Summary
Di seguito viene presentato lo sviluppo per l'acquisizione costante di sezioni criostatiche gangliari a radice dorsale di alta qualità.
Abstract
Le sezioni del criostato del ganglio della radice dorsale (DRG) di topo di alta qualità sono fondamentali per una corretta colorazione immunochimica e studi di RNAscope nella ricerca di dolore infiammatorio e neuropatico, prurito e altre condizioni neurologiche periferiche. Tuttavia, rimane una sfida ottenere costantemente sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini a causa delle minuscole dimensioni del campione del tessuto DRG. Finora, non esiste un articolo che descriva un protocollo ottimale per la criosezione DRG. Questo protocollo presenta un metodo passo-passo per risolvere le difficoltà frequentemente incontrate associate alla criosezione DRG. L'articolo presentato spiega come rimuovere il liquido circostante dai campioni di tessuto DRG, posizionare le sezioni DRG sul vetrino rivolte verso lo stesso orientamento e appiattire le sezioni sul vetrino senza curvare verso l'alto. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per la criosezione dei campioni DRG, può essere applicato per la criosezione di molti altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.
Introduction
Il ganglio della radice dorsale (DRG) contiene i neuroni sensoriali primari, i macrofagi tissutali e le cellule satelliti che circondano i neuroni sensoriali primari 1,2,3,4. È una struttura anatomica chiave nell'elaborazione di segnali innocui e nocivi e svolge un ruolo critico nel dolore, nel prurito e in vari disturbi dei nervi periferici 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi per sezionare il tessuto DRG dal midollo spinale del topo14,15,16, la criosezione del tessuto DRG rimane impegnativa poiché il tessuto DRG è piuttosto piccolo e le sezioni del criostato dei campioni DRG tendono a curvarsi in rotoli, rendendo difficile il trasferimento corretto delle sezioni del criostato sui vetrini. Tuttavia, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per gli studi di immunoistochimica e la struttura dei neuroni sensoriali DRG 17,18,19,20,21,22,23. Inoltre, poiché i risultati del sequenziamento dell'RNA a singola cellula hanno rivelato la notevole eterogeneità dei neuroni sensoriali DRG sia nell'uomo24 che nei topi25, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per studiare il ruolo funzionale di diverse cellule DRG in varie condizioni fisiologiche e patologiche.
Sebbene la tecnica di purificazione dei tessuti sia stata applicata per studiare la ricostruzione 3D del DRG26 come tecnica alternativa di criosezione del DRG, la tecnica di purificazione dei tessuti richiede tempo e lavoro. In confronto, la criosezione del DRG è rapida e relativamente facile da eseguire, e quindi rimane una tecnica chiave per l'immunoistochimica e gli studi di struttura del DRG e di altre regioni del sistema nervoso centrale. Tuttavia, ottenere sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini rimane una sfida nella ricerca neuroscientifica a causa delle minuscole dimensioni del campione di tessuti, come il DRG e alcune regioni cerebrali, e non esiste un articolo che descriva il protocollo ottimale a questo punto per la criosezione di campioni di tessuto di piccole dimensioni, come i DRG di topo.
Questo protocollo fornisce una tecnica semplice e passo-passo per il sezionamento criostatico del DRG di topo per ottenere in modo affidabile il maggior numero di sezioni DRG di alta qualità sui vetrini per i successivi studi DRG. Sebbene sia stata progettata specificamente per la criosezione di campioni DRG, questa tecnica può potenzialmente essere utilizzata per la criosezione di vari altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.
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Protocol
Per il presente studio, gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'UCSF e sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Qui sono stati utilizzati topi maschi e femmine adulti di 8-12 settimane C57BL/6 (allevati internamente).
1. Preparazione del campione DRG
- Anestetizzare i topi con Avertin al 2,5% (vedi Tabella dei Materiali). Garantire un'anestesia adeguata in caso di mancata risposta alla stimolazione dolorosa. Perfondere gli animali per via transcardiaca con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) seguita da formaldeide al 4%, come descritto in precedenza14,15,16.
- Sezionare il tessuto DRG dal midollo spinale, come descritto in precedenza14,15,16.
- Post-fissare i DRG sezionati in formaldeide al 4% per 3 ore a temperatura ambiente.
- Mettere i DRG in saccarosio al 30% in PBS a 4 °C per una notte.
- Preparazione della temperatura di taglio ottimale di base (OCT)
- Aggiungere il composto OCT (vedere la tabella dei materiali) per coprire la superficie superiore del blocco di alluminio e congelare a -20 °C per 5-10 minuti (Figura 1A).
- Tagliare la parte superiore dell'OCT utilizzando il criostato (vedere la tabella dei materiali) a uno spessore di 30 μm fino a quando la sua superficie non è piatta come l'OCT di base (Figura 1B).
- Segnare nella parte inferiore (a ore sei) dell'OCT di base per segnarne l'orientamento, prima di togliere il blocco di alluminio dal criostato (Figura 1C).
- Nei passaggi successivi, mantenere il segno a ore sei per mantenere lo stesso orientamento, il che può portare a ottenere più sezioni del campione DRG.
NOTA: Se l'orientamento viene perso e il campione DRG viene tagliato con un'angolazione diversa, il campione DRG non può essere tagliato completamente dall'alto verso il basso, il che lascerà alcuni campioni lasciati fuori sull'OCT di base e sprecati, poiché l'OCT di base si incontrerà durante il tentativo di tagliare il campione DRG (Figura 1C).
- Esecuzione dell'incorporamento OCT di DRG
- Asciugare il tessuto DRG prima di metterlo sull'OCT.
- Prima di aggiungere il DRG al blocco, assicurarsi di rimuovere la soluzione di saccarosio/PBS al 30% intorno al campione.
- Asciugare il campione DRG posizionandolo su una capsula di Petri asciutta (Figura 2A) e spostandolo da una posizione all'altra due o tre volte con una pinzetta asciutta (Figura 2B).
- Asciugare le pinzette con un panno privo di lanugine prima di spostare un altro campione DRG (Figura 2C).
- Mettere il DRG asciutto sull'OCT di base.
- Con una pinzetta asciutta, posizionare il DRG asciutto sull'OCT di base a ore 12 (Figura 1D).
- Mantenere una distanza di almeno 5 mm tra il bordo superiore del DRG e il bordo superiore dell'OCT di base.
- Posizionare la parte dorsale del DRG a ore 12 e la parte ventrale a ore sei (Figura 1D).
- Incorporare il tessuto DRG con OCT.
- Aggiungere altro OCT per coprire l'intero campione DRG in una forma rotonda o ovale, con il DRG al centro (Figura 1E).
- Assicurarsi che il bordo superiore dell'OCT copra il DRG sul bordo superiore dell'OCT di base (Figura 1F), in quanto ciò facilita il trasferimento della sezione sul vetrino (Figura 3A).
NOTA: Se l'OCT di copertura si trova al centro dell'OCT di base, il bordo superiore dell'OCT di base bloccherà il vetrino per raccogliere la sezione (Figura 3B). - Congelare il campione OCT e DRG di copertura a -20 °C per altri 5 minuti (Figura 1G). Non tagliare l'OCT attorno al campione DRG.
- Tagliare la parte superiore del coperchio OCT a uno spessore di 30 μm fino a quando il DRG non è visibile.
- Asciugare il tessuto DRG prima di metterlo sull'OCT.
2. Criosezione del DRG
- Modificare lo spessore della sezione del criostato a 12 μm per tagliare le sezioni DRG sul vetrino (Figura 1H).
- Tenere la sezione OCT in basso con un piccolo pennello raffreddato a -20 °C.
NOTA: È importante non tagliare completamente l'intera sezione, ma lasciare 1-3 mm non tagliati (Figura 1I). - Utilizzare l'estremità di una pinzetta a temperatura ambiente per toccare delicatamente la parte inferiore (posizione a ore sei) della sezione in modo che aderisca alla superficie della piattaforma (Figura 1J). In questo modo si evita che la sezione si curvi all'indietro in un rotolo, il che rende difficile la raccolta della sezione sulla slitta.
NOTA: Quando la parte inferiore della sezione aderisce alla superficie della piattaforma e la parte superiore della sezione si collega ancora con l'OCT di copertura, la sezione ha una forma piatta (Figura 1K), rendendo molto più facile la raccolta della sezione sulla diapositiva. - Prendi un vetrino di vetro caricato (vedi Tabella dei materiali) e posiziona lentamente il vetrino sulla sezione. Non appena la sezione inizia ad aderire alla slitta, tirare delicatamente la slitta all'indietro (Figura 1L).
- Seguire la stessa procedura per ottenere più sezioni DRG sulla diapositiva senza sovrapporle (Figura 1M). Assicurarsi che una nuova sezione DRG non venga posizionata sopra l'OCT di un'altra sezione DRG (Figura 4), poiché tale sezione non può rimanere bene sul vetrino e può essere lavata via durante il processo di colorazione immunochimica.
3. Colorazione Nissl della sezione DRG sul vetrino
- Lavare le sezioni per 10 minuti in PBS più Triton X-10 allo 0,1%. Quindi, lavare le sezioni due volte con PBS.
- Applicare una colorazione Nissl 1:300 (vedi Tabella dei materiali) sul vetrino e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare la sezione con PBS più Triton X-100 allo 0,1%. Quindi, lavare le sezioni due volte con PBS per 5 minuti e poi per 2 ore a temperatura ambiente.
- Applicare il fluoromount-G 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (vedi Tabella dei materiali) per coprire le sezioni con un vetrino coprioggetti.
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Representative Results
L'attuale studio ha raccolto circa 16 sezioni DRG continue e di alta qualità da un topo L4 DRG. Le sezioni ottenute erano prive di qualsiasi distorsione. La Figura 1 illustra la procedura passo-passo per la criosezione. La rimozione del liquido in eccesso dalle sezioni di tessuto è mostrata nella Figura 2. Il processo di incorporazione OCT dei tessuti è evidenziato nella Figura 3. La Figura 4 mostra il corretto posizionamento delle sezioni DRG sui vetrini. La Figura 5 mostra l'immagine al microscopio a fluorescenza confocale della struttura fisiologica delle sezioni DRG di topo. La colorazione di Nissl mostra i neuroni sensoriali DRG di varie dimensioni e la colorazione DAPI mostra le cellule che circondano i neuroni. Questa immagine mostra la qualità delle sezioni DRG ottenute con questo protocollo. Diversi anticorpi possono essere applicati per gli studi immunoistochimici del DRG, incluso lo studio di diversi tipi di neuroni nel DRG.
Figura 1: Procedura passo-passo per la criosezione di DRG di topo . (A) L'OCT viene congelato sulla superficie superiore del blocco di alluminio. (B) La parte superiore del PTOM è tagliata in piano. (C) Viene fatto un segno nella parte inferiore (a ore sei) dell'OCT di base. (D) Il DRG viene apposto sull'OCT di base, con la parte ventrale rivolta verso il marchio. (E) Vengono aggiunti ulteriori PTOM per coprire l'intero campione DRG. (F) Il bordo superiore del PTOM che copre il DRG deve trovarsi sul bordo superiore del PTOM di base. (G) Il campione OCT e DRG di copertura è congelato. (H) La parte superiore dell'OCT di copertura viene tagliata fino a quando il tessuto DRG non è visibile (contrassegnato dalla freccia rossa). (I) La sezione OCT è tenuta in basso con un pennello preraffreddato. (J) La parte inferiore della sezione è bloccata sulla superficie della piattaforma utilizzando l'estremità di una pinzetta a temperatura ambiente. (K) Un'altra vista di (J) mostra che la parte inferiore della sezione aderisce alla superficie della piattaforma e la parte superiore si collega ancora con il coperchio OCT. (L) La sezione è attaccata a un vetrino. (M) Lo stesso processo viene ripetuto per ottenere più sezioni DRG sulla slitta senza sovrapporre le sezioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Tecnica per rimuovere il liquido in eccesso dal tessuto DRG. (A) Il tessuto DRG viene posto su una piastra di Petri asciutta direttamente da una soluzione di saccarosio al 30%, che ha molto liquido circostante. (B) Il tessuto DRG viene spostato in una posizione vicina sulla piastra di Petri utilizzando pinzette asciutte per rimuovere il liquido circostante in eccesso. (C) Le pinzette vengono asciugate con una salvietta priva di lanugine ogni volta dopo aver spostato il tessuto DRG. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'importanza di posizionare correttamente l'OCT di copertura sull'OCT di base. (A) La posizione ideale dell'OCT di copertura: (A-1) Il bordo superiore del tessuto DRG di copertura dell'OCT deve trovarsi sul bordo superiore dell'OCT di base. (A-2) La sezione non deve essere tagliata completamente, con una piccola parte collegata al bordo superiore dell'OCT di copertura. (A-3) La sezione viene trasferita sul vetrino in modo uniforme. (A-4) Il disegno mostra che, in termini di sezione sul bordo superiore, è facile trasferire la sezione sul vetrino. La linea curva nera indica la sezione che è stata tagliata. (B) Posizione impropria del coperchio OCT. (B-1) Il tessuto DRG di copertura OCT è posizionato al centro del PT di base. (B-2) La sezione non è completamente tagliata, con una piccola parte collegata al bordo superiore del coperchio OCT. (B-3) Il bordo superiore del blocco di alluminio impedisce al vetrino di toccare la sezione. Le frecce rosse indicano la distanza tra il vetrino e la sezione tagliata. (B-4) Il disegno mostra che il vetrino è bloccato prima di toccare la sezione. La linea curva nera indica la sezione che è stata tagliata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il corretto posizionamento delle sezioni DRG sul vetrino . (A) Il metodo corretto per posizionare le sezioni DRG una accanto all'altra senza sovrapporsi alla sezione DRG e all'OCT di altre sezioni DRG. (B) Il metodo errato per posizionare le sezioni DRG sul PT di un'altra sezione DRG. Poiché la seconda sezione DRG non si attacca direttamente al vetrino, può essere facilmente lavata via durante i processi successivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Colorazione di Nissl del topo L4 DRG. Un esempio di immagine confocale 20x di una sezione DRG L4 del mouse. Il verde indica Nissl (neurone) e il rosso indica DAPI (nucleo). La barra della scala rappresenta 50 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo fornisce una semplice procedura passo-passo per il sezionamento del criostato del DRG del topo per ottenere sezioni DRG di alta qualità su vetrini in modo affidabile. Ci sono quattro passaggi critici in questo protocollo. Innanzitutto, il campione DRG e le pinzette devono essere asciutti prima di mettere il campione DRG sull'OCT di base. Qualsiasi liquido che circonda il campione DRG formerà un guscio di ghiaccio attorno ad esso, con il risultato che le sezioni DRG si separano dall'OCT e si curvono. In secondo luogo, se il blocco di alluminio non ha un segno, o se l'OCT di base copre il marchio, è importante fare un segno nella parte inferiore (posizione a ore sei) dell'OCT di base e mantenere questo segno nella posizione a ore sei durante tutto il processo. Mantenere un orientamento costante aiuta a ottenere più sezioni DRG, altrimenti il DRG non può essere tagliato completamente dall'alto verso il basso e alcuni campioni DRG verranno lasciati fuori e sprecati. In terzo luogo, i bordi superiori dell'OCT di base e dell'OCT di copertura devono trovarsi sul bordo superiore del blocco di alluminio. In questo modo, il bordo superiore del blocco di alluminio non bloccherà la vetrinia dall'accogliere le sezioni DRG. In quarto luogo, è importante evitare di inserire la sezione DRG all'interno dell'OCT delle sezioni DRG vicine, perché la seconda sezione DRG non si attaccherà direttamente al vetrino e quindi può essere facilmente lavata via nel processo successivo.
La criosezione DRG è una tecnologia molto importante nello studio dei DRG nei meccanismi del dolore e del prurito 1,2. Tuttavia, a causa del volume molto ridotto di DRG di topo, la raccolta di sezioni criostatiche adeguate di campioni di DRG di topo è spesso impegnativa. Uno dei problemi principali è che le sezioni OCT contenenti DRG tendono a curvarsi in un rotolo, rendendo difficile l'inserimento delle sezioni sui vetrini. Un altro problema è che, poiché il campione DRG di topo è molto sottile, è difficile ottenere sezioni DRG sufficienti da un campione DRG se le impostazioni di criosezione non sono ottimizzate. Qui, abbiamo presentato un protocollo passo-passo per la criosezione DRG del topo, rendendo la raccolta di sezioni DRG di alta qualità facile e pratica. Con questo protocollo, siamo in grado di raccogliere circa 16 sezioni DRG continue e di alta qualità da un DRG L4 di topo.
Un limite di questo protocollo è che non può fornire una ricostruzione 3D diretta come la tecnica di pulizia dei tessuti26. Tuttavia, poiché con questo metodo possiamo ottenere sezioni continue e di alta qualità, possiamo prendere immagini da queste sezioni continue per ricostruire immagini 3D.
Sebbene il protocollo per la criosezione di DRG sia sviluppato da topi giovani adulti di età compresa tra 8 e 12 settimane, questo protocollo può essere applicato per la criosezione di DRG umani e DRG di topi di età più giovane o più avanzata. Infatti, questo protocollo dovrebbe poter essere applicato per la criosezione di qualsiasi campione di volume.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
References
- Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
- Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).
- Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
- Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).
- Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
- Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
- Chen, X. J., Sun, Y. G.
- Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
- Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
- Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
- Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
- Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
- Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).
- Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).
- Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
- Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
- Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
- Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).
- Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
- Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
- Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752 (2021).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).
