Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Respirometri med høj opløsning til vurdering af mitokondriefunktion i humane spermatozoer

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

Analysen af sædmitokondriefunktion ved respirometri med høj opløsning tillader måling af iltforbruget af frit bevægelige spermatozoer i et lukket kammersystem. Teknikken kan anvendes til at måle åndedræt i humane spermatozoer, hvilket giver information om sædmitokondrieegenskaber og integritet.

Abstract

Sædkvalitet studeres ofte ved rutinemæssig sædanalyse, som er beskrivende og ofte ufattelig. Mandlig infertilitet er forbundet med ændret sædmitokondrieaktivitet, så måling af sædmitokondriefunktion er en indikator for sædkvalitet. Respirometri med høj opløsning er en metode til måling af iltforbruget af celler eller væv i et lukket kammersystem. Denne teknik kan implementeres til at måle åndedræt i menneskelig sæd og giver information om sædmitokondriernes kvalitet og integritet. Respirometri med høj opløsning gør det muligt for cellerne at bevæge sig frit, hvilket er en a priori fordel i tilfælde af sædceller. Denne teknik kan anvendes med intakte eller permeabiliserede spermatozoer og muliggør undersøgelse af intakt sædmitokondriefunktion og aktiviteten af individuelle åndedrætskædekomplekser. Det højopløselige oxygrafinstrument bruger sensorer til at måle iltkoncentrationen kombineret med følsom software til at beregne iltforbruget. Dataene bruges til at beregne respiratoriske indekser baseret på iltforbrugsforholdene. Derfor er indekserne proportionerne af to iltforbrugshastigheder og normaliseres internt til celleantallet eller proteinmassen. Respiratoriske indekser er en indikator for sædmitokondriefunktion og dysfunktion.

Introduction

Mandlig infertilitet anslås at tegne sig for 40% -50% af alle tilfælde af infertilitet hos par1. Konventionel sædanalyse spiller en afgørende rolle i bestemmelsen af mandlig fertilitet; Imidlertid har ca. 15% af infertile mænd normale sædparametre2. Derudover giver rutinemæssig sædanalyse begrænset information om sædfunktion og afspejler ikke subtile sæddefekter3.

Spermmitokondrier har en særlig struktur, da de er arrangeret som en spiralformet kappe omkring flagellen. Mitokondrieskeden indeholder et variabelt antal mitokondrier forbundet med intermitokondriebindinger og forankret til cytoskelettet ved ordnede proteinarrangementer på den ydre mitokondriemembran 4,5. Denne struktur gør det særligt vanskeligt at isolere sædmitokondrier. Derfor bruger de fleste undersøgelser af sædmitokondriefunktion in situ-analyser eller afmembranerede sædceller6.

Sperm mitokondrie struktur og funktion har været konsekvent forbundet med mandlig infertilitet 7,8,9,10,11, hvilket tyder på, at analyse af strukturen og funktionen af disse organeller kan være en god kandidat til optagelse i sædanalyse.

Mitokondrier spiller en vigtig rolle i cellulær energimetabolisme, især ved at bruge ilt til at producere adenosintrifosfat (ATP) gennem oxidativ phosphorylering (OXPHOS). Især i spermatozoer er kilden til ATP (glykolyse vs. OXPHOS) omstridt, og mange af dataene forbliver kontroversielle og afhænger af forskellige eksperimentelle tilgange 4,12,13. Målinger af respiration ved oximetri giver betydelig indsigt i mitokondriel åndedrætskapacitet, mitokondriel integritet og energimetabolisme af cellen14,15,16. Traditionelt er denne teknik blevet udført ved hjælp af Clark oxygenelektrode - et instrument, der er blevet brugt til at måle mitokondriel respiration i mere end 50 år17,18. Derudover er sædmitokondriets iltforbrug blevet analyseret ved hjælp af den klassiske Clark iltelektrode 19,20,21. Respirometri med høj opløsning (HRR) ved hjælp af oxygrafer (Oroboros) giver højere følsomhed end ved brug af klassiske respirometriindretninger22. Oxygraferne består af to kamre med injektionsporte, og hvert kammer har en polarografisk iltføler. Med denne teknik er det muligt at analysere vævsdias, celler og isolerede mitokondriesuspensioner. Prøven omrøres kontinuerligt i kammeret, og under eksperimentet måles iltforbruget, og ilthastighederne beregnes ved hjælp af specifik software. Kamrene viser reduceret iltlækage, hvilket er en fordel i forhold til de konventionelle iltelektrodeanordninger14,23.

Som med andre celler, i tilfælde af spermatozoer, er følsomheden af HRR-udstyr højere end for konventionel respirometri, hvilket betyder, at HRR-udstyr kan bruges til analyse af et begrænset antal intakte eller permeabiliserede sædceller. Der er to hovedstrategier til vurdering af sædmitokondriefunktion ved HRR: (a) måling af iltforbruget i intakte celler, hvilket indebærer reproduktion af åndedrætsfunktionen i et medium, der indeholder substrater såsom glukose, eller (b) måling af iltforbruget i permeabiliserede celler ved hjælp af et af OXPHOS-komplekserne med tilsætning af specifikke substrater til overvågning af hver funktion separat.

I denne undersøgelse beskriver vi brugen af HRR til bestemmelse af mitokondriel respiration i humane sædceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsøgene blev godkendt af den etiske komité ved Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Figure 1
Figur 1: Workflow for respirometri med høj opløsning til vurdering af mitokondriefunktion i intakt og permeabiliseret human sæd. Protokollen blev opdelt i fire forskellige trin: 1) forberedelse af prøven, 2) iltkalibrering i Oroboros-instrumentet, 3) måling af iltforbrug for intakte og permeabiliserede celler og 4) dataekstraktion fra udstyret og analysen. Forkortelser: CASA = computerassisteret sædanalyse; BWW = Biggers Whitten Whittingham medium; MRM = mitokondrie respirationsmedium; ADP = adenosindiphosphat; FCCP = carbonylcyanid -p- trifluoromethoxyphenylhydrazon AA = antimycin A. Klik her for at se en større version af denne figur.

BEMÆRK: Arbejdsprocessen til måling af iltforbruget i sædceller ved hjælp af HRR er vist i figur 1. Oplysninger om materialer, udstyr og reagenser, der anvendes i protokollen, er præsenteret i materialetabellen.

1. Forberedelse af prøver

  1. Prøveindsamling
    1. Opsaml frisk ejakuleret menneskelig sæd ved onani efter en anbefalet 3 dages afholdenhed i en steril plastbeholder. Transporter prøverne straks til laboratoriet.
    2. Inkuber prøverne i 30-60 minutter ved stuetemperatur (RT) for at flyde helt24.
    3. Efter fortætning opbevares prøverne ved 37 °C, indtil forsøget påbegyndes.
  2. Sædvurdering med computerstøttet sædanalyse (CASA)
    1. Bland prøven, og læg 7 μL i et forvarmet sædtællekammer.
    2. Kammeret anbringes på det forvarmede trin (37 °C) i et direkte lysmikroskop.
    3. Åbn den computeriserede sædanalysesoftware, og indtast motilitets- og koncentrationsmodulet (klik på Mot).
    4. Vælg den konfiguration, der svarer til menneskelige sædforhold.
      BEMÆRK: Konfigurationen skal tilpasses kammerets type og dybde samt prøvearten og systemet CASA.
    5. Analysér tilfældigt 10 forskellige felter pr. kammer ved at klikke på knappen Analyser .
    6. Klik på Resultater for at opnå prøvekoncentration og bevægelighed.
  3. Celle forberedelse
    BEMÆRK: Hvis HRR ikke er kalibreret, skal du starte med trin 2.1-2.2, før du klargør cellerne (trin 1.3). Det er vigtigt at måle iltforbruget straks, når sædcellerne resuspenderes i mediet.
    1. Prøverne centrifugeres ved 400 x g i 10 minutter ved RT.
    2. Fjern sædplasmaet, og resuspender spermatozoerne i 2 ml Biggers Whitten Whittingham (BWW) til eksperimenter med intakte celler eller mitokondrie-respirationsmedium (MRM) til undersøgelser med permeabiliserede celler. Mediernes sammensætning er vist i tabel 1.
    3. Gentag trinnene beskrevet i trin 1.2 for sædkoncentrationsundersøgelser.

2. Respirometri med høj opløsning: OXPHOS-analyse

BEMÆRK: HRR integrerer meget følsomme oxygrafer (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Østrig) med software (DatLab, version 4.2; Oroboros Instruments GmbH). De eksperimentelle data vises som iltkoncentrationen versus tiden (som pmol af O2/106 celler ·min-1) og som realtidstransformationer af disse data, så eksperimentatoren kan spore åndedrættet (iltforbrug, iltflux) af biologiske og biokemiske prøver, mens eksperimentet stadig kører. HRR kan bruges til at følge respirationen af levende og bevægelige celler, hvilket er særligt nyttigt for sædceller, hvis bevægelighed er forbundet med sædkvaliteten og fertilitetspotentialet. Laboratoriet bruger en HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, med to kamre. De trin, der er beskrevet i denne protokol, skal udføres uafhængigt for begge 2 ml kamre.

  1. Forberedelse af udstyr
    1. Tænd HRR, og tilslut den til respirometrisoftwaren (DatLab) til dataindsamling og analyse.
    2. Udskift 70% ethanol i oxygrafkammeret med ddH2O. Omrør det kontinuerligt med den magnetiske omrøring i kammeret ved 750 omdr./min. Lad det stå i 10 min, og sug derefter den dobbeltdestillerede (dd) H2O.
    3. Kammeret vaskes tre gange med ddH2O i 5 minutter hver gang.
      BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at fjerne den resterende ethanol fra kamrene. Sædceller er meget følsomme over for ethanol. Optagelsen kan blive kompromitteret, hvis dette trin udelades.
  2. Kalibrering af iltfølere
    BEMÆRK: Kalibreringsproceduren varierer lidt afhængigt af instrumentet. Der udføres en luftkalibrering af den polarografiske iltføler som beskrevet af fabrikanten25. I dette afsnit forklares kalibreringsprotokollen kort.
    1. ddH 2 O fjernes, og der pipetteres2ml af det samme medium, der anvendes til cellepræparationen, ind i kammeret. Placer propperne, og efterlad en luftudvekslingsboble.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at kende kammerets volumen for at bestemme det nøjagtige volumen medium, der er nødvendigt.
    2. Registrer iltkalibreringsværdierne (klik på Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) for at overvåge sensormembranens ydeevne ved at omrøre mediet med omrøringsstangen ved 750 omdr./min. i mindst 30 minutter ved 37 °C. Brug de andre indstillinger som nævnt: forstærkning til sensor: 2; polarisationsspænding: 800 mV; Dataregistreringsinterval: 2,0 sek.
      BEMÆRK: Det forventes at opnå enO2-hældning ukorrigeret (rød linje) inden for ±2 pmol∙s−1∙mL−1 med et stabilt signal fra den polarografiske sensor.
    3. Træk musen, mens du holder venstre museknap og shift-tasten nede for at vælge et område, hvor ændringen i iltkoncentration (Y1 O2-koncentration, blå linje) er stabil.
    4. Åbn vinduet O2-kalibrering (klik på Oxygraph > O2-kalibrering). I Luftkalibrering skal du ændre det markerede mærke til det område, der blev valgt i trin 2.2.3. Afslut ved at klikke på Kalibrer og kopier til udklipsholder.
    5. Stop optagelsen, og gem ved at klikke på Oxygraph > Ok Control > Gem og afbryd.
      BEMÆRK: Dette datasæt skal gemmes, så det kan bruges i alle dagens eksperimenter. Kalibreringen udføres kun én gang dagligt for hvert medium.
  3. Digitonin-permeabiliseringstitrering
    1. Åbn kammeret, og aspirer mediet indeni.
    2. Der anbringes mindst 24 x 10 6 og højst 70 x 106 sædceller i kammeret i et slutvolumen på 2 ml MRM.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at måle antallet af celler i kammeret for at justere iltforbruget ved forsøgets afslutning. Et lavere antal celler end anbefalet kan ikke måles.
    3. Luk kammeret ved at skubbe propperne helt ind, og sug den resterende væske øverst. Start eksperimentet med de samme indstillinger som for kalibreringen: omrøringshastighed: 750 o / min; temperatur: 37 °C; forstærkning til sensor: 2; polarisationsspænding: 800 mV; og dataregistreringsinterval: 2,0 s.
    4. For at indlæse kalibreringen skal du dobbeltklikke på feltet Pos Calib i nederste hjørne. Åbn kalibreringen udført i trin 2.2 (klik på Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File), og klik på Kalibrer og kopier til udklipsholder.
      BEMÆRK: POS-kaliberboksen skifter fra gul til grøn. Dataene vises i iltstrøm korrigeret pr. volumendiagram (layout 05 flux pr. volumen ukorrigeret). Forskellige layouts er tilgængelige i Oxygraph > Layout.
    5. Tilsæt 5 μL 0,5 M adenosindiphosphat (ADP), 10 μL 2 M glutamat og 2,5 μL 0,4 M malat (slutkoncentrationer: 1,25 mM, 10 mM og 0,5 mM). Mål iltforbruget, indtil signalet stabiliseres.
      BEMÆRK: Precision Hamilton mikrosprøjter anvendes til injektion gennem påfyldningsporten i proppen. Brug en sprøjte pr. lægemiddel for at undgå krydskontaminering. Klik på F4 for at registrere, og markér i iltregistret, når en behandling tilføjes.
      BEMÆRK: Substraterne fremstilles i ultrarent vand og opbevares ved -20 °C i 3 måneder.
    6. Tritat ved tilsætning af 1 μL 10 mM digitonin i successive trin, indtil iltforbruget når et maksimalt niveau.
      BEMÆRK: Grundig vask med vand, 70% ethanol og 100% ethanol er afgørende, hvis det samme kammer bruges til to forsøg på samme dag.
      BEMÆRK: Digitonin fremstilles i ultrarent vand og opbevares ved -20 °C i 3 måneder.
  4. Rutinemæssig respirationsvurderingsprotokol for intakte og permeabiliserede sædceller (kompleks I eller kompleks II)
    1. Åbn kammeret, og aspirer mediet indeni.
    2. Fyld i kammeret mindst 24 x 10 6 og ikke mere end 70 x 106 sædceller i et slutvolumen på 2 ml BWW (intakt celleanalyse) eller MRM (permeabiliseret celleanalyse).
    3. Start eksperimentet med de samme indstillinger som for kalibreringen (dette er beskrevet i trin 2.3.3).
    4. Den kalibrering, der blev udført i trin 2.2, indlæses som beskrevet i trin 2.3.4.
    5. Optag cellernes åndedræt i mindst 5 minutter, indtil der opnås et stabilt signal. Denne måling svarer til basal respiration i intakte celler.
    6. Hvis forsøget er med intakte celler, fortsættes til trin 2.4.9. For permeabiliserede celler injiceres 4,5 μL 10 mM digitonin (slutkoncentration: 22,5 μM). Permeabiliser cellerne i 5 min.
    7. Substraterne tilsættes: 10 μL 2 M glutamat og 2,5 μL 0,4 M malat (slutkoncentrationer: henholdsvis 10 mM og 0,5 mM) til kompleks I eller 20 μL 1 M succinat (slutkoncentration: 10 mM) til kompleks II. Mål iltforbruget, indtil signalet stiger og stabiliseres. Dette er tilstand 4, hvilket betyder basalkompleks I eller basalkompleks II understøttet åndedræt i fravær af ADP.
      BEMÆRK: Substraterne fremstilles i ultrarent vand og opbevares ved -20 °C i 3 måneder.
    8. Injicer 5 μL 0,5 M ADP (slutkoncentration: 1,25 mM). Mål iltforbruget, indtil signalet stiger og stabiliseres. Tilsætningen af ADP øger signalet svarende til det maksimale iltforbrug gennem kompleks I eller kompleks II (tilstand 3 i permeabiliserede celler).
    9. Tilsæt 1 μL 4 mg / ml oligomycin (slutkoncentration: 2 μg / ml), en ATP-syntetasehæmmer. Mål iltforbruget, indtil signalet falder og stabiliseres.
      BEMÆRK: Oligomycin fremstilles i ethanol og opbevares ved -20 °C i 3 måneder.
    10. Der titreres ved at tilsætte 1 μL 0,1 mM til 1 mM carbonylcyanid-P-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) i successive trin, indtil en maksimal ukoblet respirationshastighed er nået. Mål iltforbruget, indtil signalet stiger og stabiliseres.
      BEMÆRK: FCCP fremstilles i ethanol og opbevares ved -20 °C i 3 måneder.
    11. Den endelige koncentration af FCCP er prøveafhængig. Stop med at injicere lægemidlet, når iltforbruget begynder at falde.
    12. Til sidst injiceres 1 μL 5 mM antimycin A (2,5 μM slutkoncentration). Dette er en kompleks III-hæmmer til at skelne mellem mitokondrie og resterende iltforbrug (ikke-mitokondriel respiration). Til analyse af kompleks I tilsættes 1 μL 1 mM rotenon (0,5 μM slutkoncentration), en hæmmer af dette kompleks, i stedet for AA. Mål iltforbruget, indtil signalet falder og stabiliseres.
      BEMÆRK: Lægemidlerne fremstilles i ethanol og opbevares ved -20 °C i 3 måneder.

3. Dataudtræk og analyse

Figure 2
Figur 2: Erhvervelse af respiratoriske parametre fra et respirometrieksperiment med høj opløsning. (A,B) Skematiske gengivelser af grafer opnået som beskrevet i figur 1 for henholdsvis intakte og permeabiliserede celler. Disse parametre er tidligere beskrevet15. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Træk musen ved at trykke på venstre museknap og shift-tasten for at vælge områder, hvor iltstrømmen pr. volumen korreleret (Y2 O2 hældning uncorr., rød linje) er stabil efter injektion af et substrat eller en inhibitor. Figur 2 viser de forskellige parametre fra det tidligere beskrevne register15.
    BEMÆRK: Parametrene afhænger af eksperimentet; alle er som følger: basal respiration i intakte celler og åndedræt i nærvær af glutamat / malat eller succinat (tilstand 4), ADP (tilstand 3), oligomycin (protonlækage), FCCP (maksimal respirationshastighed), rotenon / AA (ikke-mitokondriel respiration). I permeabiliserede celler svarer basal respiration til tilstand 3.
  2. Klik på vinduerne Mærker > statistik , og eksporter dataene.
  3. Normaliser de opnåede data pr. 1 million sædceller. Enhederne i skråningerne er pmolO2·s-1·ml-1·10-6 celler.
  4. Træk det ikke-mitokondrie iltforbrug fra alle værdierne, før indekserne beregnes.
  5. Beregn indekserne ved hjælp af de forskellige ligninger, der tidligere er beskrevet15:
    Equation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestemmelse af den optimale koncentration af digitonin i sædceller
I denne protokol præsenterer vi brugen af HRR til at overvåge ændringer i realtid i OXPHOS i humane sædceller. Da metoden kan bruges til at analysere intakt eller digitoninpermeabiliseret sæd, præsenterer vi først standardiseringen af digitoninkoncentration, der kræves for at permeabilisere sædceller (figur 3).

Digitonin anvendes til kemisk permeabilisering, som gør det muligt for substrater at komme ind i celler og til måling af mitokondrieaktivitet. Denne forbindelse skal titreres i intakte celler for at opnå den optimale koncentration, der kræves for at sikre cellemembranpermeabilisering uden at gå på kompromis med mitokondriemembranintegriteten. Vi udførte en titrering i nærværelse af ADP, glutamat og malat. Respirationsraterne blev målt ved baseline og efter gradvis tilføjelse af digitonin (figur 3A). Iltforbruget stiger med stigende koncentration af vaskemiddel og når et punkt, hvor integriteten af den ydre mitokondriemembran begynder at blive kompromitteret (rød pil i figur 3A). Figur 3B viser den gennemsnitlige ± standardfejl for 4 repræsentative forsøg. Resultatet viser, at permeabilisering er optimal ved en digitoninkoncentration på 22,5 μM (figur 3A,B). Mitokondrieaktiviteten falder, når der anvendes for store mængder digitonin.

Repræsentation af vellykket og suboptimalt register over sædrespiration ved HRR
Under overvågning af sædmitokondriel respiration kan registret visualiseres som O2-koncentration (blå linje) ogO2-flow pr. volumen korreleret (rød linje) beregnet med DatLab 4-analysesoftwaren i både permeabiliserede og ikke-permeabiliserede celler (figur 4). Figur 4 viser repræsentative kurver af intakte (figur 4A, B) og digitoninpermeabiliserede (figur 4C, D) sædceller fra en sædprøve. Figur 4A viser en vellykket registrering af intakte sædceller fra en sædprøve, hvor effekten af lægemidler, der modulerer iltforbruget, observeres, og det er muligt at udtrække parametrene til beregning af indekserne. Basal respiration registreres i intakte celler ved iltforbrug i nærvær af eksogene substrater. Derefter blev den ikke-phosphorylaterende respirationshastighed målt ved tilsætning af en ATP-syntasehæmmer (oligomycin). Derefter blev protonoforen FCCP injiceret i forskellige koncentrationer, og den maksimale mitokondrie ukoblede respirationshastighed blev bestemt. Dette lægemiddel fører til en stigning i protonpermeabiliteten af den indre membran, hvilket gør det muligt for den passive bevægelse af protoner at sprede den kemiosmotiske gradient, der forårsager en stigning i iltforbruget. Endelig blev AA tilføjet for at hæmme mitokondriel respiration.

Kvaliteten af de opnåede data er tæt forbundet med cellenummeret. Det er vigtigt at have et højt basalt iltforbrug for at opnå en god rekord. Den efterfølgende analyse afhænger af subtile ændringer iO2-forbruget , der muligvis ikke detekteres, hvis basallinjen ikke er høj nok. Celletal, der er lavere end anbefalet, kan føre til et resultat som figur 4B.

Repræsentative kurver opnået ved hjælp af protokollen for komplekse I- eller II-specifikke substrater er vist i henholdsvis figur 4C og figur 4D. For at studere iltforbruget gennem mitokondriekomplekset I eller kompleks II blev substraterne malat og glutamat eller succinat tilsat efter permeabilisering af cellerne. Derefter tilføjes ADP til konvertering til ATP (tilstand 3, aktiv kompleks I eller II afhængig respiration). Endelig administreres rotenon eller AA for at hæmme henholdsvis kompleks I eller II.

Til fortolkning af resultaterne er det vigtigt at overveje, at cellulær respiration hæmmet af oligomycin er en direkte måling af protonlækagehastighed over mitokondriemembranen i intakte celler, hvilket er sammenligneligt med tilstanden 4 af permeabiliserede celler (uden ADP) (figur 2B). I tilfælde af intakte celler (ikke-permeabiliseret) indikerer dette beløb den brøkdel af basal mitokondriel iltforbrug, der er uafhængig af ATP-syntese. Den maksimale respirationshastighed nås efter tilsætning af flere doser FCCP. I intakte celler afhænger af to faktorer; Aktiviteten af elektrontransportkomplekserne og antallet af mitokondrier i hver celle. Tilstand 3 af permeabiliserede celler efter tilsætning af ADP ligner basal respiration af den intakte celle ved mættende koncentrationer af eksogene substrater (figur 2B)7. Tabel 2 viser et eksempel på indeksene beregnet ud fra posterne i figur 4.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af den optimale koncentration af digitonin til permeabilisering af humane sædceller. Respirationshastighederne blev målt ved 37 °C i MRM-medium med glutamat, malat og adenosindiphosphat. A) Repræsentativt spor efter luftvejene. Den blå linje er O2-koncentrationen, og den røde linje repræsentererO2-strømmen pr. Korreleret volumen. (B) Mitokondriers respirationshastighed betyder ± standardfejl, n = 4. Den røde pil repræsenterer den optimale koncentration. Forkortelse: dig = digitonin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative respiratoriske spor for iltforbrugshastigheden opnået ved hjælp af Oroboros-instrumentet. Respirationshastighederne blev målt ved 37 °C i (A,B) intakte og (C,D) permeabiliserede celler. Den blå linje er O2-koncentrationen, og den røde linje repræsentererO2-strømmen pr. Korreleret volumen. Satserne i A, C og D blev målt med mere end 30 x 10 6 sædceller, mens hastigheden i B blev målt med 14 x 106 sædceller. Forkortelser: Oligo = oligomycin; FCCP = carbonylcyanid -p- trifluoromethoxyphenylhydrazon Glu/Mal = glutamat/malat; ADP = adenosindiphosphat; AA = antimycin A; Rot = rotenon. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammensætning af BWW- og MRM-medier til forsøg med henholdsvis intakte eller permeabiliserede celler. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Repræsentative eksempler på HRR-indeks. Data blev opnået fra sporene vist i figur 4. Indeksene er beregnet i henhold til figur 2 og protokolafsnit 3. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HRR afhænger kritisk af flere trin: (a) vedligeholdelse af udstyr, (b) nøjagtig kalibrering af iltsensorerne, (c) frakoblingstitreringen26 og endelig (d) tilstrækkelig brug af indekser, der repræsenterer mitokondriefunktionen. Vedligeholdelse af udstyr er afgørende. Det anbefales at udskifte membranerne i den polarografiske iltføler regelmæssigt og korrigere den instrumentelle baggrund. Omfattende vask efter indsamling af spermatozoer fra kamrene er afgørende for at opnå gode replikater, især i laboratorier, hvor instrumenterne ofte bruges til at analysere forskellige væv eller celler. Spermatozoer er følsomme over for selv små mængder rotenon, AA, oligomycin og FCCP, så vasketrinnet skal udføres omhyggeligt (mindst tre gange med ethanol og yderligere tre gange med destilleret vand). Kalibrering er et afgørende skridt; Det skal udføres hver dag og for hvert af de anvendte medier (se protokoltrin 2.2). Afkoblingstitrereringerne skal udføres omhyggeligt, da de optimale afkoblingskoncentrationer skal anvendes for at opnå maksimal stimulering af flux og undgå overtitrering, hvilket paradoksalt nok hæmmer respiration27. Den optimale afkoblingskoncentration afhænger af celletype, cellekoncentration og medium og er forskellig for permeabiliserede celler sammenlignet med intakte celler14. I tilfælde af sædprøver, hvor sædcellerne kan være heterogene, skal afkoblingen således tilpasses hver prøve28,29,30. Efter respirometri opnås flere parametre, der skal korrigeres for antallet af celler før analyse. Der beregnes tre indekser, der giver mulighed for fortolkning af mitokondriefunktionen, og disse har den fordel, at de er uafhængige af antallet af mitokondrier og celler. Vi fremhæver brugen af respiratorisk kontrolforhold (RCR), som angiver effektiviteten af mitokondriekobling og er følsom over for flere potentielle steder med dysfunktion7. Der kan dog anvendes andre parametre og indeks afhængigt af eksperiment31.

HRR's begrænsninger er som følger: (a) enheden er ikke automatiseret, så den kræver konstant tilstedeværelse af en operatør og er tidskrævende; b) HRR-anordningen har kun to kamre, og kun to assays kan udføres samtidigt c) kamrene er ikke engangsbrug og kan være kontamineret med inhibitorer eller en anden type væv (d) Selvom instrumentets følsomhed er meget høj, fandt vores team, at der kræves mindst 12 millioner / ml sædceller for at detektere variationer i iltforbruget, så vi kunne ikke måle sæd fra oligozoospermiske mænd; e) driftslederen skal være opmærksom på, at målingerne vedrører alle de celler, der indgår i prøverne. Sædprøver er heterogene og indeholder andre celletyper (fx leukocytter). For at undgå forurening er det nødvendigt at anvende prøver med lave koncentrationer af leukocytter7. Alternativt kan der udføres et yderligere sædrensningstrin forud for oximeterforsøgene (f.eks. swim-up eller swim-down)24.

Et alternativ til HRR er brugen af den ekstracellulære fluxanalysator. Fordelene ved den ekstracellulære fluxanalysator i forhold til oxygrafen med høj opløsning til måling af sædmetabolisme er som følger: (a) den ekstracellulære fluxanalysator er et stort set automatiseret instrument; b) det kan måle iltforbruget i plader med 24 brønde og 96 brønde til screening med høj kapacitet, hvilket betyder, at det kræver mindre mængder biologiske prøver og c) det tillader yderligere måling af sædglykolytisk flux. Nogle fordele ved HRR i forhold til den ekstracellulære fluxanalysator er som følger: (a) med HRR er omkostningerne ved instrumentet og forbrugsstoffer lavere; b) med HRR kræves der ikke tre til fire replikater af hver måling som i den ekstracellulære fluxanalysator, for hvilken disse replikater er nødvendige for at håndtere den høje fluorescensvariabilitet c) gennemførligheden af substratafkoblingsinhibitortitreringsprotokollerne med HRR er høj og c) cellerne overvåges i bevægelse og ikke fastgøres. Oximetri kan analysere iltforbruget af bevægelige (levende) og intakte (ikke-permeabiliserede) spermatozoer 7,31,32. Dette er en fordel i tilfælde af spermatozoer, da sædadhæsion til plastoverfladen potentielt kan ændre deres bevægelsesmønstre og funktion.

HRR er mere følsom end konventionel respirometri og er egnet til medicinsk brug i humane spermatozoer, for hvilke antallet af celler fra hver sædprøve ikke kan øges (såsom dyrkede celler). Denne teknik kan bruges til at overvåge sædrespiration fra de fleste sædprøver, både fra normale og infertile mænd. RCR kan bruges som en god indikator for menneskelig sædfunktionsstatus, og en afskæringsværdi på 3,15 (følsomhed og specificitet på henholdsvis 73 % og 61 %) skelner mellem sædprøver med normal og unormal konventionel sædanalyse32. HRR kan bruges til at forstå sædmitokondriemetabolisme, som kan være ansvarlig for mandlig infertilitet, og være et supplement til standard sædanalyse.

Den seneste nye generation af Oroboro-instrumenter gør det muligt at analysere iltforbruget i forbindelse med andre sædfunktioner, såsom produktion afH2O2, og kan hjælpe med at forstå sædfunktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Fertilab Andrology klinikken, især José María Montes og Andrea Torrents, for at give os adgang til donorer. Finansiering: AC støttes af tilskud fra Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Der blev opnået yderligere finansiering fra Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. og R.S. støttes af Universidad de la República (I + D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 og FMV_1_2017_1_136490 ANII-Uruguay). P.I. støttes af POS_FMV_2018_1_1007814 og CAP-UDELAR 2020. Figurerne blev illustreret ved hjælp af Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
  3. Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
  4. Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
  5. Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
  6. Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
  7. Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
  8. Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
  9. Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
  10. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
  11. Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
  12. Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
  13. Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
  14. Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
  17. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  18. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  19. Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
  20. Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
  21. Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
  22. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
  23. Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
  24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
  25. Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
  26. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
  27. Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
  28. Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
  29. Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
  30. Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
  31. Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
  32. Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).

Tags

Respirometri med høj opløsning mitokondriefunktion humane spermatozoer sædkvalitet sædanalyse mandlig infertilitet sædmitokondrieaktivitet iltforbrug lukket kammersystem sædkvalitet sædmitokondrier intakt sæd permeabiliseret spermatozoer respiratoriske kædekomplekser oxygrafinstrument med høj opløsning iltkoncentration iltforbrugshastigheder respiratoriske indekser

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Respirometri med høj opløsning til vurdering af mitokondriefunktion i humane spermatozoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter