Summary
여기에 제시된 것은 고품질의 등뿌리 신경절 냉동 유지 장치 절편을 지속적으로 획득하기 위한 개발입니다.
Abstract
고품질 마우스 배근 신경절(DRG) 냉동 유지 장치 절편은 염증성 및 신경병증성 통증, 가려움증 및 기타 말초 신경학적 상태 연구에서 적절한 면역화학 염색 및 RNAscope 연구에 매우 중요합니다. 그러나 DRG 조직의 샘플 크기가 작기 때문에 유리 슬라이드에서 고품질의 온전하고 평평한 저온 유지 장치 절편을 일관되게 얻는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 지금까지 DRG 동결 절제술을 위한 최적의 프로토콜을 설명하는 논문은 없습니다. 이 프로토콜은 DRG 동결 절제술과 관련하여 자주 발생하는 어려움을 해결하기 위한 단계별 방법을 제시합니다. 제시된 기사에서는 DRG 조직 샘플에서 주변 액체를 제거하고, DRG 섹션을 동일한 방향을 향하도록 슬라이드에 배치하고, 유리 슬라이드의 섹션을 구부리지 않고 평평하게 만드는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 DRG 샘플의 냉동 절편을 위해 개발되었지만, 샘플 크기가 작은 다른 많은 조직의 냉동 절제에 적용할 수 있습니다.
Introduction
등뿌리신경절(dorsal root ganglion, DRG)은 일차 감각 뉴런, 조직 대식세포, 일차 감각 뉴런 1,2,3,4를 둘러싸고 있는 위성 세포를 포함합니다. 무해하고 유해한 신호를 처리하는 데 중요한 해부학적 구조이며 통증, 가려움증 및 다양한 말초 신경 장애 5,6,7,8,9,10,11,12,13에 중요한 역할을 합니다. 마우스 척수(14,15,16)로부터 DRG 조직을 해부하기 위한 몇 가지 방법이 개발되었지만, DRG 조직이 매우 작고, DRG 샘플의 냉동 유지 장치 절편이 롤로 구부러지는 경향이 있어 냉동 유지 장치 절편을 유리 슬라이드 상으로 적절하게 이송하는 것이 어렵기 때문에 DRG 조직의 동결 절제술은 여전히 어려운 과제로 남아 있다. 그러나 DRG 조직의 적절한 동결 절제는 면역조직화학 연구와 DRG 감각 뉴런 17,18,19,20,21,22,23의 구조에 매우 중요합니다. 더욱이, 단세포 RNA 염기서열분석 결과가 인간(24)과 마우스(25) 모두에서 DRG 감각 뉴런의 현저한 이질성을 밝혀냈기 때문에, DRG 조직의 적절한 동결절제는 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 상이한 DRG 세포의 기능적 역할을 조사하는 데 중요하다.
DRG 동결 절제술의 대체 기술로서 DRG26 의 3D 재구성을 조사하기 위해 조직 투명화 기술이 적용되었지만, 조직 투명화 기술은 시간과 노동력이 많이 소요됩니다. 이에 비해 DRG의 동결 절제술은 빠르고 비교적 쉽게 수행할 수 있으므로 DRG 및 중추 신경계의 다른 영역에 대한 면역조직화학 및 구조 연구의 핵심 기술로 남아 있습니다. 그러나 DRG 및 특정 뇌 영역과 같은 조직의 샘플 크기가 작기 때문에 유리 슬라이드에 고품질의 온전하고 평평한 냉동 유지 장치 절편을 얻는 것은 신경 과학 연구에서 여전히 어려운 과제로 남아 있으며, 현재 마우스 DRG와 같은 작은 조직 샘플을 동결 절제하기 위한 최적의 프로토콜을 설명하는 논문은 없습니다.
이 프로토콜은 마우스 DRG의 저온 유지 장치 절편을 위한 쉽고 단계적인 기술을 제공하여 후속 DRG 연구를 위해 슬라이드에서 고품질 DRG 절편을 최대한 많이 안정적으로 얻을 수 있습니다. DRG 시료를 동결 절제하기 위해 특별히 고안된 이 기법은 시료 크기가 작은 다양한 다른 조직을 동결 절제하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.
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Protocol
본 연구의 경우 동물 실험은 UCSF Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행되었습니다. 성체, 8-12주 된 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스(자체 사육)를 여기에 사용하였다.
1. DRG 시료 전처리
- 2.5% 아베르틴으로 마우스를 마취합니다(재료 표 참조). 고통스러운 자극에 대한 반응 부족으로 적절한 마취를 보장합니다. 앞서 기술한바와 같이 1x 인산염-완충 식염수(PBS)에 이어 4% 포름알데히드를 동물에 심 경관류한다 14,15,16.
- 앞서 설명한 바와 같이 척수에서 DRG 조직을 절개합니다14,15,16.
- 해부된 DRG를 실온에서 3시간 동안 4% 포름알데히드에 사후 고정합니다.
- DRG를 PBS의 30% 자당에 넣고 밤새 4°C에서 가열합니다.
- 베이스 최적 절삭 온도(OCT) 준비
- OCT 화합물( 재료 표 참조)을 추가하여 알루미늄 블록의 상단 표면을 덮고 -20°C에서 5-10분 동안 얼립니다(그림 1A).
- 표면이 기본 OCT처럼 평평해질 때까지 30μm 두께의 저온 유지 장치( 재료 표 참조)를 사용하여 OCT의 상단을 잘라냅니다(그림 1B).
- 저온 유지 장치에서 알루미늄 블록을 제거하기 전에 기본 OCT의 하단(6시 위치)에 표시를 하여 방향을 표시합니다(그림 1C).
- 다음 단계에서는 동일한 방향을 유지하기 위해 표시를 6시 위치에 유지하여 DRG 샘플의 더 많은 섹션을 얻을 수 있습니다.
참고: 방향이 손실되고 DRG 샘플이 다른 각도로 절단되면 DRG 샘플을 위에서 아래로 완전히 절단할 수 없으므로 DRG 샘플을 절단하려고 시도하는 동안 기본 OCT가 발생하기 때문에 일부 샘플이 기본 OCT에 남겨져 낭비됩니다(그림 1C).
- DRG의 OCT 임베딩 수행
- OCT에 바르기 전에 DRG 조직을 건조시키십시오.
- DRG를 블록에 추가하기 전에 샘플 주변의 30% 자당/PBS 용액을 제거해야 합니다.
- DRG 샘플을 마른 페트리 접시에 놓고 마른 핀셋으로 한 위치에서 다른 위치로 두세 번 이동하여 건조시킵니다(그림 2B).
- 다른 DRG 샘플을 이동하기 전에 보푸라기가 없는 조직으로 핀셋을 건조시킵니다(그림 2C).
- 드라이 DRG를 베이스 OCT에 놓습니다.
- 마른 핀셋을 사용하여 마른 DRG를 12시 방향의 베이스 OCT에 놓습니다(그림 1D).
- DRG의 상단 가장자리와 베이스 OCT의 상단 가장자리 사이에 최소 5mm를 유지하십시오.
- DRG의 등쪽 부분을 12시 방향에, 복부 부분을 6시 방향에 놓습니다(그림 1D).
- OCT로 DRG 조직을 삽입합니다.
- OCT를 더 추가하여 DRG가 중앙에 오도록 전체 DRG 샘플을 원형 또는 타원형으로 덮습니다(그림 1E).
- OCT의 상단 가장자리가 베이스 OCT의 상단 가장자리에 있는 DRG를 덮도록 합니다(그림 1F). 이렇게 하면 섹션을 유리 슬라이드로 쉽게 옮길 수 있습니다(그림 3A).
참고: 덮개 OCT가 베이스 OCT의 중간에 있는 경우 베이스 OCT의 위쪽 가장자리가 유리 슬라이드를 막아 섹션을 모을 수 있습니다(그림 3B). - 덮개 OCT 및 DRG 샘플을 -20°C에서 5분 더 얼립니다(그림 1G). DRG 샘플 주위의 OCT를 트리밍하지 마십시오.
- DRG가 보일 때까지 30μm 두께로 덮개 OCT의 상단을 자릅니다.
- OCT에 바르기 전에 DRG 조직을 건조시키십시오.
2. DRG의 냉동 절편
- 저온 유지 장치 섹션 두께를 12μm로 변경하여 DRG 섹션을 슬라이드로 절단합니다(그림 1H).
- -20 °C로 냉각된 작은 붓으로 바닥의 OCT 섹션을 잡습니다.
알림: 전체 섹션을 완전히 자르지 말고 1-3mm를 자르지 않은 상태로 두는 것이 중요합니다(그림 1I). - 실온 핀셋 끝을 사용하여 섹션의 바닥(6시 위치)을 부드럽게 터치하여 플랫폼 표면에 달라붙도록 합니다(그림 1J). 이렇게 하면 단면이 롤에서 뒤로 구부러지는 것을 방지하여 슬라이드에서 단면을 수집하기 어렵게 만듭니다.
참고: 섹션의 하단이 플랫폼 표면에 달라붙고 섹션의 상단이 여전히 커버 OCT와 연결되면 섹션이 평평한 모양이 되므로(그림 1K) 슬라이드에서 섹션을 훨씬 쉽게 수집할 수 있습니다. - 충전된 유리 슬라이드( 재료 표 참조)를 가져다가 슬라이드를 섹션 위에 천천히 놓습니다. 섹션이 슬라이드에 달라붙기 시작하면 슬라이드를 뒤로 부드럽게 당깁니다(그림 1L).
- 동일한 프로세스를 수행하여 섹션이 겹치지 않고 더 많은 DRG 섹션을 슬라이드에 가져옵니다(그림 1M). 새 DRG 절편이 다른 DRG 절편의 OCT 위에 놓이지 않도록 하십시오(그림 4).
3. 유리 슬라이드의 DRG 섹션의 Nissl 염색
- PBS에 0.1% Triton X-10을 더한 상태에서 10분 동안 섹션을 세척합니다. 그런 다음 PBS로 섹션을 두 번 세척하십시오.
- 슬라이드에 1:300 Nissl 염색( 재료 표 참조)을 바르고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
- PBS 플러스 0.1% Triton X-100으로 섹션을 세척합니다. 그런 다음 PBS로 5분 동안 섹션을 두 번 세척한 다음 실온에서 2시간 동안 세척합니다.
- 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) fluoromount-G( 재료 표 참조)를 적용하여 커버슬립으로 섹션을 덮습니다.
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Representative Results
이번 연구에서는 마우스 L4 DRG 한 마리에서 약 16개의 연속적인 고품질 DRG 절편을 수집했습니다. 얻어진 부분은 왜곡이 없었습니다. 그림 1 은 동결 절제술을 위한 단계별 절차를 보여줍니다. 조직 절편에서 여분의 액체를 제거하는 방법은 그림 2에 나와 있습니다. 조직의 OCT 포매 과정은 그림 3에 강조되어 있습니다. 그림 4 는 유리 슬라이드에 DRG 섹션이 올바르게 배치된 것을 보여줍니다. 그림 5 는 마우스 DRG 절편의 생리학적 구조에 대한 컨포칼 형광 현미경 이미지를 보여줍니다. Nissl 염색은 다양한 크기의 DRG 감각 뉴런을 보여주고, DAPI 염색은 뉴런을 둘러싼 세포를 보여줍니다. 이 이미지는 이 프로토콜로 얻은 DRG 섹션의 품질을 보여줍니다. DRG의 다양한 뉴런 유형 연구를 포함하여 DRG의 면역조직화학 연구에 다양한 항체를 적용할 수 있습니다.
그림 1: 마우스 DRG를 동결 절제하기 위한 단계별 절차 . (A) OCT는 알루미늄 블록의 상단 표면에서 동결됩니다. (B) OCT의 상단이 평평하게 잘립니다. (C) 베이스 OCT의 하단(6시 위치)에 표시가 있습니다. (D) DRG는 베이스 OCT에 배치되고 복부 부분이 마크를 향하도록 합니다. (E) 전체 DRG 샘플을 커버하기 위해 더 많은 OCT가 추가됩니다. (F) DRG를 덮고 있는 OCT의 위쪽 가장자리는 베이스 OCT의 위쪽 가장자리에 있어야 합니다. (G) 덮개 OCT 및 DRG 샘플이 고정되어 있습니다. (H) DRG 조직이 보일 때까지 덮개 OCT의 상단이 잘립니다(빨간색 화살표로 표시). (I) OCT 섹션은 예냉식 붓으로 바닥에 고정됩니다. (J) 섹션의 바닥은 실온 핀셋 끝을 사용하여 플랫폼 표면에 붙어 있습니다. (K) (J)의 또 다른 모습은 단면의 바닥이 플랫폼 표면에 달라붙고 상단이 여전히 덮개 OCT와 연결되어 있음을 보여줍니다. (L) 단면이 유리 슬라이드에 붙어 있습니다. (M) 동일한 프로세스를 반복하여 섹션을 겹치지 않고 슬라이드에 더 많은 DRG 섹션을 가져옵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DRG 조직에서 여분의 액체를 제거하는 기술. (A) DRG 조직은 주변에 많은 액체가 있는 30% 자당 용액에서 직접 건조한 페트리 플레이트에 놓입니다. (B) DRG 조직은 여분의 주변 액체를 제거하기 위해 마른 핀셋을 사용하여 페트리 플레이트의 인접 위치로 이동합니다. (C) 핀셋은 DRG 조직을 옮길 때마다 보푸라기가 없는 물티슈로 건조시킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 커버 OCT를 베이스 OCT에 올바르게 배치하는 것의 중요성 (A) 커버 OCT의 이상적인 위치: (A-1) DRG 조직을 덮고 있는 OCT의 상단 가장자리는 베이스 OCT의 상단 가장자리에 있어야 합니다. (A-2) 커버 OCT의 상단 가장자리에 작은 부분이 연결된 상태에서 섹션을 완전히 절단해서는 안 됩니다. (A-3) 섹션이 유리 슬라이드에 부드럽게 옮겨집니다. (가-4) 그림은 상단 가장자리의 단면 측면에서 단면을 유리 슬라이드로 쉽게 옮길 수 있음을 보여줍니다. 검은색 곡선은 절단된 단면을 나타냅니다. (B) 덮개의 부적절한 위치 OCT. (B-1) DRG 조직을 덮고 있는 OCT는 베이스 OCT의 중앙에 배치됩니다. (B-2) 섹션이 완전히 절단되지 않고 작은 부분이 커버 OCT의 상단 가장자리에 연결되어 있습니다. (B-3) 알루미늄 블록의 상단 가장자리는 유리 슬라이드가 섹션에 닿는 것을 방지합니다. 빨간색 화살표는 유리 슬라이드와 절단 섹션 사이의 거리를 나타냅니다. (나-4) 도면은 단면을 만지기 전에 유리 슬라이드가 막혀 있음을 보여줍니다. 검은색 곡선은 절단된 단면을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 유리 슬라이드에 DRG 섹션의 적절한 배치. (A) DRG 섹션과 다른 DRG 섹션의 OCT를 겹치지 않고 DRG 섹션을 서로 인접하게 배치하는 올바른 방법입니다. (B) DRG 섹션을 다른 DRG 섹션의 OCT에 배치하는 잘못된 방법입니다. 두 번째 DRG 섹션은 유리 슬라이드에 직접 달라붙지 않기 때문에 후속 공정에서 쉽게 씻어낼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 마우스 L4 DRG의 Nissl 염색. 마우스 L4 DRG 섹션의 20x 컨포칼 이미지의 예. 녹색은 Nissl(뉴런)을 나타내고 빨간색은 DAPI(핵)를 나타냅니다. 축척 막대는 50mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 마우스 DRG의 저온 유지 장치 절편을 위한 쉬운 단계별 절차를 제공하여 슬라이드에서 고품질 DRG 절편을 안정적으로 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜에는 네 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, DRG 샘플을 기본 OCT에 넣기 전에 DRG 샘플과 핀셋을 건조시켜야 합니다. DRG 샘플을 둘러싼 모든 액체는 그 주위에 얼음 껍질을 형성하여 DRG 섹션이 OCT에서 분리되고 위로 구부러집니다. 둘째, 알루미늄 블록에 표시가 없거나 베이스 OCT가 마크를 덮는 경우 베이스 OCT의 하단(6시 위치)에 표시를 하고 프로세스 전반에 걸쳐 이 표시를 6시 위치에 유지하는 것이 중요합니다. 일정한 방향을 유지하면 DRG를 위에서 아래로 완전히 절단할 수 없고 일부 DRG 샘플이 누락되어 낭비되기 때문에 더 많은 DRG 섹션을 얻는 데 도움이 됩니다. 셋째, 베이스 OCT와 커버 OCT의 상단 가장자리는 알루미늄 블록의 상단 가장자리에 있어야 합니다. 이러한 방식으로 알루미늄 블록의 상단 가장자리는 유리 슬라이드가 DRG 섹션을 차지하는 것을 차단하지 않습니다. 넷째, 두 번째 DRG 섹션이 유리 슬라이드에 직접 달라붙지 않아 후속 공정에서 쉽게 씻겨 나갈 수 있기 때문에 DRG 섹션을 인접한 DRG 섹션의 OCT 내에 두지 않는 것이 중요합니다.
DRG 동결 절제술은 통증 및 가려움증의 메커니즘에서 DRG를 조사하는 데 매우 중요한 기술입니다 1,2. 그러나 마우스 DRG의 양이 매우 적기 때문에 마우스 DRG 샘플의 적절한 저온 유지 장치 절편을 수집하는 것은 종종 어렵습니다. 한 가지 주요 문제는 DRG가 포함된 OCT 섹션이 롤 모양으로 구부러지는 경향이 있어 섹션을 유리 슬라이드에 놓기가 어렵다는 것입니다. 또 다른 문제는 마우스 DRG 샘플이 매우 얇기 때문에 동결 절제 설정이 최적화되지 않은 경우 하나의 DRG 샘플에서 충분한 DRG 절편을 얻기가 어렵다는 것입니다. 여기에서는 마우스 DRG 동결 절편을 위한 단계별 프로토콜을 제시하여 고품질 DRG 절편을 쉽고 실용적으로 수집할 수 있도록 했습니다. 이 프로토콜을 사용하면 하나의 마우스 L4 DRG에서 약 16개의 연속적인 고품질 DRG 섹션을 수집할 수 있습니다.
이 프로토콜의 한 가지 한계는 조직 투명화 기술(26)로서 직접적인 3D 재구성을 제공할 수 없다는 것이다. 그럼에도 불구하고 이 방법으로 연속적인 고품질 단면을 얻을 수 있으므로 이러한 연속 단면에서 이미지를 가져와 3D 이미지를 재구성할 수 있습니다.
DRG의 동결 절제술을 위한 프로토콜은 8-12주 된 젊은 성인 마우스에서 개발되었지만, 이 프로토콜은 인간 DRG 및 더 어리거나 더 나이가 많은 마우스의 DRG를 동결 절제하는 데 적용할 수 있습니다. 사실, 이 프로토콜은 모든 부피 샘플의 냉동 절제에 적용할 수 있어야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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