Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Respirometrie met hoge resolutie om de mitochondriale functie in menselijke spermatozoa te beoordelen

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

De analyse van de mitochondriale functie van sperma door middel van respirometrie met hoge resolutie maakt het mogelijk om het zuurstofverbruik van vrij bewegende spermatozoa in een gesloten kamersysteem te meten. De techniek kan worden toegepast om de ademhaling in menselijke spermatozoa te meten, wat informatie geeft over de mitochondriale kenmerken en integriteit van sperma.

Abstract

De kwaliteit van het sperma wordt vaak bestudeerd door middel van routinematige sperma-analyse, die beschrijvend en vaak niet doorslaggevend is. Mannelijke onvruchtbaarheid wordt in verband gebracht met veranderde mitochondriale activiteit van het sperma, dus de meting van de mitochondriale functie van het sperma is een indicator van de kwaliteit van het sperma. Respirometrie met hoge resolutie is een methode om het zuurstofverbruik van cellen of weefsels in een gesloten kamersysteem te meten. Deze techniek kan worden toegepast om de ademhaling in menselijk sperma te meten en geeft informatie over de kwaliteit en integriteit van de mitochondriën van het sperma. Respirometrie met hoge resolutie zorgt ervoor dat de cellen vrij kunnen bewegen, wat a priori een voordeel is in het geval van sperma. Deze techniek kan worden toegepast met intacte of gepermeabiliseerde spermatozoa en maakt de studie mogelijk van de mitochondriale functie van intact sperma en de activiteit van individuele ademhalingsketencomplexen. Het oxygraafinstrument met hoge resolutie maakt gebruik van sensoren om de zuurstofconcentratie te meten in combinatie met gevoelige software om het zuurstofverbruik te berekenen. De gegevens worden gebruikt om ademhalingsindexen te berekenen op basis van de zuurstofverbruiksratio's. Bijgevolg zijn de indices de verhoudingen van twee zuurstofverbruikssnelheden en worden ze intern genormaliseerd naar het celaantal of de eiwitmassa. De respiratoire indices zijn een indicator van de mitochondriale functie en disfunctie van het sperma.

Introduction

Mannelijke onvruchtbaarheid is naar schatting verantwoordelijk voor 40%-50% van alle gevallen van onvruchtbaarheid bijparen1. Conventionele sperma-analyse speelt een cruciale rol bij het bepalen van de mannelijke vruchtbaarheid; Ongeveer 15% van de onvruchtbare mannen heeft echter normale spermaparameters2. Bovendien geeft routinematige sperma-analyse beperkte informatie over de functie van het sperma en weerspiegelt het geen subtiele spermadefecten3.

Mitochondriën van sperma hebben een speciale structuur, omdat ze als een spiraalvormig omhulsel rond de flagella zijn gerangschikt. De mitochondriale schede bevat een variabel aantal mitochondriën die verbonden zijn door intermitochondriale linkers en verankerd zijn aan het cytoskelet door geordende eiwitarrangementen op het buitenste mitochondriale membraan 4,5. Deze structuur maakt het bijzonder moeilijk om de mitochondriën van sperma te isoleren. Daarom maken de meeste onderzoeken naar de mitochondriale functie van sperma gebruik van in situ-analyses of gedemembraneerd sperma6.

De mitochondriale structuur en functie van sperma zijn consequent in verband gebracht met mannelijke onvruchtbaarheid 7,8,9,10,11, wat suggereert dat analyse van de structuur en functie van deze organellen een goede kandidaat kan zijn voor opname in sperma-analyse.

Mitochondriën spelen een belangrijke rol in het cellulaire energiemetabolisme, met name door zuurstof te gebruiken om adenosinetrifosfaat (ATP) te produceren door middel van oxidatieve fosforylering (OXPHOS). Met name bij spermatozoa wordt de bron van ATP (glycolyse vs. OXPHOS) betwist, en veel van de gegevens blijven controversieel en zijn afhankelijk van verschillende experimentele benaderingen 4,12,13. Metingen van de ademhaling door middel van oximetrie bieden belangrijke inzichten in de mitochondriale ademhalingscapaciteit, de mitochondriale integriteit en het energiemetabolisme van de cel14,15,16. Traditioneel wordt deze techniek uitgevoerd met behulp van de Clark-zuurstofelektrode - een instrument dat al meer dan 50 jaar wordt gebruikt om mitochondriale ademhaling te meten17,18. Bovendien is het mitochondriale zuurstofverbruik van sperma geanalyseerd met behulp van de klassieke Clark-zuurstofelektrode 19,20,21. Respirometrie met hoge resolutie (HRR) met behulp van oxygrafen (Oroboros) biedt een hogere gevoeligheid dan het gebruik van klassieke respirometrie-apparaten22. De oxygrafen bestaan uit twee kamers met injectiepoorten en elke kamer heeft een polarografische zuurstofsensor. Met deze techniek is het mogelijk om weefselglaasjes, cellen en geïsoleerde mitochondriale suspensies te analyseren. Het monster wordt continu in de kamer geroerd en tijdens het experiment wordt het zuurstofverbruik gemeten en worden de zuurstofsnelheden berekend met behulp van specifieke software. De kamers vertonen een verminderde zuurstoflekkage, wat een voordeel is ten opzichte van de conventionele zuurstofelektrode-apparaten14,23.

Net als bij andere cellen is in het geval van spermatozoa de gevoeligheid van HRR-apparatuur hoger dan bij conventionele respirometrie, wat betekent dat HRR-apparatuur kan worden gebruikt voor de analyse van een beperkt aantal intacte of gepermeabiliseerde zaadcellen. Er zijn twee hoofdstrategieën voor het beoordelen van de mitochondriale functie van sperma door HRR: (a) het meten van het zuurstofverbruik in intacte cellen, waarbij de ademhalingsfunctie wordt gereproduceerd in een medium dat substraten zoals glucose bevat, of (b) het meten van het zuurstofverbruik in gepermeabiliseerde cellen met behulp van een van de OXPHOS-complexen, met de toevoeging van specifieke substraten om elke functie afzonderlijk te controleren.

In de huidige studie beschrijven we het gebruik van HRR om de mitochondriale ademhaling in menselijke zaadcellen te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Figure 1
Figuur 1: Workflow voor respirometrie met hoge resolutie om de mitochondriale functie in intact en gepermeabiliseerd menselijk sperma te beoordelen. Het protocol was verdeeld in vier verschillende stappen: 1) voorbereiding van het monster, 2) zuurstofkalibratie in het Oroboros-instrument, 3) meting van het zuurstofverbruik voor intacte en doormeabiliseerde cellen, en 4) gegevensextractie uit de apparatuur en analyse. Afkortingen: CASA = computer-assisted sperm analysis; BWW = Biggers Whitten Whittingham medium; MRM = mitochondriaal ademhalingsmedium; ADP = adenosinedifosfaat; FCCP = carbonylcyanide -p- trifluormethoxyfenylhydrazon; AA = antimycine A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: De workflow voor het meten van het zuurstofverbruik in zaadcellen met behulp van HRR is weergegeven in figuur 1. Informatie over de materialen, apparatuur en reagentia die in het protocol worden gebruikt, wordt weergegeven in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van het monster

  1. Monstername
    1. Verzamel vers geëjaculeerd menselijk sperma door masturbatie na een aanbevolen onthouding van 3 dagen in een steriele plastic container. Transporteer de monsters onmiddellijk naar het laboratorium.
    2. Incubeer de monsters gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur (RT) om volledig vloeibaar te worden24.
    3. Bewaar de monsters na het vloeibaar maken bij 37 °C tot het experiment begint.
  2. Sperma-evaluatie met computerondersteunde sperma-analyse (CASA)
    1. Meng het monster en laad 7 μL in een voorverwarmde spermatelkamer.
    2. Plaats de kamer op de voorverwarmde (37 °C) tafel van een microscoop met direct licht.
    3. Open de geautomatiseerde sperma-analysesoftware en voer de motiliteits- en concentratiemodule in (klik op Mot).
    4. Selecteer de configuratie die overeenkomt met de omstandigheden van menselijk sperma.
      OPMERKING: De configuratie moet worden aangepast aan het type en de diepte van de kamer, evenals aan de monstersoort en het CASA-systeem.
    5. Analyseer willekeurig 10 verschillende velden per kamer door op de knop Analyseren te klikken.
    6. Klik op Resultaten om de monsterconcentratie en beweeglijkheid te verkrijgen.
  3. Cel voorbereiding
    OPMERKING: Als de HRR niet is gekalibreerd, begin dan met stap 2.1-2.2 voordat u de cellen voorbereidt (stap 1.3). Het is belangrijk om direct het zuurstofverbruik te meten wanneer de zaadcellen opnieuw in het medium worden gesuspendeerd.
    1. Centrifugeer de monsters bij 400 x g gedurende 10 minuten bij RT.
    2. Verwijder het zaadplasma en resuspendeer de spermatozoa in 2 ml Biggers Whitten Whittingham (BWW) voor experimenten met intacte cellen of mitochondriaal ademhalingsmedium (MRM) voor onderzoek met gepermeabiliseerde cellen. De samenstelling van de media is weergegeven in tabel 1.
    3. Herhaal de stappen beschreven in stap 1.2 voor onderzoek naar de concentratie van sperma.

2. Respirometrie met hoge resolutie: OXPHOS-analyse

OPMERKING: HRR integreert zeer gevoelige oxygrafen (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Oostenrijk) met software (DatLab, versie 4.2; Oroboros Instruments GmbH). De experimentele gegevens worden weergegeven als de zuurstofconcentratie versus de tijd (als pmol van O2/106 cellen·min−1) en als real-time transformaties van deze gegevens, waardoor de onderzoeker de ademhaling (zuurstofverbruik, zuurstofflux) van biologische en biochemische monsters kan volgen terwijl het experiment nog loopt. De HRR kan worden gebruikt om de ademhaling van levende en beweeglijke cellen te volgen, wat vooral nuttig is voor sperma, waarvan de beweeglijkheid verband houdt met de kwaliteit van het sperma en het vruchtbaarheidspotentieel. Het laboratorium maakt gebruik van een HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, met twee kamers. De stappen die in dit protocol worden beschreven, moeten onafhankelijk van elkaar worden uitgevoerd voor beide kamers van 2 ml.

  1. Voorbereiding van apparatuur
    1. Schakel de HRR in en verbind deze met de respirometriesoftware (DatLab) voor data-acquisitie en -analyse.
    2. Vervang de 70% ethanol in de oxygraafkamer door ddH2O. Roer het continu met de magnetische roerstaaf in de kamer op 750 tpm. Laat het 10 minuten staan en zuig daarna de dubbel gedistilleerde (dd) H2O op.
    3. Was de kamer driemaal met ddH2O gedurende 5 minuten per keer.
      NOTITIE: Deze stap is nodig om de resterende ethanol uit de kamers te verwijderen. Zaadcellen zijn erg gevoelig voor ethanol. De opname kan in gevaar komen als deze stap wordt overgeslagen.
  2. Kalibratie van de zuurstofsensoren
    NOTITIE: De kalibratieprocedure varieert enigszins, afhankelijk van het instrument. Voer een luchtkalibratie van de polarografische zuurstofsensor uit zoals beschreven door de fabrikant25. In dit hoofdstuk wordt het kalibratieprotocol kort uitgelegd.
    1. Verwijder de ddH 2 O en pipetteer2ml van hetzelfde medium dat is gebruikt voor de celbereiding in de kamer. Plaats de stoppers en laat een luchtverversingsbel achter.
      NOTITIE: Het is belangrijk om het volume van de kamer te kennen om het exacte volume van het benodigde medium te bepalen.
    2. Noteer de zuurstofkalibratiewaarden (klik op Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) om de prestaties van het sensormembraan te bewaken door het medium met de roerstaaf bij 750 tpm gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C te roeren. Gebruik de andere instellingen zoals vermeld: versterking voor sensor: 2; polarisatiespanning: 800 mV; Interval voor gegevensregistratie: 2,0 s.
      NOTITIE: Er wordt verwacht dat het een O 2-helling ongecorrigeerd (rode lijn) binnen ±2 pmol∙s−1∙mL−1 zal verkrijgen met een stabiel signaal van de polarografische sensor.
    3. Sleep de muis terwijl u de linkermuisknop en de shift-toets ingedrukt houdt om een gebied te selecteren waar de verandering in zuurstofconcentratie (Y1 O2-concentratie, blauwe lijn) stabiel is.
    4. Open het venster O2 Calibration (klik op Oxygraph > O2 Calibration). Wijzig in Luchtkalibratie de geselecteerde markering in het gebied dat in stap 2.2.3 is geselecteerd. Eindig door te klikken op Kalibreren en kopiëren naar klembord.
    5. Stop de opname en sla op door op Oxygraph te klikken > Ok Control > Opslaan en loskoppelen.
      OPMERKING: Deze gegevensset moet worden opgeslagen, zodat deze kan worden gebruikt in alle experimenten van de dag. De kalibratie wordt slechts één keer per dag uitgevoerd voor elk medium.
  3. Digitonine-permeabilisatietitratie
    1. Open de kamer en zuig het medium binnenin op.
    2. Laad in de kamer minimaal 24 x 10 6 en niet meer dan 70 x 106 zaadcellen in een eindvolume van 2 ml MRM.
      OPMERKING: Het is belangrijk om het aantal cellen in de kamer te meten om het zuurstofverbruik aan het einde van het experiment aan te passen. Een lager aantal cellen dan aanbevolen kan niet worden gemeten.
    3. Sluit de kamer door de stoppers helemaal naar binnen te duwen en zuig de resterende vloeistof aan de bovenkant op. Start het experiment met dezelfde instellingen als voor de kalibratie: roersnelheid: 750 tpm; temperatuur: 37 °C; versterking voor sensor: 2; polarisatiespanning: 800 mV; en gegevensregistratie-interval: 2,0 s.
    4. Om de kalibratie te laden, dubbelklikt u op het vak Pos Calib in de benedenhoek. Open de kalibratie die is uitgevoerd in stap 2.2 (klik op Oxygraph > O2-kalibratie > Kopiëren uit bestand) en klik op Kalibreren en kopiëren naar klembord.
      NOTITIE: De POS Calib-doos verandert van geel in groen. De gegevens worden weergegeven in zuurstofdebiet gecorrigeerd per volumegrafieken (Layout 05 Flux per Volume ongecorrigeerd). Er zijn verschillende lay-outs beschikbaar in Oxygraph > Layout.
    5. Voeg 5 μL 0,5 M adenosinedifosfaat (ADP), 10 μL 2 M glutamaat en 2,5 μL 0,4 M malaat toe (eindconcentraties: 1,25 mM, 10 mM en 0,5 mM). Meet het zuurstofverbruik totdat het signaal stabiliseert.
      OPMERKING: Precision Hamilton-microspuiten worden gebruikt voor injectie via de laadpoort in de stop. Gebruik één spuit per medicijn om kruisbesmetting te voorkomen. Klik op F4 om te registreren, en markeer in het zuurstofregister wanneer een behandeling wordt toegevoegd.
      OPMERKING: De substraten worden bereid in ultrapuur water en gedurende 3 maanden opgeslagen bij -20 °C.
    6. Tritaat door 1 μL 10 mM digitonine in opeenvolgende stappen toe te voegen tot het zuurstofverbruik een maximaal niveau bereikt.
      OPMERKING: Grondig wassen met water, 70% ethanol en 100% ethanol is essentieel als dezelfde kamer wordt gebruikt voor twee experimenten op dezelfde dag.
      OPMERKING: Digitonine wordt bereid in ultrapuur water en gedurende 3 maanden bewaard bij -20 °C.
  4. Routinematig respiratoir beoordelingsprotocol voor intacte en gepermeabiliseerde zaadcellen (complex I of complex II)
    1. Open de kamer en zuig het medium binnenin op.
    2. Laad in de kamer minimaal 24 x 10 6 en niet meer dan 70 x 106 zaadcellen in een eindvolume van 2 ml BWW (intacte celanalyse) of MRM (permeabilized cell analysis).
    3. Start het experiment met dezelfde instellingen als voor de kalibratie (dit wordt beschreven in stap 2.3.3).
    4. Laad de kalibratie die in stap 2.2 is uitgevoerd zoals beschreven in stap 2.3.4.
    5. Registreer de ademhaling van de cellen gedurende ten minste 5 minuten totdat een stabiel signaal wordt verkregen. Deze meting komt overeen met de basale ademhaling in intacte cellen.
    6. Als het experiment met intacte cellen is, gaat u verder met stap 2.4.9. Injecteer voor gepermeabiliseerde cellen 4,5 μL 10 mM digitonine (eindconcentratie: 22,5 μM). Permeabiliseer de cellen gedurende 5 minuten.
    7. Voeg de substraten toe: 10 μL 2 M glutamaat en 2,5 μL 0,4 M malaat (eindconcentraties: respectievelijk 10 mM en 0,5 mM) voor complex I of 20 μL 1 M succinaat (eindconcentratie: 10 mM) voor complex II. Meet het zuurstofverbruik totdat het signaal toeneemt en stabiliseert. Dit is toestand 4, wat betekent dat basaal complex I of basaal complex II ondersteunde ademhaling in afwezigheid van ADP is.
      OPMERKING: De substraten worden bereid in ultrapuur water en gedurende 3 maanden opgeslagen bij -20 °C.
    8. Injecteer 5 μL 0,5 M ADP (eindconcentratie: 1,25 mM). Meet het zuurstofverbruik totdat het signaal toeneemt en stabiliseert. De toevoeging van ADP verhoogt het signaal dat overeenkomt met het maximale zuurstofverbruik door complex I of complex II (toestand 3, in gepermeabiliseerde cellen).
    9. Voeg 1 μL van 4 mg/ml oligomycine (eindconcentratie: 2 μg/ml) toe, een ATP-synthetaseremmer. Meet het zuurstofverbruik totdat het signaal afneemt en stabiliseert.
      OPMERKING: Oligomycine wordt bereid in ethanol en gedurende 3 maanden bewaard bij -20 °C.
    10. Titreer door in opeenvolgende stappen 1 μl 0,1 mM toe te voegen aan 1 mM carbonylcyanide-P-trifluoromethoxyfenylhydrazon (FCCP) totdat een maximale ontkoppelde ademhalingsfrequentie is bereikt. Meet het zuurstofverbruik totdat het signaal toeneemt en stabiliseert.
      OPMERKING: FCCP wordt bereid in ethanol en gedurende 3 maanden bewaard bij -20 °C.
    11. De uiteindelijke concentratie van FCCP is afhankelijk van het monster. Stop met het injecteren van het medicijn wanneer het zuurstofverbruik begint af te nemen.
    12. Injecteer ten slotte 1 μL 5 mM antimycine A (eindconcentratie 2,5 μM). Dit is een complexe III-remmer om onderscheid te maken tussen het mitochondriale en het resterende zuurstofverbruik (niet-mitochondriale ademhaling). Voeg voor de analyse van complex I 1 μL 1 mM rotenon (0,5 μM eindconcentratie), een remmer van dit complex, toe in plaats van AA. Meet het zuurstofverbruik totdat het signaal afneemt en stabiliseert.
      OPMERKING: De medicijnen worden bereid in ethanol en gedurende 3 maanden bewaard bij -20 °C.

3. Data-extractie en -analyse

Figure 2
Figuur 2: Verwerving van respiratoire parameters uit een respirometrie-experiment met hoge resolutie. (A,B) Schematische weergaven van grafieken verkregen, zoals beschreven in figuur 1, voor respectievelijk intacte en gepermeabiliseerde cellen. Deze parameters zijn eerder beschreven15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Sleep de muis door op de linkermuisknop en de shift-toets te drukken om gebieden te selecteren waar de zuurstofflux per volume gecorreleerd is (Y2 O2 helling uncorr., rode lijn) stabiel is na de injectie van een substraat of remmer. Figuur 2 toont de verschillende parameters die zijn verkregen uit het eerder beschreven register15.
    OPMERKING: De parameters zijn afhankelijk van het experiment; ze zijn allemaal als volgt: basale ademhaling in intacte cellen en ademhaling in aanwezigheid van glutamaat/malaat of succinaat (toestand 4), ADP (toestand 3), oligomycine (protonlek), FCCP (maximale ademhalingsfrequentie), rotenon/AA (niet-mitochondriale ademhaling). In gepermeabiliseerde cellen komt de basale ademhaling overeen met toestand 3.
  2. Klik op de vensters Cijfers > Statistieken en exporteer de gegevens.
  3. Normaliseer de verkregen gegevens per 1 miljoen zaadcellen. De eenheden van de hellingen zijn pmolO2·s−1·mL−1·10−6 cellen.
  4. Trek het niet-mitochondriale zuurstofverbruik af van alle waarden voordat u de indices berekent.
  5. Bereken de indexcijfers met behulp van de verschillende vergelijkingen die eerder zijn beschreven15:
    Equation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bepaling van de optimale concentratie digitonine in zaadcellen
In dit protocol presenteren we het gebruik van HRR om real-time veranderingen in OXPHOS in menselijke zaadcellen te monitoren. Aangezien de methode kan worden gebruikt om intact of digitonine-permeabiliseerd sperma te analyseren, presenteren we eerst de standaardisatie van de digitonineconcentratie die nodig is om zaadcellen te permeabiliseren (Figuur 3).

Digitonine wordt gebruikt voor chemische permeabilisatie, waardoor substraten cellen kunnen binnendringen, en voor het meten van mitochondriale activiteit. Deze verbinding moet in intacte cellen worden getitreerd om de optimale concentratie te verkrijgen die nodig is om de permeabilisatie van het celmembraan te garanderen zonder de integriteit van het mitochondriale membraan in gevaar te brengen. We voerden een titratie uit in aanwezigheid van ADP, glutamaat en malaat. De ademhalingsfrequentie werd gemeten bij aanvang en na de geleidelijke toevoeging van digitonine (figuur 3A). Het zuurstofverbruik stijgt naarmate de wasmiddelconcentratie toeneemt en bereikt een punt waarop de integriteit van het buitenste mitochondriale membraan begint te worden aangetast (rode pijl in figuur 3A). Figuur 3B toont de gemiddelde ± standaardfout van 4 representatieve experimenten. Het resultaat laat zien dat de permeabilisatie optimaal is bij een digitonineconcentratie van 22,5 μM (figuur 3A,B). De mitochondriale activiteit neemt af wanneer te grote hoeveelheden digitonine worden gebruikt.

Weergave van succesvol en suboptimaal register van spermaademhaling door HRR
Tijdens het monitoren van de mitochondriale ademhaling van sperma kan het register worden gevisualiseerd als O 2-concentratie (blauwe lijn) en O2-stroom per volume gecorreleerd (rode lijn) berekend met de DatLab 4-analysesoftware in zowel gepermeabiliseerde als niet-gepermeabiliseerde cellen (Figuur 4). Figuur 4 toont representatieve curven van intacte (Figuur 4A,B) en digitonine-permeabiliseerde (Figuur 4C,D) zaadcellen uit een spermamonster. Figuur 4A geeft een succesvolle registratie weer van intacte zaadcellen uit een spermamonster, waarbij de effecten van geneesmiddelen die het zuurstofverbruik moduleren worden waargenomen en het mogelijk is om de parameters voor de berekening van de indices te extraheren. Basale ademhaling wordt geregistreerd in intacte cellen door zuurstofverbruik in aanwezigheid van exogene substraten. Vervolgens werd de niet-fosforylerende ademhalingsfrequentie gemeten door een ATP-synthaseremmer (oligomycine) toe te voegen. Vervolgens werd de protonofoor FCCP in verschillende concentraties geïnjecteerd en werd de maximale mitochondriale ontkoppelde ademhalingsfrequentie bepaald. Dit medicijn leidt tot een toename van de protonpermeabiliteit van het binnenmembraan, waardoor de passieve beweging van protonen de chemiosmotische gradiënt kan verdrijven die een toename van het zuurstofverbruik veroorzaakt. Ten slotte werd AA toegevoegd om de mitochondriale ademhaling te remmen.

De kwaliteit van de verkregen gegevens hangt nauw samen met het celnummer. Het is belangrijk om een hoog basaal zuurstofverbruik te hebben om een goede staat van dienst te verkrijgen. De daaropvolgende analyse hangt af van subtiele veranderingen in hetO2-verbruik die mogelijk niet worden gedetecteerd als de basaallijn niet hoog genoeg is. Een lager aantal cellen dan aanbevolen kan leiden tot een resultaat zoals figuur 4B.

Representatieve curven die zijn verkregen met behulp van het protocol voor complexe I- of II-specifieke substraten worden weergegeven in respectievelijk figuur 4C en figuur 4D. Om het zuurstofverbruik door het mitochondriaal complex I of complex II te bestuderen, werden de substraten malaat en glutamaat of succinaat toegevoegd na permeabilisatie van de cellen. Vervolgens wordt ADP toegevoegd voor conversie naar ATP (toestand 3, actieve complex I of II afhankelijke ademhaling). Ten slotte wordt rotenon of AA toegediend om respectievelijk complex I of II te remmen.

Voor de interpretatie van de resultaten is het belangrijk om te bedenken dat cellulaire ademhaling geremd door oligomycine een directe meting is van de protonlekkagesnelheid over het mitochondriale membraan in intacte cellen, wat vergelijkbaar is met de toestand 4 van gepermeabiliseerde cellen (zonder ADP) (Figuur 2B). In het geval van intacte cellen (niet-gepermeabiliseerd) geeft deze hoeveelheid de fractie van het basale mitochondriale zuurstofverbruik aan die onafhankelijk is van ATP-synthese. De maximale ademhalingsfrequentie wordt bereikt na toevoeging van meerdere doses FCCP. In intacte cellen hangt af van twee factoren; de activiteit van de elektronentransportcomplexen en het aantal mitochondriën in elke cel. Toestand 3 van gepermeabiliseerde cellen na toevoeging van ADP lijkt op basale ademhaling van de intacte cel bij verzadigingsconcentraties van exogene substraten (Figuur 2B)7. Tabel 2 toont een voorbeeld van de indexcijfers die zijn berekend op basis van de records in figuur 4.

Figure 3
Figuur 3: Bepaling van de optimale concentratie digitonine voor de permeabilisatie van menselijke zaadcellen. De ademhalingsfrequentie werd gemeten bij 37 °C in MRM-medium met glutamaat, malaat en adenosinedifosfaat. (A) Representatief respiratoir spoor. De blauwe lijn is de O 2-concentratie en de rode lijn geeft de O2-stroom per gecorreleerd volume weer. (B) Ademhalingsfrequentie mitochondriën betekent ± standaardfout, n = 4. De rode pijl staat voor de optimale concentratie. Afkorting: dig = digitonin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve respiratoire sporen voor het zuurstofverbruik verkregen met behulp van het Oroboros-instrument. De ademhalingsfrequenties werden gemeten bij 37 °C in (A,B) intacte en (C,D) gepermeabiliseerde cellen. De blauwe lijn is de O 2-concentratie en de rode lijn geeft de O2-stroom per gecorreleerd volume weer. De percentages in A, C en D werden gemeten met meer dan 30 x 10 6 zaadcellen, terwijl de snelheid in B werd gemeten met 14 x 106 zaadcellen. Afkortingen: Oligo = oligomycine; FCCP = carbonylcyanide -p- trifluormethoxyfenylhydrazon; Glu/Mal = glutamaat/malaat; ADP = adenosinedifosfaat; AA = antimycine A; Rot = rotenon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van BWW- en MRM-media voor experimenten met respectievelijk intacte of gepermeabiliseerde cellen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Representatieve voorbeelden van HRR-indices. De gegevens zijn verkregen uit de sporen die in figuur 4 zijn weergegeven. De indices zijn berekend volgens figuur 2 en protocolsectie 3. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De HRR hangt in belangrijke mate af van verschillende stappen: (a) het onderhoud van de apparatuur, (b) nauwkeurige kalibratie van de zuurstofsensoren, (c) de titratie van de ontkoppelingseenheid26 en ten slotte (d) het adequate gebruik van indices die de mitochondriale functie vertegenwoordigen. Het onderhoud van de apparatuur is cruciaal. Het wordt aanbevolen om de membranen van de polarografische zuurstofsensor regelmatig te vervangen en de instrumentele achtergrond te corrigeren. Uitgebreid wassen na het verzamelen van spermatozoa uit de kamers is essentieel om goede replica's te verkrijgen, vooral in laboratoria waar de instrumenten vaak worden gebruikt om verschillende weefsels of cellen te analyseren. Spermatozoa zijn gevoelig voor zelfs kleine hoeveelheden rotenon, AA, oligomycine en FCCP, dus de wasstap moet zorgvuldig worden uitgevoerd (minstens drie keer met ethanol en nog eens drie keer met gedestilleerd water). Kalibratie is een cruciale stap; Het moet elke dag en voor elk van de gebruikte media worden uitgevoerd (zie protocolstap 2.2). De titraties van de ontkoppelaar moeten zorgvuldig worden uitgevoerd, aangezien de optimale ontkoppelingsconcentraties moeten worden gebruikt om de maximale stimulatie van de flux te bereiken en overtitratie te voorkomen, wat paradoxaal genoeg de ademhaling remt27. De optimale ontkoppelingsconcentratie hangt af van het celtype, de celconcentratie en het medium en is anders voor gepermeabiliseerde cellen dan voor intacte cellen14. In het geval van spermamonsters, waarbij de zaadcellen heterogeen kunnen zijn, moet de ontkoppelaar dus aan elk monster worden aangepast28,29,30. Na respirometrie worden verschillende parameters verkregen die vóór de analyse moeten worden gecorrigeerd voor het aantal cellen. Er worden drie indices berekend die de interpretatie van de mitochondriale functie mogelijk maken, en deze hebben het voordeel dat ze onafhankelijk zijn van het aantal mitochondriën en cellen. We benadrukken het gebruik van de respiratoire controleratio (RCR), die de efficiëntie van mitochondriale koppeling aangeeft en gevoelig is voor meerdere potentiële plaatsen van disfunctie7. Afhankelijk van het experiment kunnen echter andere parameters en indices worden gebruikt31.

De beperkingen van HRR zijn als volgt: (a) het apparaat is niet geautomatiseerd, dus het vereist de constante aanwezigheid van een operator en is tijdrovend; b) het HRR-apparaat heeft slechts twee kamers en er kunnen slechts twee tests tegelijk worden uitgevoerd; c) de kamers zijn niet voor eenmalig gebruik bestemd en kunnen besmet zijn met remmers of een ander soort weefsel; (d) hoewel de gevoeligheid van het instrument zeer hoog is, ontdekte ons team dat er ten minste 12 miljoen/ml sperma nodig is om variaties in zuurstofverbruik te detecteren, dus we konden geen sperma meten van oligozoöspermische mannen; en e) de exploitant moet zich ervan bewust zijn dat de metingen betrekking hebben op alle cellen die in de monsters aanwezig zijn. Spermamonsters zijn heterogeen en bevatten andere celtypen (bijv. leukocyten). Om besmetting te voorkomen, is het noodzakelijk om monsters met lage concentraties leukocyten te gebruiken7. Als alternatief kan voorafgaand aan de oximeterexperimenten een extra stap voor het zuiveren van het sperma worden uitgevoerd (bijv. omhoog of omlaag zwemmen)24.

Een alternatief voor HRR is het gebruik van de extracellulaire fluxanalysator. De voordelen van de extracellulaire fluxanalysator ten opzichte van de oxygraaf met hoge resolutie voor het meten van het spermametabolisme zijn als volgt: (a) de extracellulaire fluxanalysator is een grotendeels geautomatiseerd instrument; b) het kan het zuurstofverbruik meten in platen met 24 putjes en 96 putjes voor screening met hoge doorvoer, wat betekent dat er kleinere hoeveelheden biologische monsters nodig zijn; en (c) het maakt de aanvullende meting van de glycolytische flux van het sperma mogelijk. Enkele voordelen van HRR ten opzichte van de extracellulaire fluxanalysator zijn als volgt: (a) met HRR zijn de kosten van het instrument en de verbruiksartikelen lager; b) bij HRR zijn drie tot vier replicaten van elke meting niet vereist zoals bij de extracellulaire fluxanalysator, waarvoor deze replicaten nodig zijn om de hoge fluorescentievariabiliteit aan te pakken; c) de haalbaarheid van de titratieprotocollen voor substraatontkoppelingsremmers met HRR is groot; en (c) de cellen worden in beweging gecontroleerd en niet bevestigd. Oximetrie kan het zuurstofverbruik van beweeglijke (levende) en intacte (niet-gepermeabiliseerde) spermatozoa analyseren 7,31,32. Dit is een voordeel in het geval van spermatozoa, omdat de hechting van sperma aan het plastic oppervlak mogelijk hun bewegingspatronen en functie kan veranderen.

HRR is gevoeliger dan conventionele respirometrie en is geschikt voor medisch gebruik in menselijke spermatozoa, waarbij het aantal cellen van elk spermamonster niet kan worden verhoogd (zoals gekweekte cellen). Deze techniek kan worden gebruikt om de ademhaling van sperma van de meeste spermamonsters te volgen, zowel van normale als onvruchtbare mannen. RCR kan worden gebruikt als een goede indicator van de functionele status van menselijk sperma, en een afkapwaarde van 3,15 (gevoeligheid en specificiteit van respectievelijk 73% en 61%) maakt onderscheid tussen spermamonsters met normale en abnormale conventionele sperma-analyse32. HRR kan worden gebruikt om het mitochondriale metabolisme van sperma te begrijpen, dat verantwoordelijk kan zijn voor mannelijke onvruchtbaarheid, en een aanvulling zijn op standaard sperma-analyse.

De nieuwste nieuwe generatie Oroboro-instrumenten maakt de analyse van het zuurstofverbruik mogelijk in combinatie met andere spermafuncties, zoals de productie vanH2O2, en kan helpen om de spermafunctie te begrijpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen de Fertilab Andrologiekliniek, in het bijzonder José María Montes en Andrea Torrents, bedanken voor het feit dat ze ons toegang hebben gegeven tot donoren. Financiering: A.C. wordt ondersteund door subsidies van Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Aanvullende financiering werd verkregen van het Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. en R.S. worden ondersteund door Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 en FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. wordt ondersteund door POS_FMV_2018_1_1007814 en CAP-UDELAR 2020. De figuren werden geïllustreerd aan de hand van Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
  3. Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
  4. Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
  5. Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
  6. Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
  7. Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
  8. Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
  9. Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
  10. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
  11. Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
  12. Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
  13. Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
  14. Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
  17. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  18. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  19. Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
  20. Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
  21. Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
  22. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
  23. Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
  24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
  25. Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
  26. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
  27. Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
  28. Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
  29. Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
  30. Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
  31. Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
  32. Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).

Tags

Respirometrie met hoge resolutie Mitochondriale functie Menselijke spermatozoa Spermakwaliteit Spermaanalyse Mannelijke onvruchtbaarheid Mitochondriale activiteit van sperma Zuurstofverbruik Gesloten kamersysteem Spermakwaliteit Mitochondriën van sperma Intact sperma Gepermeabiliseerde spermatozoa Ademhalingsketencomplexen Oxygraafinstrument met hoge resolutie Zuurstofconcentratie Zuurstofverbruikspercentages Ademhalingsindexen

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Respirometrie met hoge resolutie om de mitochondriale functie in menselijke spermatozoa te beoordelen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter