできるだけ多く確実に取得します。この手法は、DRGサンプルの凍結切片作成に特化して設計されていますが、小さなサンプルサイズで他のさまざまな組織の凍結切片化にも使用できる可能性があります。

Protocol

本研究では、動物実験はUCSFの動物実験委員会によって承認され、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドに従って実施されました。ここでは、成体8-12週齢のC57BL/6雄マウスおよび雌マウス(自家繁殖)を用いた。

1. DRGサンプル調製

1. マウスに2.5%アベルチンを麻酔します(材料表を参照)。痛みを伴う刺激に反応しないことで、適切な麻酔を確保してください。前述の^{ように、1x}リン酸緩衝生理食塩水(PBS)とそれに続く4%ホルムアルデヒドで動物を経心的に灌流します14,15,16。
2. 前述のように、脊髄からDRG組織を解剖します^14、15、16。
3. 解剖したDRGを4%ホルムアルデヒドに室温で3時間後固定します。
4. DRGをPBS中の30%スクロースに4°Cで一晩入れます。
5. 基準最適切削温度(OCT)の準備
   1. OCTコンパウンド( 材料表を参照)を添加してアルミニウムブロックの上面を覆い、-20°Cで5〜10分間凍結します(図1A)。
   2. クライオスタット( 材料表参照)を使用して、表面がベースOCTとして平らになるまで、OCTの上部を30μmの厚さで切断します(図1B)。
   3. クライオスタットからアルミニウムブロックを取り外す前に、ベースOCTの下部(6時の位置)に印を付けて向きをマークします(図1C)。
   4. 次の手順では、マークを6時の位置に保ち、同じ方向を維持すると、DRGサンプルのより多くのセクションを取得できます。
      注:方向が失われ、DRGサンプルが別の角度で切断された場合、DRGサンプルを上から下に完全に切断することができず、DRGサンプルを切断しようとしたときにベースOCTに遭遇するため、一部のサンプルがベースOCTに取り残されて無駄になります(図1C)。
6. DRGのOCT埋込みの実行
   1. OCTに装着する前にDRGティッシュを乾かしてください。
      1. DRGをブロックに添加する前に、サンプルの周りの30%スクロース/PBS溶液を必ず除去してください。
      2. DRGサンプルを乾燥ペトリ皿に置き(図2A)、乾いたピンセットで2〜3回移動させて乾燥させます(図2B)。
      3. 糸くずの出ないティッシュでピンセットを乾かしてから、別のDRGサンプルを移動させます(図2C)。
   2. 乾燥したDRGをベースOCTに置きます。
      1. 乾いたピンセットを使用して、乾いたDRGをベースOCTの12時の位置に置きます(図1D)。
      2. DRGの上端とベースOCTの上端の間に少なくとも5mm離してください。
      3. DRGの背側を12時の位置に、腹側を6時の位置に置きます(図1D)。
   3. DRG組織をOCTで埋め込みます。
      1. さらにOCTを追加して、DRGサンプル全体を円形または楕円形に覆い、DRGを中央にします(図1E)。
      2. OCTの上端がベースOCTの上端でDRGを覆っていることを確認してください(図1F)、これにより切片をスライドガラスに移しやすくなります(図3A)。
         メモ:カバーOCTがベースOCTの中央にある場合、ベースOCTの上端がスライドガラスをブロックして断面を収集します(図3B)。
      3. カバーOCTおよびDRGサンプルを-20°Cでさらに5分間凍結します(図1G)。DRGサンプルの周囲にOCTをトリミングしないでください。
      4. DRGが見えるまで、カバーOCTの上部を30μmの厚さで切り取ります。

2. DRGの凍結切片

1. クライオスタット切片の厚さを12 μmに変更し、DRG切片をスライド上に切断します(図1H)。
2. -20°Cに冷却した小さな絵筆でOCTセクションの下部を持ちます。
   注意: セクション全体を完全に切断するのではなく、1〜3 mmを切断しないでおくことが重要です(図1I)。
3. 室温のピンセットの端を使用して、セクションの下部(6時の位置)にそっと触れ、プラットフォームの表面にくっつくようにします(図1J)。これにより、断面がロール状に湾曲するのを防ぎ、スライド上の断面を回収しにくくします。
   注意: セクションの下部がプラットフォームの表面にくっついていて、セクションの上部がカバーOCTに接続されている場合、セクションは平らな形状になり(図1K)、スライド上のセクションをはるかに簡単に収集できます。
4. 帯電したスライドガラス( 材料表を参照)を取り、スライドをセクションの上にゆっくりと置きます。切片がスライドにくっつき始めたらすぐに、スライドをゆっくりと後方に引きます(図1L)。
5. 同じプロセスに従って、セクションを重ねることなく、より多くのDRGセクションをスライドに配置します(図1M)。新しいDRG切片は、スライド上にうまく留まることができず、免疫染色プロセス中に洗い流される可能性があるため、別のDRG切片(図4)のOCTの上に配置しないでください。

3. スライドガラス上のDRG切片のニッスル染色

1. 切片をPBSと0.1% Triton X-10で10分間洗浄します。次に、切片をPBSで2回洗浄します。
2. 1:300 ニッスル染色剤( 材料表を参照)をスライドに塗布し、室温で 20 分間インキュベートします。
3. PBSと0.1%Triton X-100で切片を洗浄します。次に、切片をPBSで5分間2回洗浄し、次いで室温で2時間洗浄します。
4. 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)フルオロマウント-G( 材料表を参照)を塗布し、切片をカバーガラスで覆います。

Representative Results

現在の研究では、1 つのマウス L4 DRG から約 16 の連続した高品質の DRG 切片を収集しました。得られた切片は歪みがなかった。 図1 は、凍結切片の段階的な手順を示しています。組織切片からの余分な液体の除去を 図2に示します。組織のOCT包埋のプロセスを 図3に示します。 図4 は、スライドガラス上のDRGセクションの適切な配置を示しています。 図5 は、マウスDRG切片の生理学的構造の共焦点蛍光顕微鏡画像を示しています。ニッスル染色では様々なサイズのDRG感覚ニューロンが示され、DAPI染色ではニューロンを取り巻く細胞が示されます。このイメージは、このプロトコルで取得されたDRGセクションの品質を示しています。DRGの免疫組織化学研究には、DRG内のさまざまなニューロンタイプの研究など、さまざまな抗体を適用できます。

図1:マウスDRGを凍結切片化する手順(A)OCTは、アルミニウムブロックの上面で凍結されます。(B)OCTの上部が平らに切断されています。(C)ベースOCTの下部(6時の位置)にマークを付けます。 (D)DRGはベースOCTの上に置き、腹部をマークに向けます。(E)DRGサンプル全体をカバーするために、さらにOCTが追加されます。(F)DRGを覆うOCTの上端は、ベースOCTの上端にある必要があります。(H)カバーOCTの上部は、DRG組織が見えるまで切り取られます(赤い矢印でマークされています)。(I)OCTセクションは、予冷された絵筆で底部に保持されます。(J)セクションの下部は、室温のピンセットの端を使用してプラットフォームの表面に貼り付けられています。(K)(J)の別の図では、断面の下部がプラットフォーム表面にくっついており、上部がカバーOCTに接続されていることがわかります。(M)同じプロセスを繰り返して、セクションが重複しないように、より多くのDRGセクションをスライドに配置します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:DRG組織から余分な液体を除去する技術 。 (A)DRG組織は、周囲の液体が多い30%ショ糖溶液から直接乾燥ペトリプレート上に置かれます。(B)DRG組織を乾いたピンセットを使用してペトリプレート上の隣接する場所に移動させ、余分な周囲の液体を除去します。(C)ピンセットは、DRG組織を移動した後、毎回糸くずの出ないワイプで乾燥させます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:カバーOCTをベースOCTに正しく配置することの重要性。 (A)カバーOCTの理想的な場所: (A-1)DRG組織を覆うOCTの上端は、ベースOCTの上端にある必要があります。 (A-2)セクションを完全に切断せず、小さな部品をカバーOCTの上端に接続してください。 (A-3)セクションはスライドガラスにスムーズに移されます。(A-4)この図は、上端の断面に関しては、その断面をスライドガラスに転写することが容易であることを示している。黒い曲線は、カットされた部分を示しています。(B) カバーOCTの位置が不適切である。 (B-1) DRG組織を覆うOCTをベースOCTの中央に配置する。 (B-2) 完全には切断されておらず、カバーOCTの上端に小さな部品が接続されている。 (B-3) アルミブロックの上端は、スライドガラスが切片に触れるのを防いでいる。赤い矢印は、スライドガラスと切断面の間の距離を示しています。(B-4)この図は、スライドガラスが断面に触れる前にブロックされていることを示しています。黒い曲線は、カットされた部分を示しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:スライドガラス上のDRGセクションの適切な配置 。 (A) DRGセクションと他のDRGセクションのOCTを重ねることなく、DRGセクションを隣り合わせに配置する正しい方法。(B) DRGセクションを別のDRGセクションのOCTに配置する方法が正しくありません。2番目のDRGセクションはスライドガラスに直接付着しないため、後続のプロセスで簡単に洗い流すことができます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:マウスL4 DRGのニッスル染色。 マウスのL4 DRG切片の20倍共焦点画像の例。緑はニッスル(ニューロン)、赤はDAPI(核)を示します。縮尺記号は 50 mm を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルは、マウスDRGのクライオスタット切片作成のための簡単なステップバイステップの手順を提供し、スライド上の高品質のDRG切片を確実に取得します。このプロトコルには 4 つの重要なステップがあります。まず、DRGサンプルとピンセットを乾燥させてから、DRGサンプルをベースOCTに置く必要があります。DRGサンプルを取り巻く液体は、その周囲に氷殻を形成し、その結果、DRGセクションがOCTから分離し、湾曲します。第二に、アルミニウムブロックにマークがない場合、またはベースOCTがマークを覆っている場合は、ベースOCTの下部(6時の位置)にマークを付け、プロセス全体を通してこのマークを6時の位置に保つことが重要です。一定の方向を保つと、DRGを上から下に完全に切断できず、一部のDRGサンプルが取り残されて無駄になるため、より多くのDRGセクションを取得するのに役立ちます。第三に、ベースOCTとカバーOCTの両方の上端は、アルミニウムブロックの上端にある必要があります。このようにして、アルミニウムブロックの上端は、スライドガラスがDRGセクションを取るのを妨げません。第4に、2番目のDRGセクションはスライドガラスに直接付着しないため、後続のプロセスで簡単に洗い流すことができるため、DRGセクションを隣接するDRGセクションのOCT内に置かないようにすることが重要です。

DRG凍結切片は、疼痛やかゆみのメカニズムにおけるDRGを調査する上で非常に重要な技術です^1,2。しかし、マウスDRGの量が非常に少ないため、マウスDRGサンプルの適切なクライオスタット切片を採取することはしばしば困難です。大きな問題は、DRGを含むOCT切片がロール状に湾曲する傾向があり、切片をスライドガラスに載せるのが困難であることです。もう1つの問題は、マウスDRGサンプルが非常に薄いため、凍結切片の設定が最適化されていない場合、1つのDRGサンプルから十分なDRG切片を得ることが困難であることです。ここでは、マウスDRG凍結切片のステップバイステップのプロトコルを提示し、高品質のDRG切片を簡単かつ実用的に収集できるようにしました。このプロトコルにより、1つのマウスL4 DRGから約16の連続した高品質のDRGセクションを収集できます。

このプロトコルの1つの制限は、組織透明化技術²⁶として直接3D再構成を提供できないことである。しかし、この手法では連続した高品質な切片を得ることができるため、これらの連続切片から画像を撮影し、3次元画像を再構成することができます。

DRGの凍結切片のためのプロトコルは8-12週齢の若年成体マウスから開発されるが、このプロトコルはより若いかより古い年齢のマウスからの人間のDRGsおよびDRGsの凍結切片に適用することができる。実際、このプロトコルは、あらゆる体積サンプルの凍結切片に適用できるはずです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).