Summary
这里介绍的是持续获得高质量背根神经节低温恒温器切片的发展。
Abstract
在炎症和神经性疼痛、瘙痒以及其他周围神经系统疾病的研究中，高质量的小鼠背根神经节 （DRG） 低温恒温器切片对于适当的免疫化学染色和 RNAscope 研究至关重要。然而，由于 DRG 组织的样本量很小，因此在载玻片上始终如一地获得高质量、完整和扁平的低温恒温器切片仍然是一个挑战。到目前为止，还没有文章描述DRG冷冻切片的最佳方案。该协议提供了一种分步方法，以解决与DRG冷冻切片相关的常见困难。本文解释了如何从DRG组织样品中去除周围的液体，将DRG切片朝向相同的方向放置在载玻片上，并在不弯曲的情况下压平载玻片上的切片。尽管该协议是为冷冻切除DRG样品而开发的，但它可以应用于许多其他样品量小的组织冷冻切片。
Introduction
背根神经节 （DRG） 包含初级感觉神经元、组织巨噬细胞和围绕初级感觉神经元的卫星细胞 1,2,3,4。它是处理无害和有害信号的关键解剖结构，在疼痛、瘙痒和各种周围神经疾病中起关键作用5、6、7、8、9、10、11、12、13。尽管已经开发了几种方法来解剖小鼠脊髓的 DRG 组织14,15,16，但由于 DRG 组织非常小，并且 DRG 样品的低温恒温器切片往往会弯曲成卷，因此很难将低温恒温器切片正确地转移到载玻片上。然而，DRG 组织的正确冷冻切片对于免疫组化研究和 DRG 感觉神经元的结构至关重要17、18、19、20、21、22、23。此外，由于单细胞RNA测序结果揭示了人类24和小鼠25中DRG感觉神经元的显着异质性，因此对DRG组织进行适当的冷冻切片对于研究不同DRG细胞在各种生理和病理条件下的功能作用至关重要。
尽管组织透明化技术已被应用于研究 DRG26 的 3D 重建，作为冷冻切除 DRG 的替代技术，但组织透明化技术既费时又费力。相比之下，DRG的冷冻切片快速且相对容易执行，因此它仍然是DRG和中枢神经系统其他区域的免疫组化和结构研究的关键技术。然而，在载玻片上获得高质量、完整和扁平的低温恒温器切片仍然是神经科学研究中的一个挑战，因为组织的样本量很小，如DRG和某些大脑区域，并且目前没有文章描述冷冻切片小尺寸组织样本的最佳方案，如小鼠DRG。
该协议为小鼠DRG的低温恒温器切片提供了一种简单的分步技术，以可靠地在载玻片上获得尽可能多的高质量DRG切片，用于后续的DRG研究。虽然该技术专为冷冻切除 DRG 样品而设计，但可用于冷冻切除样品量较小的各种其他组织。
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Protocol
在本研究中，动物实验得到了加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。这里使用8-12周龄的成年C57BL / 6雄性和雌性小鼠（内部繁殖）。
1. DRG样品制备
- 用2.5%Avertin麻醉小鼠（参见材料表）。通过对疼痛刺激缺乏反应来确保充分麻醉。如前所述，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）然后用4%甲醛经心灌注动物，如前所述14,15,16。
- 从脊髓解剖 DRG 组织，如前所述14,15,16。
- 在室温下将解剖的DRGs在4%甲醛中固定3小时。
- 将DRGs置于30%蔗糖的PBS中，在4°C过夜。
- 准备基础最佳切削温度 （OCT）
- 加入OCT化合物（参见 材料表）以覆盖铝块的顶面，并在-20°C下冷冻5-10分钟（图1A）。
- 使用低温恒温器（参见 材料表）切掉 OCT 的顶部，厚度为 30 μm，直到其表面平坦为基础 OCT（图 1B）。
- 在将铝块从低温恒温器上取下之前，在底座 OCT 的底部（六点钟位置）做一个标记以标记其方向（图 1C）。
- 在以下步骤中，将标记保持在六点钟位置以保持相同的方向，这可能会导致获得 DRG 样品的更多部分。
注意：如果失去方向并且以不同的角度切割 DRG 样品，则 DRG 样品无法从上到下完全切割，这将在基础 OCT 上留下一些样品并浪费，因为在尝试切割 DRG 样品时会遇到基础 OCT（图 1C）。
- 执行 DRG 的 OCT 嵌入
- 在将 DRG 组织放在 OCT 上之前将其擦干。
- 在将 DRG 添加到模块上之前，确保去除样品周围的 30% 蔗糖/PBS 溶液。
- 通过将DRG样品放在干燥的培养皿上干燥DRG样品（图2A），并用干镊子将其从一个位置移动到另一个位置两到三次（图2B）。
- 在移动另一个DRG样品之前，用无绒组织擦干镊子（图2C）。
- 将干燥的 DRG 放在底座 OCT 上。
- 用干镊子将干燥的DRG放在12点钟位置的底座OCT上（图1D）。
- 在 DRG 的上边缘和基础 OCT 的上边缘之间至少保持 5 毫米的距离。
- 将DRG的背部放在12点钟位置，将腹侧放在6点钟位置（图1D）。
- 用 OCT 包埋 DRG 组织。
- 添加更多的OCT以圆形或椭圆形覆盖整个DRG样品，DRG位于中心（图1E）。
- 确保 OCT 的上边缘覆盖基础 OCT 上边缘的 DRG（图 1F），因为这样可以更轻松地将截面转移到载玻片上（图 3A）。
注意：如果盖子 OCT 位于基础 OCT 的中间，则基础 OCT 的上边缘将阻挡载玻片以收集该部分（图 3B）。 - 将覆盖的OCT和DRG样品在-20°C下再冷冻5分钟（图1G）。不要在 DRG 样品周围修剪 OCT。
- 切掉 30 μm 厚的盖子 OCT 的顶部，直到 DRG 可见。
- 在将 DRG 组织放在 OCT 上之前将其擦干。
2. DRG的冷冻切片
- 将低温恒温器截面厚度更改为12μm，将DRG截面切割到载玻片上（图1H）。
- 用冷却至-20°C的小画笔将OCT部分保持在底部。
注意：重要的是不要完全切割整个部分，而是保留 1-3 毫米未切割（图 1I）。 - 使用室温镊子的末端轻轻触摸该部分的底部（六点钟位置），使其粘在平台表面上（图 1J）。这样可以防止截面卷曲，从而难以在载玻片上收集截面。
注意：当截面的底部粘在平台表面上，并且截面的顶部仍然与盖子 OCT 连接时，该截面呈扁平形状（图 1K），这使得在载玻片上收集截面变得更加容易。 - 取一个带电的载玻片（参见 材料表），然后慢慢地将载玻片放在切片上。一旦该部分开始粘在载玻片上，轻轻地向后拉载玻片（图1L）。
- 按照相同的过程将更多的 DRG 部分放到载玻片上，而不会与这些部分重叠（图 1M）。确保新的 DRG 切片未放置在另一个 DRG 切片的 OCT 上（图 4），因为这样的切片不能很好地留在载玻片上，并且可以在免疫化学染色过程中被洗掉。
3.载玻片上DRG部分的尼氏染色
- 在PBS和0.1%Triton X-10中洗涤切片10分钟。然后，用PBS洗涤切片两次。
- 将 1：300 Nissl 染色剂（参见 材料表）涂在载玻片上，并在室温下孵育 20 分钟。
- 用PBS加0.1%Triton X-100洗涤切片。然后，用PBS洗涤切片两次，每次5分钟，然后在室温下洗涤2小时。
- 应用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） fluoromount-G（参见 材料表）用盖玻片覆盖切片。
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Representative Results
目前的研究从一只小鼠 L4 DRG 中收集了大约 16 个连续的高质量 DRG 切片。获得的部分没有任何失真。 图 1 描述了冷冻切片的分步过程。从组织切片中去除多余的液体如图 2 所示。 OCT包埋组织的过程如图3所示。 图 4 显示了载玻片上 DRG 部分的正确位置。 图5 显示了小鼠DRG切片生理结构的共聚焦荧光显微镜图像。Nissl 染色显示各种大小的 DRG 感觉神经元，DAPI 染色显示神经元周围的细胞。该图像演示了使用此协议获得的 DRG 部分的质量。不同的抗体可以应用于DRG的免疫组化研究，包括研究DRG中的不同神经元类型。
图 1：冷冻切片小鼠 DRG 的分步程序 。 （A） OCT 冷冻在铝块的顶面上。（B） OCT 的顶部被切平。（C） 在底座 OCT 的底部（六点钟位置）做一个标记。 （D） 将 DRG 放在底座 OCT 上，腹侧部分朝向标记。（E） 添加更多 OCT 以覆盖整个 DRG 样本。（F） 覆盖 DRG 的 OCT 的上边缘需要位于基础 OCT 的上边缘。 （G） 覆盖 OCT 和 DRG 样品被冻结。（H） 将 OCT 盖的顶部切掉，直到 DRG 组织可见（用红色箭头标记）。（I） 用预冷的画笔将 OCT 部分固定在底部。（J） 使用室温镊子的末端将截面底部粘在平台表面上。（K） （J） 的另一视图显示，截面的底部粘在平台表面上，顶部仍然与盖板 OCT 连接。 （L） 截面粘在载玻片上。（M） 重复相同的过程，以将更多的 DRG 部分放到幻灯片上，而不会出现重叠的部分。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：从 DRG 组织中去除多余液体的技术 。 （A） 将DRG组织直接从30%蔗糖溶液中置于干燥的培养皿上，该溶液周围有很多液体。（B） 使用干镊子将 DRG 组织移动到培养皿上的相邻位置，以除去多余的周围液体。（C） 每次移动 DRG 组织后，每次用无绒擦拭物擦干镊子。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：将盖子 OCT 正确放置在底座 OCT 上的重要性。 （A） 盖子 OCT 的理想位置： （A-1） 覆盖 DRG 组织的 OCT 的上边缘应位于底座 OCT 的上边缘。 （A-2） 切片不应完全切割，一小部分连接到盖子 OCT 的上边缘。 （A-3） 将切片顺利转移到载玻片上。（答-4）从图中可以看出，就上边缘的截面而言，很容易将截面转移到载玻片上。黑色曲线表示已切割的部分。（B） 盖子位置不当 OCT. （B-1） 覆盖 DRG 组织的 OCT 放置在底座 OCT 的中心。 （B-2） 截面未完全切割，一小部分连接到盖子 OCT 的上边缘。 （B-3） 铝块的上边缘可防止载玻片接触截面。红色箭头表示载玻片和切割截面之间的距离。（B-4）从图中可以看出，载玻片在接触截面之前被挡住了。黑色曲线表示已切割的部分。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：DRG 部分在载玻片上的正确位置。 （A） 将 DRG 部分并排放置而不重叠 DRG 部分和其他 DRG 部分的 OCT 的正确方法。（B） 将 DRG 部分放置在另一个 DRG 部分的 OCT 上的错误方法。由于第二个DRG部分不会直接粘在载玻片上，因此在后续过程中可以很容易地将其冲走。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：小鼠 L4 DRG 的 Nissl 染色。 小鼠 L4 DRG 切片的 20 倍共聚焦图像示例。绿色表示 Nissl（神经元），红色表示 DAPI（细胞核）。比例尺表示 50 mm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议为小鼠DRG的低温恒温器切片提供了简单的分步程序，以可靠地在载玻片上获得高质量的DRG切片。该协议有四个关键步骤。首先，在将 DRG 样品放到基础 OCT 上之前，必须将 DRG 样品和镊子干燥。DRG 样品周围的任何液体都会在其周围形成冰壳，导致 DRG 部分与 OCT 分离并向上弯曲。其次，如果铝块没有标记，或者如果底座 OCT 覆盖了标记，则重要的是在底座 OCT 的底部（六点钟位置）做一个标记，并在整个过程中将该标记保持在六点钟位置。保持恒定的方向有助于获得更多的 DRG 截面，否则 DRG 无法从上到下完全切割，并且一些 DRG 样品将被遗漏和浪费。第三，底座 OCT 和盖板 OCT 的上边缘都必须位于铝块的上边缘。这样，铝块的上边缘不会阻挡载玻片带走DRG部分。第四，避免将DRG截面放在相邻DRG截面的OCT内，因为第二个DRG截面不会直接粘在载玻片上，因此在后续过程中很容易被冲走。
DRG 冷冻切片是研究 DRG 在疼痛和瘙痒机制中的一项非常重要的技术 1,2。然而，由于小鼠 DRG 的体积非常小，因此收集小鼠 DRG 样品的适当低温恒温器切片通常具有挑战性。一个主要问题是，含有 DRG 的 OCT 部分往往会弯曲成卷，因此很难将这些部分放在载玻片上。另一个问题是，由于小鼠DRG样品非常薄，如果不优化冷冻切片设置，很难从一个DRG样品中获得足够的DRG切片。在这里，我们提出了小鼠DRG冷冻切片的分步方案，使收集高质量DRG切片变得简单实用。通过该协议，我们能够从一只小鼠 L4 DRG 中收集大约 16 个连续的高质量 DRG 切片。
该协议的一个局限性是它不能提供直接的3D重建作为组织透明化技术26。然而，由于我们可以用这种方法获得连续的、高质量的截面，我们可以从这些连续截面中获取图像来重建 3D 图像。
尽管DRGs冷冻切片的方案是从8-12周龄的年轻成年小鼠中开发的，但该方案可用于冷冻切片人类DRG和来自年轻或老年小鼠的DRG。事实上，该协议应该能够应用于任何体积样品的冷冻切片。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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