Summary
Aquí se presenta el desarrollo para la adquisición consistente de secciones de criostato de ganglios de raíces dorsales de alta calidad.
Abstract
Las secciones de criostato de ganglios de la raíz dorsal (DRG) de ratón de alta calidad son cruciales para la tinción inmunoquímica adecuada y los estudios de ARNoscopio en la investigación del dolor inflamatorio y neuropático, la picazón y otras afecciones neurológicas periféricas. Sin embargo, sigue siendo un desafío obtener consistentemente secciones de criostato de alta calidad, intactas y planas en portaobjetos de vidrio debido al pequeño tamaño de la muestra del tejido DRG. Hasta el momento, no existe ningún artículo que describa un protocolo óptimo para la criosección de DRG. Este protocolo presenta un método paso a paso para resolver las dificultades frecuentes asociadas con la criosección de DRG. El artículo presentado explica cómo eliminar el líquido circundante de las muestras de tejido de DRG, colocar las secciones de DRG en el portaobjetos mirando hacia la misma orientación y aplanar las secciones en el portaobjetos de vidrio sin curvarse hacia arriba. Aunque este protocolo se ha desarrollado para la criosección de las muestras de DRG, se puede aplicar para la criosección de muchos otros tejidos con un tamaño de muestra pequeño.
Introduction
El ganglio de la raíz dorsal (DRG) contiene las neuronas sensoriales primarias, los macrófagos tisulares y las células satélite que rodean a las neuronas sensoriales primarias 1,2,3,4. Es una estructura anatómica clave en el procesamiento de señales inocuas y nocivas, y desempeña un papel fundamental en el dolor, la picazón y diversos trastornos de los nervios periféricos 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Aunque se han desarrollado varios métodos para diseccionar el tejido de DRG de la médula espinal del ratón14,15,16, la criosección del tejido de DRG sigue siendo un desafío, ya que el tejido de DRG es bastante pequeño y las secciones de criostato de las muestras de DRG tienden a curvarse en rollos, lo que dificulta la transferencia adecuada de las secciones de criostato a portaobjetos de vidrio. Sin embargo, la criosección adecuada del tejido DRG es crucial para los estudios de inmunohistoquímica y la estructura de las neuronas sensoriales DRG 17,18,19,20,21,22,23. Además, dado que los resultados de la secuenciación del ARN de una sola célula han revelado la notable heterogeneidad de las neuronas sensoriales DRG tanto en humanos24 como en ratones25, la criosección adecuada del tejido DRG es fundamental para investigar el papel funcional de diferentes células DRG en diversas condiciones fisiológicas y patológicas.
Aunque la técnica de limpieza de tejidos se ha aplicado para investigar la reconstrucción 3D del DRG26 como una técnica alternativa de criosección del DRG, la técnica de limpieza de tejidos requiere tiempo y trabajo. En comparación, la criosección de la GRD es rápida y relativamente fácil de realizar, por lo que sigue siendo una técnica clave para los estudios de inmunohistoquímica y estructura de la GRD y otras regiones del sistema nervioso central. Sin embargo, la obtención de secciones de criostato de alta calidad, intactas y planas en portaobjetos de vidrio sigue siendo un desafío en la investigación neurocientífica debido al pequeño tamaño de la muestra de tejidos, como el DRG y ciertas regiones del cerebro, y no hay ningún artículo que describa el protocolo óptimo en este momento para crioseccionar muestras de tejido de pequeño tamaño, como los DRG de ratón.
Este protocolo proporciona una técnica fácil y paso a paso para el corte de criostato del DRG del ratón para obtener de manera confiable la mayor cantidad de secciones de DRG de alta calidad en los portaobjetos para estudios posteriores de DRG. Si bien está diseñada específicamente para crioseccionar muestras de DRG, esta técnica puede usarse potencialmente para crioseccionar otros tejidos con un tamaño de muestra pequeño.
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Protocol
Para el presente estudio, los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UCSF y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Aquí se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6 adultos de 8 a 12 semanas de edad (criados en casa).
1. Preparación de la muestra de DRG
- Anestesiar a los ratones con avertina al 2,5% (ver Tabla de Materiales). Asegurar una anestesia adecuada por la falta de respuesta a la estimulación dolorosa. Perfundir a los animales por vía transcárdica con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x seguida de formaldehído al 4%, como se describió anteriormente14,15,16.
- Diseccionar el tejido DRG de la médula espinal, como se describió anteriormente14,15,16.
- Fijar posteriormente los GRD disecados en formaldehído al 4% durante 3 h a temperatura ambiente.
- Poner los GRD en sacarosa al 30% en PBS a 4 °C durante la noche.
- Preparación de la temperatura óptima de corte de la base (OCT)
- Agregue el compuesto OCT (consulte la Tabla de materiales) para cubrir la superficie superior del bloque de aluminio y congele a -20 °C durante 5-10 minutos (Figura 1A).
- Corte la parte superior de la OCT con el criostato (ver Tabla de Materiales) a 30 μm de espesor hasta que su superficie sea plana como la OCT base (Figura 1B).
- Haga una marca en la parte inferior (posición de las seis en punto) de la OCT base para marcar su orientación, antes de quitar el bloque de aluminio del criostato (Figura 1C).
- En los siguientes pasos, mantenga la marca en la posición de las seis en punto para mantener la misma orientación, lo que puede llevar a obtener más secciones de la muestra de DRG.
NOTA: Si se pierde la orientación y la muestra de DRG se corta en un ángulo diferente, la muestra de DRG no se puede cortar completamente de arriba a abajo, lo que dejará algunas muestras en la OCT base y se desperdiciarán, ya que la OCT base se encontrará al intentar cortar la muestra de DRG (Figura 1C).
- Realización de la incrustación de OCT de DRG
- Seque el pañuelo DRG antes de colocarlo en la OCT.
- Antes de agregar el DRG al bloque, asegúrese de eliminar la solución de sacarosa/PBS al 30% alrededor de la muestra.
- Seque la muestra de DRG colocándola en una placa de Petri seca (Figura 2A) y moviéndola de un lugar a otro dos o tres veces con pinzas secas (Figura 2B).
- Seque las pinzas con un pañuelo sin pelusa antes de mover otra muestra de DRG (Figura 2C).
- Coloque el DRG seco en la OCT base.
- Con pinzas secas, coloque el DRG seco en la OCT base en la posición de las 12 en punto (Figura 1D).
- Mantenga al menos 5 mm entre el borde superior del DRG y el borde superior de la OCT base.
- Coloque la parte dorsal del GRD en la posición de las 12 en punto y la parte ventral en la posición de las seis en punto (Figura 1D).
- Incruste el tejido DRG con OCT.
- Agregue más OCT para cubrir toda la muestra de DRG en forma redonda u ovalada, con el DRG en el centro (Figura 1E).
- Asegúrese de que el borde superior de la OCT cubra el DRG en el borde superior de la OCT base (Figura 1F), ya que esto facilita la transferencia de la sección al portaobjetos de vidrio (Figura 3A).
NOTA: Si la OCT de cubierta está en el medio de la OCT base, el borde superior de la OCT base bloqueará el portaobjetos de vidrio para recoger la sección (Figura 3B). - Congele la muestra de OCT y DRG de la cubierta a -20 °C durante otros 5 minutos (Figura 1G). No recorte la OCT alrededor de la muestra de DRG.
- Corte la parte superior de la OCT de la cubierta con un grosor de 30 μm hasta que el DRG sea visible.
- Seque el pañuelo DRG antes de colocarlo en la OCT.
2. Crioseccionamiento del GRD
- Cambie el grosor de la sección del criostato a 12 μm para cortar secciones de DRG en el portaobjetos (Figura 1H).
- Sujete la sección OCT en la parte inferior con un pincel pequeño enfriado a -20 °C.
NOTA: Es importante no cortar toda la sección por completo, sino dejar 1-3 mm sin cortar (Figura 1I). - Use el extremo de una pinza a temperatura ambiente para tocar suavemente la parte inferior (posición de las seis en punto) de la sección para que se adhiera a la superficie de la plataforma (Figura 1J). Esto evita que la sección se curve hacia atrás en un rollo, lo que dificulta la recogida de la sección en el portaobjetos.
NOTA: Cuando la parte inferior de la sección se adhiere a la superficie de la plataforma, y la parte superior de la sección aún se conecta con el OCT de la cubierta, la sección tiene una forma plana (Figura 1K), lo que facilita mucho la recolección de la sección en el portaobjetos. - Tome un portaobjetos de vidrio cargado (consulte la Tabla de materiales) y coloque lentamente el portaobjetos sobre la sección. Tan pronto como la sección comience a pegarse a la guía, tire suavemente de la guía hacia atrás (Figura 1L).
- Siga el mismo proceso para colocar más secciones de DRG en la diapositiva sin superponer las secciones (Figura 1M). Asegúrese de que no se coloque una nueva sección de DRG sobre la OCT de otra sección de DRG (Figura 4), ya que dicha sección no puede permanecer bien en el portaobjetos y puede lavarse durante el proceso de tinción inmunoquímica.
3. Tinción Nissl de la sección DRG en el portaobjetos de vidrio
- Lavar las secciones durante 10 min en PBS más 0,1% Triton X-10. Luego, lave las secciones dos veces con PBS.
- Aplique un tinte de Nissl 1:300 (consulte la Tabla de materiales) al portaobjetos e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Lave la sección con PBS más 0.1% Triton X-100. Luego, lave las secciones dos veces con PBS durante 5 minutos y luego durante 2 h a temperatura ambiente.
- Aplique 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) fluoromount-G (ver Tabla de Materiales) para cubrir las secciones con un cubreobjetos.
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Representative Results
El estudio actual recolectó alrededor de 16 secciones de DRG continuas y de alta calidad de un DRG L4 de ratón. Las secciones obtenidas no tenían ninguna distorsión. La Figura 1 muestra el procedimiento paso a paso para la criosección. La eliminación del exceso de líquido de las secciones de tejido se muestra en la Figura 2. El proceso de inclusión de los tejidos por OCT se destaca en la Figura 3. La Figura 4 muestra la colocación correcta de las secciones DRG en los portaobjetos de vidrio. La Figura 5 muestra la imagen de microscopía de fluorescencia confocal de la estructura fisiológica de las secciones de DRG de ratón. La tinción de Nissl muestra las neuronas sensoriales DRG de varios tamaños, y la tinción de DAPI muestra las células que rodean a las neuronas. Esta imagen muestra la calidad de las secciones DRG obtenidas con este protocolo. Se pueden aplicar diferentes anticuerpos para los estudios inmunohistoquímicos de la GRD, incluido el estudio de diferentes tipos de neuronas en la GRD.
Figura 1: Procedimiento paso a paso para crioseccionar DRG de ratón . (A) La OCT se congela en la superficie superior del bloque de aluminio. (B) La parte superior de la PTU está cortada en plano. (C) Se hace una marca en la parte inferior (posición de las seis en punto) de la OCT base. (D) El DRG se coloca en la OCT base, con la parte ventral mirando hacia la marca. (E) Se agrega más OCT para cubrir toda la muestra de DRG. (F) El borde superior de la OCT que cubre el DRG debe estar en el borde superior de la OCT base. (G) La muestra de OCT y DRG de cobertura está congelada. (H) La parte superior de la OCT de cubierta se corta hasta que el tejido DRG sea visible (marcado con la flecha roja). (I) La sección OCT se mantiene en la parte inferior con un pincel preenfriado. (J) La parte inferior de la sección se pega en la superficie de la plataforma utilizando el extremo de las pinzas a temperatura ambiente. (K) Otra vista de (J) muestra que la parte inferior de la sección se adhiere a la superficie de la plataforma y la parte superior aún se conecta con la cubierta OCT. (L) La sección está pegada a un tobogán de vidrio. (M) El mismo proceso se repite para obtener más secciones DRG en el portaobjetos sin superponer secciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Técnica para eliminar el exceso de líquido del tejido DRG. (A) El tejido DRG se coloca en una placa de Petri seca directamente de una solución de sacarosa al 30%, que tiene una gran cantidad de líquido circundante. (B) El tejido DRG se mueve a una ubicación vecina en la placa de Petri usando pinzas secas para eliminar el líquido circundante adicional. (C) Las pinzas se secan con una toallita sin pelusa cada vez que se mueve el pañuelo DRG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La importancia de colocar correctamente la OCT de cubierta sobre la OCT base. (A) El lugar ideal de la OCT de cubierta: (A-1) El borde superior de la OCT que cubre el tejido DRG debe estar en el borde superior de la OCT base. (A-2) La sección no debe cortarse completamente, con una pequeña parte conectada al borde superior de la OCT de cubierta. (A-3) La sección se transfiere suavemente al portaobjetos de vidrio. (A-4) El dibujo muestra que, en términos de la sección en el borde superior, es fácil transferir la sección a la corredera de vidrio. La línea curva negra indica la sección que se ha cortado. (B) Ubicación incorrecta de la OCT de cubierta. (B-1) El tejido de DRG que cubre la OCT se coloca en el centro de la OCT base. (B-2) La sección no está completamente cortada, con una pequeña parte conectada al borde superior de la OCT de la cubierta. (B-3) El borde superior del bloque de aluminio evita que la corredera de vidrio toque la sección. Las flechas rojas indican la distancia entre la corredera de vidrio y la sección cortada. (B-4) El dibujo muestra que el portaobjetos de vidrio está bloqueado antes de tocar la sección. La línea curva negra indica la sección que se ha cortado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La colocación correcta de las secciones de DRG en el portaobjetos de vidrio. (A) El método correcto para colocar las secciones de DRG una al lado de la otra sin superponer la sección de DRG y la OCT de otras secciones de DRG. (B) El método incorrecto para colocar las secciones de DRG en la OCT de otra sección de DRG. Debido a que la segunda sección DRG no se adhiere directamente al portaobjetos de vidrio, se puede lavar fácilmente durante los procesos posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Tinción de Nissl de ratón L4 DRG. Un ejemplo de una imagen confocal de 20x de una sección DRG L4 del ratón. El verde indica Nissl (neurona) y el rojo indica DAPI (núcleo). La barra de escala representa 50 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo proporciona un procedimiento sencillo paso a paso para el seccionamiento por criostato del DRG del ratón para obtener secciones de DRG de alta calidad en portaobjetos de forma fiable. Hay cuatro pasos críticos en este protocolo. Primero, la muestra de DRG y las pinzas deben estar secas antes de colocar la muestra de DRG en la OCT base. Cualquier líquido que rodee la muestra de DRG formará una capa de hielo a su alrededor, lo que hará que las secciones de DRG se separen de la OCT y se curven hacia arriba. En segundo lugar, si el bloque de aluminio no tiene una marca, o si el OCT base cubre la marca, es importante hacer una marca en la parte inferior (posición de las seis en punto) del OCT base y mantener esta marca en la posición de las seis en punto durante todo el proceso. Mantener una orientación constante ayuda a obtener más secciones de DRG, ya que de lo contrario el DRG no se puede cortar completamente de arriba a abajo, y algunas muestras de DRG se dejarán fuera y se desperdiciarán. En tercer lugar, los bordes superiores tanto de la OCT base como de la OCT de cubierta deben estar en el borde superior del bloque de aluminio. De esta manera, el borde superior del bloque de aluminio no bloqueará la corredera de vidrio para que no tome las secciones DRG. En cuarto lugar, es importante evitar colocar la sección DRG dentro de la OCT de las secciones DRG vecinas, porque la segunda sección DRG no se pegará directamente al portaobjetos de vidrio y, por lo tanto, puede lavarse fácilmente en el proceso posterior.
La criosección de GRD es una tecnología muy importante en la investigación de GRD en los mecanismos del dolor y la picazón 1,2. Sin embargo, debido al volumen muy pequeño de DRG de ratón, la recolección de secciones de criostato adecuadas de muestras de DRG de ratón suele ser un desafío. Un problema importante es que las secciones OCT que contienen DRG tienden a curvarse en un rollo, lo que dificulta la colocación de las secciones en los portaobjetos de vidrio. Otro problema es que, debido a que la muestra de DRG de ratón es muy delgada, es difícil obtener suficientes secciones de DRG a partir de una muestra de DRG si la configuración de criosección no está optimizada. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para la criosección de DRG en ratones, lo que hace que la recolección de secciones de DRG de alta calidad sea fácil y práctica. Con este protocolo, podemos recopilar alrededor de 16 secciones DRG continuas y de alta calidad de un DRG L4 de ratón.
Una limitación de este protocolo es que no puede proporcionar una reconstrucción 3D directa como técnica de limpieza de tejidos26. Sin embargo, como con este método podemos obtener secciones continuas y de alta calidad, podemos tomar imágenes de estas secciones continuas para reconstruir imágenes en 3D.
Aunque el protocolo para la criosección de GRD se desarrolla a partir de ratones adultos jóvenes de 8 a 12 semanas de edad, este protocolo se puede aplicar para crioseccionar GRD humanos y GRD de ratones de edades más jóvenes o mayores. De hecho, este protocolo debería poder aplicarse para la criosección de cualquier volumen de muestras.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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