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Neuroscience

Um procedimento para criossecção do gânglio da raiz dorsal de camundongos

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65232
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 2,4, 2, 1, 2
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco, 3Department of Anesthesiology, Sun Yat-Sen University, 4University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Apresentamos aqui o desenvolvimento para a aquisição consistente de cortes criostato de gânglio da raiz dorsal de alta qualidade.

Abstract

Cortes de criostato de alta qualidade do gânglio da raiz dorsal de camundongos (DRG) são cruciais para a coloração imunoquímica adequada e estudos de RNAscope na pesquisa de dor inflamatória e neuropática, coceira, bem como outras condições neurológicas periféricas. No entanto, continua sendo um desafio obter consistentemente seções de criostato de alta qualidade, intactas e planas em lâminas de vidro devido ao tamanho minúsculo da amostra do tecido DRG. Até o momento, não há nenhum artigo descrevendo um protocolo ideal para criossecção DRG. Este protocolo apresenta um método passo-a-passo para resolver as dificuldades frequentemente encontradas associadas à criossecção DRG. O artigo apresentado explica como remover o líquido circundante das amostras de tecido DRG, colocar as seções DRG na lâmina voltadas para a mesma orientação e achatar as seções na lâmina de vidro sem se curvar. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido para a criossecção de amostras DRG, ele pode ser aplicado para a criossecção de muitos outros tecidos com um pequeno tamanho amostral.

Introduction

O gânglio da raiz dorsal (DRG) contém os neurônios sensoriais primários, os macrófagos teciduais e as células satélites que circundam os neurônios sensoriais primários 1,2,3,4. É uma estrutura anatômica chave no processamento de sinais inócuos e nocivos, e desempenha papéis críticos na dor, prurido e vários distúrbios dos nervos periféricos 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos para dissecar o tecido DRG da medula espinhal de camundongos14,15,16, a criossecção do tecido DRG permanece desafiadora, pois o tecido DRG é muito pequeno, e cortes criostato de amostras DRG tendem a curvar-se em rolos, dificultando a transferência adequada das seções de criostato para lâminas de vidro. Entretanto, a criossecção adequada do tecido DRG é crucial para estudos imunohistoquímicos e para a estrutura dos neurônios sensoriais DRG 17,18,19,20,21,22,23. Além disso, como os resultados do sequenciamento de RNA de célula única revelaram a notável heterogeneidade dos neurônios sensoriais DRG em humanos24 e camundongos25, a criossecção adequada do tecido DRG é crítica para investigar o papel funcional de diferentes células DRG em várias condições fisiológicas e patológicas.

Embora a técnica de limpeza de tecido tenha sido aplicada para investigar a reconstrução 3D do DRG26 como uma técnica alternativa de criossecção do DRG, a técnica de limpeza de tecido é demorada e trabalhosa. Em comparação, a criossecção do DRG é rápida e relativamente fácil de ser realizada, sendo, portanto, uma técnica chave para estudos imunohistoquímicos e estruturais do DRG e de outras regiões do sistema nervoso central. No entanto, a obtenção de seções de criostato de alta qualidade, intactas e planas em lâminas de vidro continua a ser um desafio na pesquisa em neurociência devido ao tamanho minúsculo da amostra de tecidos, como o DRG e certas regiões cerebrais, e não há nenhum artigo descrevendo o protocolo ideal neste momento para criossecção de amostras de tecido de pequeno tamanho, como DRGs de camundongo.

Este protocolo fornece uma técnica fácil e passo a passo para a secção em criostato do DRG do rato para obter de forma fiável o maior número de secções DRG de alta qualidade nas lâminas para estudos DRG subsequentes. Embora especificamente projetada para criossecção de amostras DRG, esta técnica pode potencialmente ser usada para criossecção de vários outros tecidos com um tamanho de amostra pequeno.

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Protocol

Para o presente estudo, os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF e conduzidos de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory animals. Camundongos adultos C57BL/6 machos e fêmeas (criados internamente) com 8-12 semanas de idade foram usados aqui.

1. Preparação da amostra DRG

  1. Anestesiar os camundongos com 2,5% de Avertin (ver Tabela de Materiais). Garantir anestesia adequada pela falta de resposta ao estímulo doloroso. Perfundir os animais transcardialmente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x seguida de formaldeído a 4%, conforme previamente descrito14,15,16.
  2. Dissecar o tecido DRG da medula espinhal, como descrito anteriormente14,15,16.
  3. Pós-fixar os DRGs dissecados em formol a 4% por 3 h à temperatura ambiente.
  4. Coloque os DRGs em 30% de sacarose em PBS a 4 °C durante a noite.
  5. Preparando a temperatura de corte ótima da base (OCT)
    1. Adicione o composto OCT (ver Tabela de Materiais) para cobrir a superfície superior do bloco de alumínio e congele a -20 °C por 5-10 min (Figura 1A).
    2. Cortar a parte superior do OCT utilizando o criostato (ver Tabela de Materiais) a 30 μm de espessura até que a sua superfície seja plana como o OCT de base (Figura 1B).
    3. Faça uma marcação na parte inferior (posição das seis horas) da OCT base para marcar sua orientação, antes de retirar o bloco de alumínio do criostato (Figura 1C).
    4. Nas etapas seguintes, mantenha a marca na posição das seis horas para manter a mesma orientação, o que pode levar à obtenção de mais seções da amostra DRG.
      NOTA: Se a orientação for perdida e a amostra DRG for cortada em um ângulo diferente, a amostra DRG não poderá ser cortada completamente de cima para baixo, o que deixará algumas amostras deixadas de fora na OCT base e desperdiçadas, pois a OCT base será encontrada ao tentar cortar a amostra DRG (Figura 1C).
  6. Executando a incorporação de DRGs da OCT
    1. Seque o tecido DRG antes de colocá-lo no OCT.
      1. Antes de adicionar o DRG ao bloco, certifique-se de remover a solução de sacarose/PBS a 30% ao redor da amostra.
      2. Secar a amostra de DRG colocando-a em uma placa de Petri seca (Figura 2A) e movendo-a de um local para outro duas ou três vezes com pinças secas (Figura 2B).
      3. Secar a pinça com tecido sem fiapos antes de mover outra amostra de DRG (Figura 2C).
    2. Coloque o DRG seco no OCT base.
      1. Com pinças secas, coloque o DRG seco na OCT base na posição das 12 horas (Figura 1D).
      2. Mantenha pelo menos 5 mm entre a borda superior do DRG e a borda superior do OCT de base.
      3. Colocar a parte dorsal do DRG às 12 horas e a parte ventral às seis horas (Figura 1D).
    3. Incorpore o tecido DRG com OCT.
      1. Adicione mais OCT para cobrir toda a amostra de DRG em uma forma redonda ou oval, com o DRG no centro (Figura 1E).
      2. Certifique-se de que a borda superior da OCT cubra o DRG na borda superior da OCT de base (Figura 1F), pois isso facilita a transferência da seção para a lâmina de vidro (Figura 3A).
        NOTA: Se a OCT da tampa estiver no meio da OCT base, a borda superior da OCT da base bloqueará a lâmina de vidro para coletar a seção (Figura 3B).
      3. Congelar a amostra de OCT e DRG de cobertura a -20 °C por mais 5 min (Figura 1G). Não corte a OCT ao redor da amostra DRG.
      4. Corte a parte superior da OCT da tampa a uma espessura de 30 μm até que o DRG esteja visível.

2. Criosecção do DRG

  1. Altere a espessura da seção de criostato para 12 μm para cortar seções DRG na lâmina (Figura 1H).
  2. Segure a seção OCT na parte inferior com um pequeno pincel resfriado a -20 °C.
    NOTA: É importante não cortar toda a seção completamente, mas deixar 1-3 mm sem cortes (Figura 1I).
  3. Use a extremidade de uma pinça à temperatura ambiente para tocar suavemente o fundo (posição das seis horas) da seção de modo que ela grude na superfície da plataforma (Figura 1J). Isso evita que a seção se curve para trás em um rolo, o que dificulta a coleta da seção no slide.
    NOTA: Quando a parte inferior da seção adere à superfície da plataforma e a parte superior da seção ainda se conecta com a OCT da tampa, a seção está em uma forma plana (Figura 1K), tornando muito mais fácil coletar a seção no slide.
  4. Pegue uma lâmina de vidro carregada (consulte Tabela de Materiais) e coloque lentamente a lâmina sobre a seção. Assim que a seção começar a grudar na lâmina, puxe suavemente a lâmina para trás (Figura 1L).
  5. Siga o mesmo processo para obter mais seções DRG no slide sem sobrepor as seções (Figura 1M). Certifique-se de que uma nova seção DRG não seja colocada sobre a OCT de outra seção DRG (Figura 4), pois essa seção não pode ficar bem na lâmina e pode ser lavada durante o processo de coloração imunoquímica.

3. Coloração de Nissl da seção DRG na lâmina de vidro

  1. Lave as seções por 10 min em PBS mais 0,1% Triton X-10. Em seguida, lave as seções duas vezes com PBS.
  2. Aplicar uma coloração de Nissl 1:300 (ver Tabela de Materiais) na lâmina e incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente.
  3. Lave a seção com PBS mais 0,1% Triton X-100. Em seguida, lave as seções duas vezes com PBS por 5 min e, em seguida, por 2 h à temperatura ambiente.
  4. Aplicar 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) fluoromount-G (ver Tabela de Materiais) para cobrir as secções com uma lamínula.

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Representative Results

O presente estudo coletou cerca de 16 seções DRG contínuas e de alta qualidade de um camundongo L4 DRG. Os cortes obtidos foram sem distorção. A Figura 1 mostra o passo a passo para a criossecção. A retirada de líquido extra dos cortes teciduais é mostrada na Figura 2. O processo de inclusão dos tecidos pela OCT é destacado na Figura 3. A Figura 4 mostra o posicionamento adequado das seções DRG nas lâminas de vidro. A Figura 5 mostra a imagem de microscopia de fluorescência confocal da estrutura fisiológica dos cortes DRG em camundongos. A coloração de Nissl mostra os neurônios sensoriais DRG de vários tamanhos, e a coloração DAPI mostra as células ao redor dos neurônios. Esta imagem demonstra a qualidade dos cortes DRG obtidos com este protocolo. Diferentes anticorpos podem ser aplicados para os estudos imunohistoquímicos do DRG, incluindo o estudo de diferentes tipos de neurônios no DRG.

Figure 1
Figura 1: Procedimento passo a passo para DRGs de camundongos criosseccionados. (A) A OCT é congelada na superfície superior do bloco de alumínio. (B) A parte superior do PTU é cortada plana. (C) Uma marca é feita na parte inferior (posição das seis horas) do PTU de base. (D) O DRG é colocado no OCT de base, com a parte ventral voltada para a marca. (E) É adicionada mais OCT para cobrir toda a amostra DRG. (F) A borda superior do PTU que cobre o DRG precisa estar na borda superior do PTU de base. (H) A parte superior da tampa OCT é cortada até que o tecido DRG seja visível (marcado com a seta vermelha). (I) A seção OCT é mantida na parte inferior com um pincel pré-resfriado. (J) O fundo da seção é fixado na superfície da plataforma usando a extremidade de uma pinça à temperatura ambiente. (K) Outra visão de (J) mostra que a parte inferior da seção adere à superfície da plataforma e a parte superior ainda se conecta com a tampa OCT. (L) A seção está presa a uma lâmina de vidro. (M) O mesmo processo é repetido para obter mais seções DRG no slide sem sobrepor seções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Técnica para remoção de líquido extra do tecido DRG. (A) O tecido DRG é colocado em uma placa de Petri seca diretamente de uma solução de sacarose a 30%, que tem muito líquido circundante. (B) O tecido DRG é movido para um local vizinho na placa de Petri usando pinças secas para remover o líquido extra circundante. (C) As pinças são secas com um lenço sem fiapos todas as vezes após a movimentação do tecido DRG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A importância de colocar corretamente a OCT de cobertura na base OCT. (A) O local ideal da OCT de cobertura: (A-1) A borda superior da OCT que cobre o tecido DRG deve estar na borda superior da OCT de base. (A-4) O desenho mostra que, em termos da seção na borda superior, é fácil transferir a seção para a lâmina de vidro. A linha curva preta indica a seção que foi cortada. (B-1) A OCT que cobre o tecido DRG é colocada no centro da OCT base OCT. (B-2) A seção não é completamente cortada, com uma pequena parte conectada à borda superior da tampa OCT. (B-3) A borda superior do bloco de alumínio impede que a lâmina de vidro toque na seção. As setas vermelhas indicam a distância entre a lâmina de vidro e a seção de corte. (B-4) O desenho mostra que a lâmina de vidro está bloqueada antes de tocar na seção. A linha curva preta indica a seção que foi cortada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Colocação adequada das seções DRG na lâmina de vidro . (A) O método correto para colocar as seções DRG próximas umas das outras sem sobrepor a seção DRG e a OCT de outras seções DRG. (B) O método incorreto para colocar as seções DRG na OCT de outra seção DRG. Como a segunda seção DRG não adere diretamente à lâmina de vidro, ela pode ser facilmente lavada durante os processos subsequentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Coloração de Nissl do mouse L4 DRG. Um exemplo de uma imagem confocal de 20x de uma seção DRG L4 do mouse. Verde indica Nissl (neurônio), e vermelho indica DAPI (núcleo). A barra de escala representa 50 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo fácil para a secção criostato do DRG do mouse para obter seções DRG de alta qualidade em lâminas de forma confiável. Há quatro etapas críticas neste protocolo. Primeiro, a amostra DRG e a pinça devem estar secas antes de colocar a amostra DRG na OCT base. Qualquer líquido ao redor da amostra DRG formará uma camada de gelo ao seu redor, resultando em seções DRG se separando da OCT e curvando-se. Em segundo lugar, se o bloco de alumínio não tiver uma marca, ou se o OCT base cobrir a marca, é importante fazer uma marca na parte inferior (posição das seis horas) do OCT base e manter essa marca na posição das seis horas durante todo o processo. Manter uma orientação constante ajuda a obter mais seções DRG, pois caso contrário, o DRG não pode ser cortado completamente de cima para baixo, e algumas amostras DRG serão deixadas de fora e desperdiçadas. Em terceiro lugar, as bordas superiores da OCT de base e da OCT de cobertura devem estar na borda superior do bloco de alumínio. Desta forma, a borda superior do bloco de alumínio não impedirá que a lâmina de vidro tome as seções DRG. Quarto, é importante evitar colocar a seção DRG dentro da OCT das seções DRG vizinhas, porque a segunda seção DRG não ficará diretamente na lâmina de vidro e, portanto, pode ser facilmente lavada no processo subsequente.

A criossecção DRG é uma tecnologia muito importante na investigação dos DRGs nos mecanismos de dor e prurido 1,2. No entanto, devido ao volume muito pequeno de DRGs de camundongos, coletar seções criostato adequadas de amostras de DRG de camundongos é muitas vezes desafiador. Um grande problema é que as seções de OCT contendo DRG tendem a se curvar em um rolo, dificultando a colocação das seções nas lâminas de vidro. Outro problema é que, como a amostra de DRG do mouse é muito fina, é difícil obter seções DRG suficientes de uma amostra de DRG se as configurações de criossecção não forem otimizadas. Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para criossecção DRG em camundongos, tornando a coleta de seções DRG de alta qualidade fácil e prática. Com este protocolo, somos capazes de coletar cerca de 16 seções DRG contínuas e de alta qualidade de um mouse L4 DRG.

Uma limitação desse protocolo é que ele não pode fornecer reconstrução 3D direta como a técnica de limpeza de tecidos26. No entanto, como podemos obter seções contínuas e de alta qualidade com este método, podemos tirar imagens dessas seções contínuas para reconstruir imagens 3D.

Embora o protocolo para a criossecção de DRGs seja desenvolvido a partir de camundongos adultos jovens com idade entre 8-12 semanas, este protocolo pode ser aplicado para criossecção de DRGs humanos e DRGs de camundongos de idades mais jovens ou mais velhas. De fato, este protocolo deve ser capaz de ser aplicado para a criossecção de qualquer volume de amostras.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Nenhum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avertin Sigma-Aldrich T48402-25G Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched Fisherbrand 1910 Hold the OCT section at the bottom 
Ergo Tweezers Fisherbrand S95310 Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll 
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 To collect the DRG section 
Marking pens Fisherbrand 133794  Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisherbrand  23730571 Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).

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