Summary
Nous présentons ici le développement permettant d’acquérir systématiquement des coupes de cryostat ganglionnaire de racine dorsale de haute qualité.
Abstract
Des coupes de cryostat de ganglion de la racine dorsale (DRG) de souris de haute qualité sont cruciales pour une coloration immunochimique appropriée et des études RNAscopique dans la recherche de douleurs inflammatoires et neuropathiques, de démangeaisons, ainsi que d’autres affections neurologiques périphériques. Cependant, il reste difficile d’obtenir systématiquement des coupes de cryostat de haute qualité, intactes et plates sur des lames de verre en raison de la petite taille de l’échantillon du tissu DRG. Jusqu’à présent, il n’existe pas d’article décrivant un protocole optimal pour la cryosection DRG. Ce protocole présente une méthode étape par étape pour résoudre les difficultés fréquemment rencontrées associées à la cryosection DRG. L’article présenté explique comment retirer le liquide environnant des échantillons de tissus DRG, placer les sections DRG sur la lame orientées dans la même orientation et aplatir les sections sur la lame de verre sans se courber. Bien que ce protocole ait été développé pour la cryosection des échantillons DRG, il peut être appliqué pour la cryosection de nombreux autres tissus avec une petite taille d’échantillon.
Introduction
Le ganglion de la racine dorsale (DRG) contient les neurones sensoriels primaires, les macrophages tissulaires et les cellules satellites qui entourent les neurones sensoriels primaires 1,2,3,4. Il s’agit d’une structure anatomique clé dans le traitement des signaux inoffensifs et nocifs, et joue un rôle essentiel dans la douleur, les démangeaisons et divers troubles des nerfs périphériques 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Bien que plusieurs méthodes aient été mises au point pour disséquer le tissu DRG de la moelle épinière de souris14,15,16, la cryosection du tissu DRG reste difficile car le tissu DRG est assez petit et les sections cryostat des échantillons DRG ont tendance à se courber en rouleaux, ce qui rend difficile le transfert correct des sections du cryostat sur des lames de verre. Cependant, une cryosection correcte du tissu DRG est cruciale pour les études d’immunohistochimie et la structure des neurones sensoriels DRG 17,18,19,20,21,22,23. De plus, comme les résultats du séquençage de l’ARN unicellulaire ont révélé l’hétérogénéité remarquable des neurones sensoriels DRG chez l’homme24 et la souris25, une cryosection appropriée du tissu DRG est essentielle pour étudier le rôle fonctionnel de différentes cellules DRG dans diverses conditions physiologiques et pathologiques.
Bien que la technique d’élimination des tissus ait été appliquée pour étudier la reconstruction 3D du DRG26 en tant que technique alternative de cryosection du DRG, la technique d’élimination des tissus prend du temps et de la main-d’œuvre. En comparaison, la cryosection du DRG est rapide et relativement facile à réaliser, et reste donc une technique clé pour l’immunohistochimie et l’étude de la structure du DRG et d’autres régions du système nerveux central. Cependant, l’obtention de coupes de cryostat de haute qualité, intactes et plates sur des lames de verre reste un défi dans la recherche en neurosciences en raison de la petite taille de l’échantillon de tissus, comme le DRG et certaines régions du cerveau, et il n’y a pas d’article décrivant le protocole optimal à ce stade pour la cryosection d’échantillons de tissus de petite taille, tels que les DRG de souris.
Ce protocole fournit une technique simple, étape par étape, pour la section cryostatique du DRG de souris afin d’obtenir de manière fiable autant de sections DRG de haute qualité sur les lames pour les études DRG ultérieures. Bien qu’elle soit spécialement conçue pour la cryosection d’échantillons DRG, cette technique peut potentiellement être utilisée pour cryosectionner divers autres tissus avec une petite taille d’échantillon.
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Protocol
Pour la présente étude, les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’UCSF et ont été menées conformément au guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris mâles et femelles C57BL/6 adultes, âgées de 8 à 12 semaines (élevées en interne) ont été utilisées ici.
1. Préparation de l’échantillon DRG
- Anesthésier les souris avec 2,5 % d’Avertin (voir le tableau des matériaux). Assurer une anesthésie adéquate par l’absence de réponse à la stimulation douloureuse. Perfuser les animaux par voie transcardique avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de 4% de formaldéhyde, comme décrit précédemment14,15,16.
- Disséquer le tissu DRG de la moelle épinière, comme décrit précédemment14,15,16.
- Post-fixer les DRG disséqués dans du formaldéhyde à 4 % pendant 3 h à température ambiante.
- Mettez les DRG dans 30 % de saccharose dans du PBS à 4 °C pendant la nuit.
- Préparation de la température de coupe optimale (OCT) de la base
- Ajouter le composé OCT (voir le tableau des matériaux) pour couvrir la surface supérieure du bloc d’aluminium et congeler à -20 °C pendant 5 à 10 minutes (figure 1A).
- Coupez le haut de l’OCT à l’aide du cryostat (voir Tableau des matériaux) à 30 μm d’épaisseur jusqu’à ce que sa surface soit plane comme l’OCT de base (Figure 1B).
- Faites une marque en bas (position six heures) de l’OCT de base pour marquer son orientation, avant de retirer le bloc d’aluminium du cryostat (Figure 1C).
- Dans les étapes suivantes, maintenez la marque à la position six heures pour conserver la même orientation, ce qui peut conduire à l’obtention d’un plus grand nombre de sections de l’échantillon DRG.
REMARQUE : Si l’orientation est perdue et que l’échantillon DRG est coupé à un angle différent, l’échantillon DRG ne peut pas être coupé complètement de haut en bas, ce qui laissera certains échantillons laissés de côté sur l’OCT de base et gaspillés, car l’OCT de base sera rencontré lors de la tentative de coupe de l’échantillon DRG (Figure 1C).
- Exécution de l’intégration OCT des DRG
- Séchez le tissu DRG avant de le mettre sur l’OCT.
- Avant d’ajouter le DRG sur le bloc, assurez-vous d’éliminer la solution de saccharose/PBS à 30 % autour de l’échantillon.
- Séchez l’échantillon DRG en le plaçant sur une boîte de Pétri sèche (Figure 2A) et en le déplaçant d’un endroit à un autre deux ou trois fois avec une pince à épiler sèche (Figure 2B).
- Séchez la pince à épiler avec un mouchoir non pelucheux avant de déplacer un autre échantillon de DRG (Figure 2C).
- Placez le DRG sec sur l’OCT de base.
- À l’aide d’une pince à épiler sèche, placez le DRG sec sur l’OCT de base à la position 12 heures (Figure 1D).
- Gardez au moins 5 mm entre le bord supérieur du DRG et le bord supérieur de l’OCT de base.
- Placez la partie dorsale du DRG à la position 12 heures et la partie ventrale à la position six heures (Figure 1D).
- Intégrez le tissu DRG avec l’OCT.
- Ajouter plus d’OCT pour couvrir l’ensemble de l’échantillon DRG dans une forme ronde ou ovale, avec le DRG au centre (Figure 1E).
- Assurez-vous que le bord supérieur de l’OCT recouvre le DRG au niveau du bord supérieur de l’OCT de base (Figure 1F), car cela facilite le transfert de la section sur la lame de verre (Figure 3A).
REMARQUE : Si l’OCT du couvercle se trouve au milieu de l’OCT de base, le bord supérieur de l’OCT de base bloquera la lame de verre pour recueillir la section (Figure 3B). - Congeler l’échantillon OCT et DRG du couvercle à -20 °C pendant encore 5 minutes (Figure 1G). Ne coupez pas l’OCT autour de l’échantillon DRG.
- Coupez le haut de la couverture OCT à une épaisseur de 30 μm jusqu’à ce que le DRG soit visible.
- Séchez le tissu DRG avant de le mettre sur l’OCT.
2. Cryosection du DRG
- Modifiez l’épaisseur de la section du cryostat à 12 μm pour couper des sections DRG sur la lame (Figure 1H).
- Tenez la section OCT en bas avec un petit pinceau refroidi à -20 °C.
REMARQUE : Il est important de ne pas couper complètement toute la section, mais de laisser 1 à 3 mm non coupés (Figure 1I). - À l’aide de l’extrémité d’une pince à épiler à température ambiante, touchez doucement le bas (position six heures) de la section afin qu’elle adhère à la surface de la plate-forme (Figure 1J). Cela empêche la section de se courber en rouleau, ce qui rend difficile la collecte de la section sur la glissière.
REMARQUE : Lorsque le bas de la section adhère à la surface de la plate-forme et que le haut de la section est toujours connecté à l’OCT du couvercle, la section est de forme plate (Figure 1K), ce qui facilite grandement la collecte de la section sur la diapositive. - Prenez une lame de verre chargée (voir le tableau des matériaux) et placez-la lentement sur la section. Dès que la section commence à coller à la glissière, tirez doucement la lame vers l’arrière (Figure 1L).
- Suivez le même processus pour placer plus de sections DRG sur la lame sans chevaucher les sections (Figure 1M). Assurez-vous qu’une nouvelle section de DRG n’est pas placée sur l’OCT d’une autre section de DRG (Figure 4), car une telle section ne peut pas rester bien sur la lame et peut être emportée pendant le processus de coloration immunochimique.
3. Coloration Nissl de la section DRG sur la lame de verre
- Lavez les sections pendant 10 min dans du PBS plus 0,1 % de Triton X-10. Ensuite, lavez les sections deux fois avec du PBS.
- Appliquez une teinture Nissl 1 :300 (voir tableau des matériaux) sur la lame et incubez pendant 20 minutes à température ambiante.
- Lavez la section avec du PBS plus 0,1 % de Triton X-100. Ensuite, lavez les sections deux fois avec du PBS pendant 5 min, puis pendant 2 h à température ambiante.
- Appliquer le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) fluoromount-G (voir le tableau des matériaux) pour recouvrir les sections d’une lamelle.
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Representative Results
La présente étude a recueilli environ 16 coupes de DRG continues et de haute qualité à partir d’un DRG L4 de souris. Les sections obtenues étaient sans aucune distorsion. La figure 1 illustre la procédure étape par étape pour la cryosection. L’élimination de l’excès de liquide des coupes de tissu est illustrée à la figure 2. Le processus d’intégration des tissus dans le cadre de l’OCT est mis en évidence à la figure 3. La figure 4 montre l’emplacement correct des sections DRG sur les lames de verre. La figure 5 montre l’image de microscopie confocale à fluorescence de la structure physiologique des coupes DRG de souris. La coloration de Nissl montre les neurones sensoriels DRG de différentes tailles, et la coloration DAPI montre les cellules entourant les neurones. Cette image démontre la qualité des sections DRG obtenues avec ce protocole. Différents anticorps peuvent être appliqués pour les études d’immunohistochimie du DRG, y compris l’étude de différents types de neurones dans le DRG.
Figure 1 : Procédure étape par étape pour la cryosection des DRG de souris. (A) L’OCTO est gelée sur la surface supérieure du bloc d’aluminium. (B) Le haut de l’OCT est coupé à plat. (C) Une marque est faite en bas (position six heures) de l’OCT. (D) Le DRG est placé sur l’OCT de base, avec la partie ventrale face à la marque. (E) D’autres OCT sont ajoutés pour couvrir l’ensemble de l’échantillon DRG. (F) Le bord supérieur de l’OCT recouvrant le DRG doit se trouver au bord supérieur de l’OCT de base. (G) L’échantillon de l’OCT et du DRG de couverture est congelé. (H) Le haut de la couverture OCT est coupé jusqu’à ce que le tissu DRG soit visible (marqué de la flèche rouge). (I) La section OCT est maintenue en bas avec un pinceau pré-refroidi. (J) Le fond de la section est collé sur la surface de la plate-forme à l’aide de l’extrémité d’une pince à épiler à température ambiante. (K) Une autre vue de (J) montre que le bas de la section adhère à la surface de la plate-forme et que le haut est toujours relié au couvercle OCT. (L) La section est collée à une lame de verre. (M) Le même processus est répété pour obtenir plus de sections DRG sur la lame sans chevaucher les sections. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Technique d’élimination de l’excès de liquide du tissu DRG. (A) Le tissu DRG est placé sur une boîte de Pétri sèche directement à partir d’une solution de saccharose à 30 %, qui contient beaucoup de liquide environnant. (B) Le tissu DRG est déplacé vers un emplacement voisin sur la boîte de Petri à l’aide d’une pince à épiler sèche pour éliminer l’excès de liquide environnant. (C) La pince à épiler est séchée avec une lingette non pelucheuse à chaque fois après avoir déplacé le tissu DRG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’importance de placer correctement le couvercle OCT sur la base OCT. (A) L’emplacement idéal du couvercle OCT : (A-1) Le bord supérieur du tissu DRG recouvrant l’OCT doit être sur le bord supérieur de la base OCT. (A-2) La section ne doit pas être coupée complètement, avec une petite partie reliée au bord supérieur du couvercle OCT. (A-3) La section est transférée sur la lame de verre en douceur. (A-4) Le dessin montre qu’en ce qui concerne la section sur le bord supérieur, il est facile de transférer la section sur la lame de verre. La ligne courbe noire indique la section qui a été coupée. (B) Emplacement incorrect du couvercle OCT. (B-1) Le tissu de revêtement de l’OCT DRG est placé au centre de la base OCT. (B-2) La section n’est pas complètement coupée, avec une petite partie reliée au bord supérieur du couvercle OCT. (B-3) Le bord supérieur du bloc d’aluminium empêche la lame de verre de toucher la section. Les flèches rouges indiquent la distance entre la lame de verre et la section coupée. (B-4) Le dessin montre que la lame de verre est bloquée avant de toucher la section. La ligne courbe noire indique la section qui a été coupée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Placement correct des sections DRG sur la lame de verre. (A) La méthode correcte pour placer les sections DRG les unes à côté des autres sans chevaucher la section DRG et l’OCT des autres sections DRG. (B) La mauvaise méthode pour placer les sections DRG sur l’OCT d’une autre section DRG. Étant donné que la deuxième section DRG ne colle pas directement sur la lame de verre, elle peut être facilement lavée lors des processus ultérieurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Coloration de Nissl du DRG L4 de la souris. Un exemple d’image confocale 20x d’une section DRG L4 de la souris. Le vert indique Nissl (neurone) et le rouge indique DAPI (noyau). La barre d’échelle représente 50 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole fournit une procédure simple, étape par étape, pour la section cryostatique du DRG de souris afin d’obtenir des sections DRG de haute qualité sur des lames de manière fiable. Il y a quatre étapes critiques dans ce protocole. Tout d’abord, l’échantillon DRG et la pince à épiler doivent être secs avant de placer l’échantillon DRG sur l’OCT de base. Tout liquide entourant l’échantillon DRG formera une coquille de glace autour de celui-ci, ce qui entraînera la séparation des sections DRG de l’OCT et leur courbure vers le haut. Deuxièmement, si le bloc d’aluminium n’a pas de marque, ou si l’OCT de base recouvre la marque, il est important de faire une marque au bas (position six heures) de l’OCT de base et de garder cette marque à la position six heures tout au long du processus. Garder une orientation constante permet d’obtenir plus de sections DRG, sinon le DRG ne peut pas être coupé complètement de haut en bas, et certains échantillons DRG seront laissés de côté et gaspillés. Troisièmement, les bords supérieurs de l’OCT de base et de l’OCT de couverture doivent être situés sur le bord supérieur du bloc d’aluminium. De cette façon, le bord supérieur du bloc d’aluminium n’empêchera pas la lame de verre de prendre les sections DRG. Quatrièmement, il est important d’éviter de placer la section DRG dans l’OCT des sections DRG voisines, car la deuxième section DRG ne collera pas directement sur la lame de verre et peut donc être facilement lavée dans le processus ultérieur.
La cryosection DRG est une technologie très importante dans l’étude des DRG dans les mécanismes de la douleur et des démangeaisons 1,2. Cependant, en raison du très faible volume de DRG de souris, il est souvent difficile de collecter des sections de cryostat appropriées d’échantillons de DRG de souris. L’un des problèmes majeurs est que les sections OCT contenant du DRG ont tendance à se courber en rouleau, ce qui rend difficile la mise en place des sections sur les lames de verre. Un autre problème est que, comme l’échantillon DRG de souris est très mince, il est difficile d’obtenir suffisamment de coupes DRG à partir d’un échantillon DRG si les paramètres de cryosection ne sont pas optimisés. Ici, nous avons présenté un protocole étape par étape pour la cryosection DRG de souris, ce qui rend la collecte de sections DRG de haute qualité facile et pratique. Grâce à ce protocole, nous sommes en mesure de collecter environ 16 sections DRG continues et de haute qualité à partir d’un DRG L4 de souris.
L’une des limites de ce protocole est qu’il ne peut pas fournir de reconstruction 3D directe comme la technique de nettoyage des tissus26. Néanmoins, comme nous pouvons obtenir des coupes continues et de haute qualité avec cette méthode, nous pouvons prendre des images de ces sections continues pour reconstruire des images 3D.
Bien que le protocole de cryosection des DRG soit développé à partir de jeunes souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, ce protocole peut être appliqué pour la cryosection des DRG humains et des DRG de souris d’âges plus jeunes ou plus âgés. En fait, ce protocole devrait pouvoir être appliqué pour la cryosection de n’importe quel échantillon de volume.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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