Summary
यहां प्रस्तुत उच्च गुणवत्ता वाले पृष्ठीय जड़ गैंग्लियन क्रायोस्टैट वर्गों को लगातार प्राप्त करने के लिए विकास है।
Abstract
उच्च गुणवत्ता वाले माउस पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) क्रायोस्टैट अनुभाग भड़काऊ और न्यूरोपैथिक दर्द, खुजली, साथ ही अन्य परिधीय न्यूरोलॉजिकल स्थितियों के अनुसंधान में उचित इम्यूनोकैमिस्ट्री स्टेनिंग और आरएनएस्कोप अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, डीआरजी ऊतक के छोटे नमूने के आकार के कारण ग्लास स्लाइड पर लगातार उच्च गुणवत्ता वाले, बरकरार और फ्लैट क्रायोस्टेट अनुभाग प्राप्त करना एक चुनौती बनी हुई है। अब तक, डीआरजी क्रायोसेक्शनिंग के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल का वर्णन करने वाला कोई लेख नहीं है। यह प्रोटोकॉल डीआरजी क्रायोसेक्शनिंग से जुड़ी अक्सर आने वाली कठिनाइयों को हल करने के लिए एक चरण-दर-चरण विधि प्रस्तुत करता है। प्रस्तुत लेख बताता है कि डीआरजी ऊतक के नमूनों से आसपास के तरल को कैसे हटाया जाए, डीआरजी वर्गों को एक ही अभिविन्यास के सामने स्लाइड पर रखा जाए, और सुडौल किए बिना ग्लास स्लाइड पर अनुभागों को समतल किया जाए। यद्यपि यह प्रोटोकॉल डीआरजी नमूनों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए विकसित किया गया है, लेकिन इसे एक छोटे नमूने के आकार के साथ कई अन्य ऊतकों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स, ऊतक मैक्रोफेज और उपग्रह कोशिकाएं होती हैं जो प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स 1,2,3,4 को घेरती हैं। यह निर्दोष और हानिकारक संकेतों को संसाधित करने में एक महत्वपूर्ण शारीरिक संरचना है, और दर्द, खुजली, और विभिन्न परिधीय तंत्रिका विकारों 5,6,7,8,9,10,11,12,13 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यद्यपि माउस रीढ़ की हड्डी14,15,16 से डीआरजी ऊतक को विच्छेदित करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, डीआरजी ऊतक का क्रायोसेक्शनिंग चुनौतीपूर्ण बना हुआ है क्योंकि डीआरजी ऊतक काफी छोटा है, और डीआरजी नमूनों के क्रायोस्टेट अनुभाग रोल में मुड़ते हैं, जिससे क्रायोस्टैट वर्गों को ग्लास स्लाइड पर ठीक से स्थानांतरित करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन और डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स 17,18,19,20,21,22,23 की संरचना के लिए डीआरजी ऊतक का उचित क्रायोसेक्शनिंग महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, जैसा कि एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण परिणामों ने मनुष्यों24 और चूहों25 दोनों में डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स की उल्लेखनीय विविधता का खुलासा किया है, विभिन्न शारीरिक और रोग स्थितियों में विभिन्न डीआरजी कोशिकाओं की कार्यात्मक भूमिका की जांच के लिए डीआरजी ऊतक का उचित क्रायोसेक्शनिंग महत्वपूर्ण है।
यद्यपि ऊतक-समाशोधन तकनीक को डीआरजी 26 के 3 डी पुनर्निर्माण की जांच के लिए डीआरजी26 के क्रायोसेक्शनिंग की वैकल्पिक तकनीक के रूप में लागू किया गया है, ऊतक-समाशोधन तकनीक समय और श्रम लेने वाली है। इसकी तुलना में, डीआरजी का क्रायोसेक्शनिंग त्वरित और प्रदर्शन करने में अपेक्षाकृत आसान है, और इस प्रकार यह इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और डीआरजी और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अन्य क्षेत्रों के संरचना अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक बनी हुई है। हालांकि, ग्लास स्लाइड पर उच्च गुणवत्ता वाले, बरकरार और फ्लैट क्रायोस्टैट अनुभाग प्राप्त करना तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक चुनौती बनी हुई है, क्योंकि डीआरजी और कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे ऊतकों के छोटे नमूना आकार के कारण, और माउस डीआरजी जैसे छोटे आकार के ऊतक नमूनों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए इस बिंदु पर इष्टतम प्रोटोकॉल का वर्णन करने वाला कोई लेख नहीं है।
यह प्रोटोकॉल माउस डीआरजी के क्रायोस्टैट सेक्शनिंग के लिए एक आसान, चरण-दर-चरण तकनीक प्रदान करता है ताकि बाद के डीआरजी अध्ययनों के लिए स्लाइड पर कई उच्च गुणवत्ता वाले डीआरजी अनुभागों को विश्वसनीय रूप से प्राप्त किया जा सके। जबकि विशेष रूप से क्रायोसेक्शनिंग डीआरजी नमूनों के लिए डिज़ाइन किया गया है, इस तकनीक का उपयोग संभावित रूप से एक छोटे नमूने के आकार के साथ विभिन्न अन्य ऊतकों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
वर्तमान अध्ययन के लिए, पशु प्रयोगों को यूसीएसएफ संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के अनुसार आयोजित किया गया था। वयस्क, 8-12 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 नर और मादा चूहों (इन-हाउस ब्रेड) का उपयोग यहां किया गया था।
1. डीआरजी नमूना तैयारी
- 2.5% एवर्टिन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें (सामग्री की तालिका देखें)। दर्दनाक उत्तेजना के प्रति प्रतिक्रिया की कमी से पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करें। जानवरों को 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ ट्रांसकार्डियल रूप से प्रतिस्थापित करें, इसके बाद 4% फॉर्मलाडेहाइड, जैसा कि पहले वर्णित 14,15,16 था।
- रीढ़ की हड्डी से डीआरजी ऊतक का विच्छेदन, जैसा कि पहले वर्णित14,15,16 है।
- कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए 4% फॉर्मलाडेहाइड में विच्छेदित डीआरजी को ठीक करें।
- रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में डीआरजी को 30% सुक्रोज में रखें।
- आधार इष्टतम काटने के तापमान (OCT) तैयार करना
- एल्यूमीनियम ब्लॉक की शीर्ष सतह को कवर करने के लिए ओसीटी यौगिक ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें (चित्रा 1 ए)।
- 30 μm मोटाई पर क्रायोस्टैट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके ओसीटी के शीर्ष को काट दें जब तक कि इसकी सतह आधार OCT (चित्रा 1B) के रूप में सपाट न हो।
- क्रायोस्टैट (चित्रा 1 सी) से एल्यूमीनियम ब्लॉक लेने से पहले, इसके अभिविन्यास को चिह्नित करने के लिए बेस ओसीटी के निचले हिस्से (छह बजे की स्थिति) पर एक निशान बनाएं।
- निम्नलिखित चरणों में, एक ही अभिविन्यास को बनाए रखने के लिए निशान को छह बजे की स्थिति में रखें, जिससे डीआरजी नमूने के अधिक अनुभाग प्राप्त हो सकते हैं।
नोट: यदि अभिविन्यास खो गया है और डीआरजी नमूना एक अलग कोण पर काटा गया है, तो डीआरजी नमूने को ऊपर से नीचे तक पूरी तरह से काटा नहीं जा सकता है, जिससे कुछ नमूने बेस ओसीटी पर छूट जाएंगे और बर्बाद हो जाएंगे, क्योंकि डीआरजी नमूने को काटने की कोशिश करते समय बेस ओसीटी का सामना करना पड़ेगा (चित्रा 1 सी)।
- डीआरजी के ओसीटी एम्बेडमेंट का प्रदर्शन
- ओसीटी पर डालने से पहले डीआरजी ऊतक को सुखाएं।
- ब्लॉक पर डीआरजी जोड़ने से पहले, नमूने के चारों ओर 30% सुक्रोज / पीबीएस समाधान को हटाना सुनिश्चित करें।
- डीआरजी नमूने को सूखे पेट्री डिश (चित्रा 2 ए) पर रखकर सुखाएं और इसे सूखे चिमटी (चित्रा 2 बी) के साथ दो या तीन बार एक स्थान से दूसरे स्थान पर ले जाएं।
- एक और डीआरजी नमूना (चित्रा 2 सी) को स्थानांतरित करने से पहले चिमटी को लिंट-मुक्त ऊतक के साथ सुखाएं।
- सूखे डीआरजी को बेस ओसीटी पर रखें।
- सूखी चिमटी के साथ, सूखे डीआरजी को बेस ओसीटी पर 12 बजे की स्थिति में रखें (चित्रा 1 डी)।
- डीआरजी के ऊपरी किनारे और बेस ओसीटी के ऊपरी किनारे के बीच कम से कम 5 मिमी रखें।
- डीआरजी के पृष्ठीय भाग को 12 बजे की स्थिति में और उदर भाग को छह बजे की स्थिति में रखें (चित्र 1 डी)।
- ओसीटी के साथ डीआरजी ऊतक एम्बेड करें।
- केंद्र में डीआरजी के साथ पूरे डीआरजी नमूने को एक गोल या अंडाकार आकार में कवर करने के लिए अधिक ओसीटी जोड़ें (चित्रा 1 ई)।
- सुनिश्चित करें कि ओसीटी का ऊपरी किनारा बेस ओसीटी (चित्रा 1 एफ) के ऊपरी किनारे पर डीआरजी को कवर करता है, क्योंकि इससे अनुभाग को ग्लास स्लाइड (चित्रा 3 ए) पर स्थानांतरित करना आसान हो जाता है।
नोट: यदि कवर ओसीटी बेस ओसीटी के बीच में है, तो बेस ओसीटी का ऊपरी किनारा अनुभाग (चित्रा 3 बी) को इकट्ठा करने के लिए ग्लास स्लाइड को अवरुद्ध करेगा। - कवर ओसीटी और डीआरजी नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर एक और 5 मिनट के लिए फ्रीज करें (चित्रा 1 जी)। डीआरजी नमूने के आसपास ओसीटी को ट्रिम न करें।
- कवर ओसीटी के शीर्ष को 30 μm मोटाई पर काट दें जब तक कि डीआरजी दिखाई न दे।
- ओसीटी पर डालने से पहले डीआरजी ऊतक को सुखाएं।
2. डीआरजी का क्रायोसेक्शनिंग
- स्लाइड पर डीआरजी अनुभागों को काटने के लिए क्रायोस्टेट अनुभाग मोटाई को 12 μm तक बदलें (चित्रा 1H)।
- -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने वाले एक छोटे पेंटब्रश के साथ नीचे ओसीटी अनुभाग रखें।
नोट: पूरे खंड को पूरी तरह से काटना महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन 1-3 मिमी को बिना कटा हुआ छोड़ना है (चित्रा 1 आई)। - अनुभाग के निचले भाग (छह बजे की स्थिति) को धीरे से छूने के लिए कमरे के तापमान वाली चिमटी के अंत का उपयोग करें ताकि यह प्लेटफ़ॉर्म की सतह (चित्रा 1 जे) से चिपक जाए। यह अनुभाग को रोल में वापस सुडौल होने से रोकता है, जिससे स्लाइड पर अनुभाग को एकत्र करना मुश्किल हो जाता है।
नोट: जब अनुभाग का निचला भाग प्लेटफ़ॉर्म सतह से चिपक जाता है, और अनुभाग का शीर्ष अभी भी कवर OCT से जुड़ता है, तो अनुभाग एक सपाट आकार (चित्रा 1K) में होता है, जिससे स्लाइड पर अनुभाग को एकत्र करना बहुत आसान हो जाता है। - एक चार्ज ग्लास स्लाइड लें ( सामग्री की तालिका देखें) और धीरे-धीरे स्लाइड को अनुभाग पर रखें। जैसे ही अनुभाग स्लाइड से चिपकना शुरू करता है, धीरे से स्लाइड को पीछे खींचें (चित्रा 1 एल)।
- अनुभागों को ओवरलैप किए बिना स्लाइड पर अधिक डीआरजी अनुभाग प्राप्त करने के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करें (चित्रा 1 एम)। सुनिश्चित करें कि एक नया डीआरजी अनुभाग किसी अन्य डीआरजी अनुभाग (चित्रा 4) के ओसीटी पर नहीं रखा गया है, क्योंकि ऐसा खंड स्लाइड पर अच्छी तरह से नहीं रह सकता है और इम्यूनोकैमिस्ट्री धुंधला प्रक्रिया के दौरान धोया जा सकता है।
3. ग्लास स्लाइड पर डीआरजी सेक्शन का निसल धुंधलाहोना।
- पीबीएस प्लस 0.1% ट्राइटन एक्स -10 में 10 मिनट के लिए अनुभागों को धोएं। फिर, पीबीएस के साथ दो बार अनुभागों को धो लें।
- स्लाइड पर 1:300 निस्सल दाग ( सामग्री की तालिका देखें) लागू करें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस प्लस 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ अनुभाग धोएं। फिर, 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार अनुभागों को धोएं, और फिर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए।
- कवरस्लिप के साथ अनुभागों को कवर करने के लिए 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल (डीएपीआई) फ्लोरोमाउंट-जी ( सामग्री की तालिका देखें) लागू करें।
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Representative Results
वर्तमान अध्ययन ने एक माउस एल 4 डीआरजी से लगभग 16 निरंतर, उच्च गुणवत्ता वाले डीआरजी अनुभाग एकत्र किए। प्राप्त अनुभाग बिना किसी विकृति के थे। चित्रा 1 क्रायोसेक्शनिंग के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रिया को दर्शाता है। ऊतक वर्गों से अतिरिक्त तरल को हटाने को चित्र 2 में दिखाया गया है। ऊतकों के ओसीटी एम्बेडमेंट की प्रक्रिया को चित्रा 3 में हाइलाइट किया गया है। चित्रा 4 ग्लास स्लाइड पर डीआरजी अनुभागों के उचित प्लेसमेंट को दर्शाता है। चित्रा 5 माउस डीआरजी वर्गों की शारीरिक संरचना की कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवि दिखाता है। निस्सल धुंधला विभिन्न आकार के डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स को दर्शाता है, और डीएपीआई धुंधला न्यूरॉन्स के आसपास की कोशिकाओं को दर्शाता है। यह छवि इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त डीआरजी अनुभागों की गुणवत्ता को प्रदर्शित करती है। डीआरजी के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन के लिए विभिन्न एंटीबॉडी लागू किए जा सकते हैं, जिसमें डीआरजी में विभिन्न न्यूरॉन प्रकारों का अध्ययन शामिल है।
चित्र 1: क्रायोसेक्शनिंग माउस डीआरजी के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रिया (ए) ओसीटी एल्यूमीनियम ब्लॉक की शीर्ष सतह पर जमी हुई है। (बी) ओसीटी का शीर्ष सपाट कटा हुआ है। (C) आधार OCT के निचले भाग (छह बजे की स्थिति) पर एक चिह्न बनाया जाता है। (D) DRG को बेस OCT पर रखा जाता है, जिसमें उदर भाग चिह्न के सामने होता है। (ई) पूरे डीआरजी नमूने को कवर करने के लिए अधिक ओसीटी जोड़ा जाता है। (एफ) डीआरजी को कवर करने वाले ओसीटी के ऊपरी किनारे को बेस ओसीटी के ऊपरी किनारे पर होना चाहिए। (एच) कवर ओसीटी के शीर्ष को तब तक काट दिया जाता है जब तक कि डीआरजी ऊतक दिखाई न दे (लाल तीर के साथ चिह्नित)। (I) ओसीटी अनुभाग को प्री-कूल्ड पेंटब्रश के साथ नीचे रखा जाता है। (जे) कमरे के तापमान वाली चिमटी के अंत का उपयोग करके अनुभाग का निचला भाग प्लेटफॉर्म की सतह पर फंस गया है। (K) (J) का एक अन्य दृश्य दर्शाता है कि अनुभाग का निचला भाग प्लेटफ़ॉर्म की सतह से चिपक जाता है और शीर्ष अभी भी कवर OCT से जुड़ता है। (एम) ओवरलैपिंग अनुभागों के बिना स्लाइड पर अधिक डीआरजी अनुभाग प्राप्त करने के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराई जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: डीआरजी ऊतक से अतिरिक्त तरल निकालने की तकनीक। (ए) डीआरजी ऊतक को 30% सुक्रोज समाधान से सीधे एक सूखी पेट्री प्लेट पर रखा जाता है, जिसमें आसपास का बहुत सारा तरल होता है। (बी) डीआरजी ऊतक को अतिरिक्त आसपास के तरल को हटाने के लिए सूखी चिमटी का उपयोग करके पेट्री प्लेट पर पड़ोसी स्थान पर ले जाया जाता है। (सी) डीआरजी ऊतक को स्थानांतरित करने के बाद हर बार चिमटी को लिंट-फ्री वाइप के साथ सुखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: कवर OCT पर कवर OCT को ठीक से रखने का महत्व। (A) कवर OCT का आदर्श स्थान: (A-1) DRG ऊतक को कवर करने वाले OCT का ऊपरी किनारा आधार OCT के ऊपरी किनारे पर होना चाहिए। (A-2) खंड को पूरी तरह से काटा नहीं जाना चाहिए, जिसमें कवर OCT के ऊपरी किनारे से जुड़ा एक छोटा हिस्सा हो। (A-3) अनुभाग को ग्लास स्लाइड पर आसानी से स्थानांतरित किया जाता है। (A-4) ड्राइंग से पता चलता है कि, ऊपरी किनारे पर अनुभाग के संदर्भ में, अनुभाग को ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करना आसान है। काली घुमावदार रेखा उस खंड को इंगित करती है जिसे काटा गया है। (B-1) DRG ऊतक को कवर करने वाले OCT को आधार OCT के केंद्र में रखा जाता है। (B-2) खंड पूरी तरह से काटा नहीं गया है, जिसमें एक छोटा सा हिस्सा कवर OCT के ऊपरी किनारे से जुड़ा हुआ है। (B-3) एल्यूमीनियम ब्लॉक का ऊपरी किनारा ग्लास स्लाइड को अनुभाग को छूने से रोकता है। लाल तीर ग्लास स्लाइड और कट सेक्शन के बीच की दूरी को इंगित करते हैं। (B-4) आरेखण दिखाता है कि अनुभाग को छूने से पहले ग्लास स्लाइड अवरुद्ध है. काली घुमावदार रेखा उस खंड को इंगित करती है जिसे काटा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: ग्लास स्लाइड पर डीआरजी अनुभागों का उचित प्लेसमेंट । (ए) डीआरजी सेक्शन और अन्य डीआरजी सेक्शन के ओसीटी को ओवरलैप किए बिना डीआरजी वर्गों को एक दूसरे के बगल में रखने का सही तरीका। (बी) डीआरजी अनुभागों को किसी अन्य डीआरजी खंड के ओसीटी पर रखने का गलत तरीका। क्योंकि दूसरा डीआरजी अनुभाग सीधे ग्लास स्लाइड पर नहीं टिकता है, इसे बाद की प्रक्रियाओं के दौरान आसानी से धोया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: माउस L4 DRG का निस्सल धुंधलापन। माउस L4 DRG अनुभाग की 20x confocal छवि का एक उदाहरण। हरा निस्सल (न्यूरॉन) को इंगित करता है, और लाल डीएपीआई (नाभिक) को इंगित करता है। स्केल बार 50 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल विश्वसनीय रूप से स्लाइड पर उच्च गुणवत्ता वाले डीआरजी अनुभागों को प्राप्त करने के लिए माउस डीआरजी के क्रायोस्टैट सेक्शनिंग के लिए एक आसान चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में चार महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, डीआरजी नमूना और चिमटी को बेस ओसीटी पर डीआरजी नमूना डालने से पहले सूखा होना चाहिए। डीआरजी नमूने के आसपास कोई भी तरल इसके चारों ओर एक बर्फ का खोल बनाएगा, जिसके परिणामस्वरूप डीआरजी खंड ओसीटी से अलग हो जाएंगे और सुडौल हो जाएंगे। दूसरा, यदि एल्यूमीनियम ब्लॉक में कोई निशान नहीं है, या यदि आधार ओसीटी निशान को कवर करता है, तो बेस ओसीटी के नीचे (छह बजे की स्थिति) पर निशान बनाना और इस निशान को पूरी प्रक्रिया में छह बजे की स्थिति में रखना महत्वपूर्ण है। एक निरंतर अभिविन्यास रखने से अधिक डीआरजी वर्गों को प्राप्त करने में मदद मिलती है, अन्यथा डीआरजी को ऊपर से नीचे तक पूरी तरह से काटा नहीं जा सकता है, और कुछ डीआरजी नमूने छोड़ दिए जाएंगे और बर्बाद हो जाएंगे। तीसरा, बेस ओसीटी और कवर ओसीटी दोनों के ऊपरी किनारे एल्यूमीनियम ब्लॉक के ऊपरी किनारे पर होने चाहिए। इस तरह, एल्यूमीनियम ब्लॉक का ऊपरी किनारा ग्लास स्लाइड को डीआरजी सेक्शन लेने से नहीं रोकेगा। चौथा, पड़ोसी डीआरजी अनुभागों के ओसीटी के भीतर डीआरजी अनुभाग डालने से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि दूसरा डीआरजी अनुभाग सीधे ग्लास स्लाइड पर नहीं चिपकेगा, और इस प्रकार बाद की प्रक्रिया में आसानी से धोया जा सकता है।
डीआरजी क्रायोसेक्शनिंग दर्द और खुजली 1,2 के तंत्र में डीआरजी की जांच में एक बहुत ही महत्वपूर्ण तकनीक है। हालांकि, माउस डीआरजी की बहुत कम मात्रा के कारण, माउस डीआरजी नमूनों के उचित क्रायोस्टेट वर्गों को एकत्र करना अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है। एक बड़ी समस्या यह है कि डीआरजी युक्त ओसीटी अनुभाग एक रोल में मुड़ जाते हैं, जिससे वर्गों को ग्लास स्लाइड पर रखना मुश्किल हो जाता है। एक और समस्या यह है कि, क्योंकि माउस डीआरजी नमूना बहुत पतला है, यदि क्रायोसेक्शनिंग सेटिंग्स को अनुकूलित नहीं किया जाता है तो एक डीआरजी नमूने से पर्याप्त डीआरजी अनुभाग प्राप्त करना मुश्किल है। यहां, हमने माउस डीआरजी क्रायोसेक्शनिंग के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया, जिससे उच्च गुणवत्ता वाले डीआरजी वर्गों को इकट्ठा करना आसान और व्यावहारिक हो गया। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम एक माउस एल 4 डीआरजी से लगभग 16 निरंतर, उच्च गुणवत्ता वाले डीआरजी अनुभाग एकत्र करने में सक्षम हैं।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह ऊतक-समाशोधन तकनीक26 के रूप में प्रत्यक्ष 3 डी पुनर्निर्माण प्रदान नहीं कर सकता है। फिर भी, जैसा कि हम इस विधि के साथ निरंतर, उच्च गुणवत्ता वाले अनुभाग प्राप्त कर सकते हैं, हम 3 डी छवियों के पुनर्निर्माण के लिए इन निरंतर वर्गों से चित्र ले सकते हैं।
यद्यपि डीआरजी के क्रायोसेक्शनिंग के लिए प्रोटोकॉल 8-12 सप्ताह की आयु के युवा वयस्क चूहों से विकसित किया गया है, इस प्रोटोकॉल को छोटे या बड़े उम्र के चूहों से क्रायोसेक्शनिंग मानव डीआरजी और डीआरजी के लिए लागू किया जा सकता है। वास्तव में, इस प्रोटोकॉल को किसी भी मात्रा के नमूनों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए लागू किया जाना चाहिए।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
कोई नहीं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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