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Neuroscience

Ein Verfahren zur Kryosektion von Spinalganglien der Maus

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65232
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 2,4, 2, 1, 2
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco, 3Department of Anesthesiology, Sun Yat-Sen University, 4University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Vorgestellt wird die Entwicklung zur konsequent hochwertigen Erfassung von Kryostatschnitten der Spinalganglien.

Abstract

Qualitativ hochwertige Kryostatschnitte des Spinalganglions (DRG) der Maus sind entscheidend für eine ordnungsgemäße immunchemische Färbung und RNAscope-Studien bei der Erforschung von entzündlichen und neuropathischen Schmerzen, Juckreiz sowie anderen peripheren neurologischen Erkrankungen. Aufgrund der winzigen Probengröße des DRG-Gewebes bleibt es jedoch eine Herausforderung, konsistent qualitativ hochwertige, intakte und flache Kryostatschnitte auf Glasobjektträgern zu erhalten. Bisher gibt es keinen Artikel, der ein optimales Protokoll für die DRG-Kryosektion beschreibt. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Methode dar, um die häufig auftretenden Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der DRG-Kryosektion zu lösen. Der vorgestellte Artikel erklärt, wie man die umgebende Flüssigkeit aus den DRG-Gewebeproben entfernt, die DRG-Schnitte auf dem Objektträger mit der gleichen Ausrichtung platziert und die Abschnitte auf dem Glasobjektträger abflacht, ohne sich nach oben zu krümmen. Obwohl dieses Protokoll für die Kryosektion der DRG-Proben entwickelt wurde, kann es auch für die Kryosektion vieler anderer Gewebe mit einer kleinen Probengröße angewendet werden.

Introduction

Das Spinalganglion (DRG) enthält die primären sensorischen Neuronen, die Gewebemakrophagen und die Satellitenzellen, die die primären sensorischen Neuronen umgeben 1,2,3,4. Es ist eine wichtige anatomische Struktur bei der Verarbeitung harmloser und schädlicher Signale und spielt eine entscheidende Rolle bei Schmerzen, Juckreiz und verschiedenen peripheren Nervenerkrankungen 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Obwohl mehrere Methoden entwickelt wurden, um DRG-Gewebe aus dem Rückenmark der Maus zu präparieren14,15,16, bleibt die Kryosektion des DRG-Gewebes eine Herausforderung, da das DRG-Gewebe recht klein ist und Kryostatschnitte von DRG-Proben dazu neigen, sich zu Rollen zu krümmen, was es schwierig macht, die Kryostatabschnitte richtig auf Glasobjektträger zu übertragen. Die richtige Kryosektion des DRG-Gewebes ist jedoch entscheidend für immunhistochemische Untersuchungen und die Struktur der DRG-sensorischen Neuronen 17,18,19,20,21,22,23. Da die Ergebnisse der Einzelzell-RNA-Sequenzierung die bemerkenswerte Heterogenität der DRG-sensorischen Neuronen sowohl bei Menschen24 als auch bei Mäusen25 gezeigt haben, ist die richtige Kryosektion von DRG-Gewebe entscheidend für die Untersuchung der funktionellen Rolle verschiedener DRG-Zellen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Obwohl die Tissue-Clearing-Technik angewendet wurde, um die 3D-Rekonstruktion des DRG26 als alternative Technik der Kryosektion des DRG zu untersuchen, ist die Tissue-Clearing-Technik zeit- und arbeitsaufwändig. Im Vergleich dazu ist die Kryosektion des DRG schnell und relativ einfach durchzuführen und bleibt daher eine Schlüsseltechnik für Immunhistochemie und Strukturstudien des DRG und anderer Regionen des zentralen Nervensystems. Die Gewinnung qualitativ hochwertiger, intakter und flacher Kryostatschnitte auf Glasobjektträgern bleibt jedoch eine Herausforderung in der neurowissenschaftlichen Forschung, da die Probengröße von Geweben, wie dem DRG und bestimmten Hirnregionen, winzig ist, und es gibt derzeit keinen Artikel, der das optimale Protokoll für die Kryosektion kleiner Gewebeproben, wie z. B. Maus-DRGs, beschreibt.

Dieses Protokoll bietet eine einfache, Schritt-für-Schritt-Technik für die Kryostat-Sektion des Maus-DRG, um zuverlässig so viele hochwertige DRG-Schnitte auf den Objektträgern für nachfolgende DRG-Studien zu erhalten. Obwohl diese Technik speziell für die Kryosektion von DRG-Proben entwickelt wurde, kann sie möglicherweise auch für die Kryosektion verschiedener anderer Gewebe mit einer kleinen Probengröße verwendet werden.

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Protocol

Für die vorliegende Studie wurden die Tierversuche vom UCSF Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Hier wurden erwachsene, 8-12 Wochen alte männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (selbst gezüchtet) verwendet.

1. DRG-Probenvorbereitung

  1. Betäuben Sie die Mäuse mit 2,5% Avertin (siehe Materialtabelle). Sorgen Sie für eine ausreichende Anästhesie, indem Sie nicht auf schmerzhafte Stimulation reagieren. Die Tiere werden transkardial mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von 4% Formaldehyd perfundiert, wie zuvor beschrieben14,15,16.
  2. DRG-Gewebe aus dem Rückenmark sezieren, wie zuvor beschrieben14,15,16.
  3. Die präparierten DRGs werden 3 h lang bei Raumtemperatur in 4%igem Formaldehyd nachfixiert.
  4. Die DRGs werden über Nacht in 30%iger Saccharose in PBS bei 4 °C eingelegt.
  5. Vorbereiten der optimalen Schnitttemperatur (OCT)
    1. Fügen Sie die OCT-Mischung (siehe Materialtabelle) hinzu, um die Oberseite des Aluminiumblocks zu bedecken, und frieren Sie sie bei -20 °C für 5-10 Minuten ein (Abbildung 1A).
    2. Schneiden Sie die Oberseite des OCT mit dem Kryostaten (siehe Materialtabelle) mit einer Dicke von 30 μm ab, bis seine Oberfläche flach ist wie das Basis-OCT (Abbildung 1B).
    3. Machen Sie eine Markierung an der Unterseite (Sechs-Uhr-Position) des Basis-OCT, um seine Ausrichtung zu markieren, bevor Sie den Aluminiumblock vom Kryostaten entfernen (Abbildung 1C).
    4. Halten Sie in den folgenden Schritten die Markierung auf der Sechs-Uhr-Position, um die gleiche Ausrichtung beizubehalten, was dazu führen kann, dass Sie mehr Abschnitte der DRG-Probe erhalten.
      HINWEIS: Wenn die Orientierung verloren geht und die DRG-Probe in einem anderen Winkel geschnitten wird, kann die DRG-Probe nicht vollständig von oben nach unten geschnitten werden, wodurch einige Proben auf dem Basis-OCT ausgelassen und verschwendet werden, da das Basis-OCT beim Versuch, das DRG-Sample zu schneiden, angetroffen wird (Abbildung 1C).
  6. OCT-Einbettung von DRGs durchführen
    1. Trocknen Sie das DRG-Gewebe ab, bevor Sie es auf das OCT legen.
      1. Bevor Sie das DRG auf den Block geben, stellen Sie sicher, dass die 30%ige Saccharose/PBS-Lösung um die Probe herum entfernt wird.
      2. Trocknen Sie die DRG-Probe, indem Sie sie auf eine trockene Petrischale legen (Abbildung 2A) und zwei- oder dreimal mit einer trockenen Pinzette von einer Stelle zur anderen bewegen (Abbildung 2B).
      3. Trocknen Sie die Pinzette mit fusselfreiem Gewebe ab, bevor Sie eine weitere DRG-Probe bewegen (Abbildung 2C).
    2. Den trockenen DRG auf das Basis-OCT geben.
      1. Legen Sie das trockene DRG mit einer trockenen Pinzette auf das Basis-OCT an der 12-Uhr-Position (Abbildung 1D).
      2. Halten Sie mindestens 5 mm zwischen der Oberkante des DRG und der Oberkante des Basis-OCT.
      3. Legen Sie den dorsalen Teil des DRG auf die 12-Uhr-Position und den ventralen Teil auf die 6-Uhr-Position (Abbildung 1D).
    3. Betten Sie das DRG-Gewebe mit OCT ein.
      1. Fügen Sie weitere OCT hinzu, um die gesamte DRG-Probe in runder oder ovaler Form mit dem DRG in der Mitte abzudecken (Abbildung 1E).
      2. Achten Sie darauf, dass die Oberkante des OAT die DRG am oberen Rand des Basis-OAT bedeckt (Abbildung 1F), da dies die Übertragung des Schnitts auf den Objektträger erleichtert (Abbildung 3A).
        HINWEIS: Wenn sich das Deckel-OCT in der Mitte des Basis-OCT befindet, blockiert die Oberkante des Basis-OCT den Glasobjektträger, um den Abschnitt aufzufangen (Abbildung 3B).
      3. Die OCT- und DRG-Probe für weitere 5 Minuten bei -20 °C einfrieren (Abbildung 1G). Trimmen Sie das OAT nicht um die DRG-Probe herum.
      4. Schneiden Sie die Oberseite der Abdeckung OCT mit einer Dicke von 30 μm ab, bis das DRG sichtbar ist.

2. Kryosektion des DRG

  1. Ändern Sie die Dicke des Kryostatabschnitts auf 12 μm, um DRG-Abschnitte auf den Objektträger zu schneiden (Abbildung 1H).
  2. Halten Sie den OCT-Abschnitt mit einem kleinen Pinsel, der auf -20 °C abgekühlt ist, an der Unterseite.
    HINWEIS: Es ist wichtig, nicht den gesamten Abschnitt vollständig abzuschneiden, sondern 1-3 mm ungeschnitten zu lassen (Abbildung 1I).
  3. Berühren Sie mit dem Ende einer Pinzette bei Raumtemperatur vorsichtig die Unterseite (Sechs-Uhr-Position) des Abschnitts, damit er an der Oberfläche der Plattform haftet (Abbildung 1J). Dadurch wird verhindert, dass sich der Abschnitt in einer Rolle nach hinten krümmt, was das Auffangen des Abschnitts auf dem Schlitten erschwert.
    HINWEIS: Wenn die Unterseite des Abschnitts an der Oberfläche der Plattform klebt und die Oberseite des Abschnitts noch mit dem Deckel-OCT verbunden ist, hat der Abschnitt eine flache Form (Abbildung 1K), was das Sammeln des Abschnitts auf der Rutsche erheblich erleichtert.
  4. Nehmen Sie einen Objektträger aus geladenem Glas (siehe Materialtabelle) und legen Sie den Objektträger langsam über den Abschnitt. Sobald der Abschnitt anfängt, am Schlitten zu kleben, ziehen Sie den Schlitten vorsichtig nach hinten (Abbildung 1L).
  5. Führen Sie den gleichen Vorgang aus, um mehr DRG-Abschnitte auf die Folie zu bringen, ohne die Abschnitte zu überlappen (Abbildung 1M). Stellen Sie sicher, dass ein neuer DRG-Abschnitt nicht über dem OCT eines anderen DRG-Abschnitts platziert wird (Abbildung 4), da ein solcher Abschnitt nicht gut auf dem Objektträger bleiben kann und während des immunchemischen Färbeprozesses weggespült werden kann.

3. Nissl-Färbung des DRG-Abschnitts auf dem Objektträger

  1. Waschen Sie die Abschnitte 10 Minuten lang in PBS plus 0,1 % Triton X-10. Waschen Sie die Abschnitte dann zweimal mit PBS.
  2. Tragen Sie eine Nissl-Färbung im Maßstab 1:300 (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger auf und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  3. Waschen Sie den Abschnitt mit PBS plus 0,1 % Triton X-100. Waschen Sie die Abschnitte dann zweimal 5 Minuten lang mit PBS und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur.
  4. Tragen Sie 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Fluoromount-G auf (siehe Materialtabelle), um die Abschnitte mit einem Deckglas abzudecken.

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Representative Results

In der aktuellen Studie wurden etwa 16 kontinuierliche, qualitativ hochwertige DRG-Schnitte von einem L4-DRG der Maus gesammelt. Die erhaltenen Schnitte waren ohne jegliche Verzerrung. Abbildung 1 zeigt die Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise für die Kryoschnittung. Die Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit aus den Gewebeschnitten ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Prozess der OCT-Einbettung des Gewebes ist in Abbildung 3 dargestellt. Abbildung 4 zeigt die korrekte Platzierung der DRG-Abschnitte auf den Objektträgern. Abbildung 5 zeigt die konfokale Fluoreszenzmikroskopie der physiologischen Struktur von DRG-Schnitten der Maus. Die Nissl-Färbung zeigt die unterschiedlich großen DRG-sensorischen Neuronen, und die DAPI-Färbung zeigt die Zellen, die die Neuronen umgeben. Dieses Bild zeigt die Qualität der DRG-Schnitte, die mit diesem Protokoll erhalten wurden. Für die immunhistochemischen Untersuchungen der DRG, einschließlich der Untersuchung verschiedener Neuronentypen in der DRG, können verschiedene Antikörper verwendet werden.

Figure 1
Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Kryosektion von Maus-DRGs . (A) OCT wird auf der Oberseite des Aluminiumblocks eingefroren. (B) Die Oberseite des OCT wird flach abgeschnitten. (C) Eine Markierung wird am unteren Rand (Sechs-Uhr-Position) des Basis-OCT angebracht. (D) Das DRG wird auf das Basis-OCT aufgesetzt, wobei der ventrale Teil der Markierung zugewandt ist. (E) Es werden weitere OCT hinzugefügt, um die gesamte DRG-Stichprobe abzudecken. (F) Der obere Rand des OCT, der das DRG abdeckt, muss sich am oberen Rand des Basis-OCT befinden. (G) Das Deck-OCT und die DRG-Probe sind eingefroren. (H) Die Oberseite des Deckel-OCT wird abgeschnitten, bis das DRG-Gewebe sichtbar ist (markiert mit dem roten Pfeil). (I) Die OCT-Sektion wird mit einem vorgekühlten Pinsel an der Unterseite gehalten. (J) Die Unterseite des Abschnitts wird mit dem Ende einer bei Raumtemperatur angebrachten Pinzette auf die Oberfläche der Plattform geklebt. (K) Eine weitere Ansicht von (J) zeigt, dass die Unterseite der Sektion an der Oberfläche der Plattform klebt und die Oberseite immer noch mit der Abdeckung OCT verbunden ist. (L) Die Sektion ist auf einen Glasschlitten geklebt. (M) Derselbe Vorgang wird wiederholt, um mehr DRG-Abschnitte ohne überlappende Abschnitte auf den Schlitten zu bekommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Technik zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit aus dem DRG-Gewebe . (A) Das DRG-Gewebe wird direkt aus einer 30%igen Saccharoselösung, die viel Flüssigkeit enthält, auf eine trockene Petriplatte gelegt. (B) Das DRG-Gewebe wird mit einer trockenen Pinzette an eine benachbarte Stelle auf der Petriplatte bewegt, um die überschüssige umgebende Flüssigkeit zu entfernen. (C) Die Pinzette wird jedes Mal nach dem Bewegen des DRG-Gewebes mit einem fusselfreien Tuch getrocknet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Wie wichtig es ist, das Cover-OCT richtig auf das Basis-OCT zu setzen. (A) Der ideale Platz des Cover-OCT: (A-1) Der obere Rand des OCT, das DRG-Gewebe bedeckt, sollte sich am oberen Rand des Basis-OCT befinden. (A-2) Der Abschnitt sollte nicht vollständig geschnitten werden, sondern ein kleiner Teil mit der Oberkante des Cover-OCT verbunden sein. (A-3) Der Schnitt wird sanft auf den Objektträger übertragen. (A-4) Die Zeichnung zeigt, dass es in Bezug auf den Querschnitt am oberen Rand einfach ist, den Ausschnitt auf den Objektträger zu übertragen. Die schwarze, geschwungene Linie zeigt den geschnittenen Abschnitt an. (B) Unsachgemäße Position der Abdeckung OCT. (B-1) Das OCT, das DRG-Gewebe abdeckt, wird in der Mitte des Basis-OCT platziert. (B-2) Der Abschnitt ist nicht vollständig geschnitten, mit einem kleinen Teil, der mit der oberen Kante des Deckels OCT verbunden ist. (B-3) Die obere Kante des Aluminiumblocks verhindert, dass der Glasobjektträger den Abschnitt berührt. Die roten Pfeile zeigen den Abstand zwischen dem Objektträger und dem geschnittenen Abschnitt an. (B-4) Die Zeichnung zeigt, dass der Objektträger blockiert ist, bevor er den Abschnitt berührt. Die schwarze, geschwungene Linie zeigt den geschnittenen Abschnitt an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Die richtige Platzierung der DRG-Abschnitte auf dem Objektträger. (A) Die richtige Methode, um die DRG-Abschnitte nebeneinander zu platzieren, ohne die DRG-Sektion und die OCT der anderen DRG-Sektionen zu überlappen. (B) Die falsche Methode, die DRG-Abschnitte auf dem OAT einer anderen DRG-Sektion zu platzieren. Da der zweite DRG-Abschnitt nicht direkt auf dem Objektträger haftet, kann er bei den nachfolgenden Prozessen leicht abgewaschen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Nissl-Färbung der Maus L4 DRG. Ein Beispiel für ein 20-fach konfokales Bild eines L4-DRG-Schnitts der Maus. Grün steht für Nissl (Neuron) und Rot für DAPI (Zellkern). Der Maßstabsbalken stellt 50 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll bietet ein einfaches Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Kryostat-Sektion des Maus-DRG, um zuverlässig qualitativ hochwertige DRG-Schnitte auf Objektträgern zu erhalten. Dieses Protokoll besteht aus vier kritischen Schritten. Zuerst müssen die DRG-Probe und die Pinzette trocken sein, bevor die DRG-Probe auf das Basis-OCT gelegt wird. Jede Flüssigkeit, die die DRG-Probe umgibt, bildet eine Eishülle um sie herum, was dazu führt, dass sich DRG-Abschnitte vom OCT lösen und nach oben krümmen. Zweitens, wenn der Aluminiumblock keine Markierung hat oder wenn das Basis-OCT die Markierung verdeckt, ist es wichtig, eine Markierung am unteren Rand (Sechs-Uhr-Position) des Basis-OCT zu machen und diese Markierung während des gesamten Prozesses auf der Sechs-Uhr-Position zu halten. Eine konstante Orientierung hilft, mehr DRG-Abschnitte zu erhalten, da sonst das DRG nicht vollständig von oben nach unten geschnitten werden kann und einige DRG-Proben weggelassen und verschwendet werden. Drittens müssen sich die oberen Kanten sowohl des Basis-OCT als auch des Cover-OCT an der Oberkante des Aluminiumblocks befinden. Auf diese Weise wird die Oberkante des Aluminiumblocks den Glasschlitten nicht daran hindern, die DRG-Abschnitte aufzunehmen. Viertens ist es wichtig, den DRG-Abschnitt nicht in das OAT benachbarter DRG-Abschnitte zu legen, da der zweite DRG-Abschnitt nicht direkt auf dem Objektträger haften bleibt und daher im nachfolgenden Prozess leicht weggespült werden kann.

Die DRG-Kryosektion ist eine sehr wichtige Technologie bei der Untersuchung von DRGs in den Mechanismen von Schmerz und Juckreiz 1,2. Aufgrund des sehr geringen Volumens an Maus-DRGs ist es jedoch oft schwierig, geeignete Kryostatschnitte von Maus-DRG-Proben zu sammeln. Ein großes Problem ist, dass die DRG-haltigen OCT-Abschnitte dazu neigen, sich zu einer Rolle zu krümmen, was das Auflegen der Abschnitte auf die Objektträger erschwert. Ein weiteres Problem besteht darin, dass es aufgrund der sehr dünnen DRG-Probe der Maus schwierig ist, genügend DRG-Schnitte aus einer DRG-Probe zu erhalten, wenn die Kryoschnitteinstellungen nicht optimiert sind. Hier haben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die DRG-Kryosektion von Mäusen vorgestellt, das das Sammeln hochwertiger DRG-Schnitte einfach und praktisch macht. Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, etwa 16 kontinuierliche, qualitativ hochwertige DRG-Abschnitte von einer Maus L4 DRG zu sammeln.

Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass es keine direkte 3D-Rekonstruktion wie die Gewebereinigungstechnik26 bereitstellen kann. Da wir mit dieser Methode jedoch kontinuierliche, qualitativ hochwertige Schnitte erhalten können, können wir Bilder aus diesen kontinuierlichen Abschnitten nehmen, um 3D-Bilder zu rekonstruieren.

Obwohl das Protokoll für die Kryosektion von DRGs von jungen erwachsenen Mäusen im Alter von 8-12 Wochen entwickelt wurde, kann dieses Protokoll für die Kryosektion von menschlichen DRGs und DRGs von Mäusen jüngeren oder höheren Alters angewendet werden. In der Tat sollte dieses Protokoll für die Kryosektion beliebiger Volumenproben angewendet werden können.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Nichts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avertin Sigma-Aldrich T48402-25G Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched Fisherbrand 1910 Hold the OCT section at the bottom 
Ergo Tweezers Fisherbrand S95310 Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll 
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 To collect the DRG section 
Marking pens Fisherbrand 133794  Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisherbrand  23730571 Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).

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