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Summary
精子のミトコンドリア機能を高分解能肺活法で解析することで、密閉室系で自由に動く精子の酸素消費量を測定することができます。この技術は、精子のミトコンドリアの特徴と完全性に関する情報を提供するヒト精子の呼吸の測定に適用できます。
Abstract
精液の質は、ルーチンの精液分析によって研究されることが多いが、これは記述的であり、しばしば決定的ではない。男性不妊症は精子のミトコンドリア活動の変化と関連しているため、精子のミトコンドリア機能の測定は精子の質の指標です。高分解能肺活量測定は、密閉チャンバーシステム内の細胞または組織の酸素消費量を測定する方法です。この技術は、ヒト精子の呼吸を測定するために実装することができ、精子ミトコンドリアの品質と完全性に関する情報を提供します。高解像度の肺活法により、細胞は自由に動くことができ、これは精子の場合の 先験的な 利点です。この技術は、無傷または透過処理された精子に適用でき、無傷の精子のミトコンドリア機能および個々の呼吸鎖複合体の活性の研究を可能にします。高解像度の酸素写真機器は、センサーを使用して酸素濃度を測定し、高感度のソフトウェアを組み合わせて酸素消費量を計算します。このデータは、酸素消費比に基づいて呼吸指数を計算するために使用されます。したがって、指数は2つの酸素消費率の比率であり、細胞数またはタンパク質量に内部的に正規化されます。呼吸指数は、精子のミトコンドリア機能と機能障害の指標です。
Introduction
男性不妊症は、カップルの不妊症の全症例の40%〜50%を占めると推定されています1。従来の精液分析は、男性の生殖能力を決定する上で重要な役割を果たします。しかし、不妊症の男性の約15%は正常な精子パラメータを持っています2。さらに、ルーチンの精液分析では、精子の機能に関する情報は限られており、精子の微妙な欠損は反映されません3。
精子のミトコンドリアは、べん毛の周りにらせん状の鞘として配置されているため、特別な構造をしています。ミトコンドリア鞘は、ミトコンドリア間リンカーによって連結され、ミトコンドリアの外側膜上の規則正しいタンパク質配列によって細胞骨格に固定された可変数のミトコンドリアを含む4,5。この構造により、精子のミトコンドリアを単離することが特に困難になります。したがって、精子のミトコンドリア機能に関するほとんどの研究は、in situ分析または脱膜精子を使用しています6。
精子のミトコンドリアの構造と機能は、一貫して男性不妊症に関連しており7,8,9,10,11、これらの細胞小器官の構造と機能の分析は、精子分析に含めるための良い候補である可能性があることを示唆しています。
ミトコンドリアは、特に酸素を使用して酸化的リン酸化(OXPHOS)を介してアデノシン三リン酸(ATP)を生成することにより、細胞のエネルギー代謝に重要な役割を果たします。特に精子では、ATPの供給源(解糖系対OXPHOS)が論争されており、データの多くは議論の余地があり、さまざまな実験的アプローチに依存しています4,12,13。酸素濃度測定による呼吸の測定は、ミトコンドリアの呼吸能力、ミトコンドリアの完全性、および細胞のエネルギー代謝に関する重要な洞察を提供します14,15,16。伝統的に、この技術は、50年以上にわたってミトコンドリア呼吸を測定するために使用されてきた機器であるクラーク酸素電極を使用して行われてきました17,18。さらに、精子のミトコンドリア酸素消費量は、古典的なクラーク酸素電極19,20,21を使用して分析されています。オキシグラフ(オロボロス)を用いた高分解能肺活量測定(HRR)は、従来の肺活量測定装置を使用するよりも高い感度を提供する22。オキシグラフは注入ポートを備えた2つのチャンバーで構成されており、各チャンバーにはポーラログラフ式酸素センサーがあります。この技術により、組織スライド、細胞、および単離されたミトコンドリア懸濁液を分析することができます。試料をチャンバー内で連続的に攪拌し、実験中に酸素消費量を測定し、特定のソフトウェアを使用して酸素率を計算します。チャンバは酸素漏れの低減を示し、これは従来の酸素電極デバイス14,23に対する利点である。
他の細胞と同様に、精子の場合、HRR装置の感度は従来の肺活法よりも高いため、HRR装置は限られた数の無傷または透過処理された精子細胞の分析に使用できます。HRRによる精子のミトコンドリア機能の評価には、主に2つの戦略があります:(a)グルコースなどの基質を含む培地で呼吸機能を再現することを含む無傷細胞内の酸素消費量を測定すること、または(b)OXPHOS複合体の1つを使用して透過処理細胞内の酸素消費量を測定し、特定の基質を追加して各機能を個別に監視します。
本研究では、ヒト精子細胞におけるミトコンドリア呼吸を決定するためのHRRの使用について説明します。
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Protocol
この実験は、ウルグアイのモンテビデオにあるFacultad de Medicina de la Universidad de la Repúblicaの倫理委員会によって承認されました。
図1:無傷および透過処理されたヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活量測定のワークフロー。 プロトコルは、1)サンプルの調製、2)オロボロス装置での酸素キャリブレーション、3)インタクトおよび透過処理された細胞の酸素消費量測定、および4)装置からのデータ抽出と分析の4つの異なるステップに分かれています。略語:CASA =コンピューター支援精子分析。BWW = ビガーズ・ウィッテン・ウィッティンガム・ミディアム;MRM = ミトコンドリア呼吸媒体;ADP = アデノシン二リン酸;FCCP = シアン化カルボニル-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン;AA = 抗マイシン A. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
注:HRRを使用して精子細胞の酸素消費量を測定するためのワークフローを 図1に示します。プロトコルで使用される材料、機器、および試薬に関する情報は、 材料表に記載されています。
1. サンプル調製
- サンプル収集
- 無菌プラスチック容器に推奨される3日間の禁欲の後、マスターベーションによって射精したばかりの人間の精液を収集します。サンプルはすぐにラボに輸送します。
- サンプルを室温(RT)で30〜60分間インキュベートして、完全に液化させます24。
- 液化後、実験が始まるまで37°Cで保存してください。
- コンピュータ支援精子分析(CASA)による精子評価
- サンプルを混合し、予め温めた精子計数チャンバーに7μLをロードします。
- チャンバーを直射光顕微鏡の予熱(37°C)ステージに置きます。
- コンピュータ化された精子分析ソフトウェアを開き、運動性と濃度モジュールを入力します( Motをクリックします)。
- ヒトの精子の状態に対応する構成を選択します。
注:構成は、チャンバーの種類と深さ、およびサンプル種とシステムCASAに適合させる必要があります。 - チャンバーごとに10種類のフィールドをランダムに分析するには、 Analyze ボタンをクリックします。
- [結果]をクリックして、サンプルの濃度と運動性を取得します。
- 細胞調製
注意: HRRが校正されていない場合は、セルを準備する前に、手順2.1〜2.2から開始してください(手順1.3)。精子細胞が培地に再懸濁されたら、すぐに酸素消費量を測定することが重要です。- サンプルを 400 x g で 10 分間遠心分離します。
- 精漿を除去し、精子を2 mLのBiggers Whitten Whittingham(BWW)に再懸濁し、無傷の細胞を用いた実験用、または透過処理細胞を用いた研究用のミトコンドリア呼吸培地(MRM)に再懸濁します。培地の組成を 表1に示す。
- 精子濃度研究のステップ1.2で説明した手順を繰り返します。
2. 高分解能スピロメトリー:OXPHOS分析
注:HRRは高感度オキシグラフ(Oxygraph-2 K;Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Austria)とソフトウェア(DatLab、バージョン4.2;Gmbh Oroboros Instruments)。実験データは、酸素濃度対時間(O2/106 cells·min-1のpmolとして)およびこれらのデータのリアルタイム変換として表示されるため、実験者は実験中に生物学的および生化学的サンプルの呼吸(酸素消費量、酸素流束)を追跡できます。HRRは、生きた細胞や運動性細胞の呼吸を追跡するために使用でき、その運動性が精子の質と生殖能力に関連している精子に特に有用です。研究室では、2つのチャンバーを備えたHRR Oroboros Oxygraph2-k、Oroboros Instrumentsを使用しています。このプロトコルに記載されている手順は、両方の 2 mL チャンバーに対して独立して実行する必要があります。
- 機器の準備
- HRRをオンにし、データの取得と分析のために呼吸測定ソフトウェア(DatLab)に接続します。
- オキシグラフチャンバー内の70%エタノールをddH2Oに置き換え、チャンバー内の磁気攪拌子で750rpmで連続的に攪拌します。10分間放置し、その後、二重蒸留(dd)H2Oを吸引する。
- チャンバーをddH2Oで3回、毎回5分間洗浄します。
注:このステップは、チャンバーから残りのエタノールを除去するために必要です。精子細胞はエタノールに非常に敏感です。この手順を省略すると、記録が損なわれる可能性があります。
- 酸素センサーの校正
注意: 校正手順は、機器によって若干異なります。ポーラログラフ式酸素センサーの空気校正は、メーカー25の記載に従って行う。このセクションでは、校正プロトコルについて簡単に説明します。- ddH2Oを取り出し、細胞調製に用いたのと同じ培地2mLをチャンバーにピペットで移す。ストッパーを配置し、空気交換気泡を残します。
注意: 必要な培地の正確な容量を決定するには、チャンバーの容量を知ることが重要です。 - 酸素キャリブレーション値を記録し( Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Tempをクリック)、37°Cで750rpmの攪拌子で培地を少なくとも30分間攪拌することにより、センサーメンブレンの性能を監視します。 前述のように他の設定を使用します:センサーのゲイン:2;分極電圧:800mV;データ記録間隔:2.0秒。
注:ポーラログラフセンサーからの安定した信号により、±2 pmol・s-1∙mL-1以内の未補正(赤線)のO2傾きが得られることが期待されます。 - マウスの左ボタンとShiftキーを押しながらマウスをドラッグし、酸素濃度の変化が安定している領域(Y1 O2濃度、青線)を選択します。
- [O2 Calibration]ウィンドウを開きます([Oxygraph]>[O2 Calibration]をクリックします)。[空気キャリブレーション]で、選択したマークを手順2.2.3で選択した領域に変更します。[Calibrate and Copy to Clipboard]をクリックして終了します。
- 記録を停止し、[Oxygraph] > [ Ok Control] > [Save and Disconnect] をクリックして保存します。
注: このデータセットは、その日のすべての実験で使用できるように保存する必要があります。キャリブレーションは、各媒体について1日1回のみ実行されます。
- ddH2Oを取り出し、細胞調製に用いたのと同じ培地2mLをチャンバーにピペットで移す。ストッパーを配置し、空気交換気泡を残します。
- ジギトニン透過滴定
- チャンバーを開き、内部の培地を吸引します。
- チャンバー内に、少なくとも24 x 10 6および70 x 106以下の精子細胞を、最終容量2 mLのMRMにロードします。
注:実験終了時の酸素消費量を調整するために、チャンバー内の細胞数を測定することが重要です。推奨値より少ないセル数は測定できません。 - ストッパーを奥まで押し込んでチャンバーを閉じ、上部に残った液体を吸引します。キャリブレーションと同じ設定で実験を開始します:攪拌速度:750 rpm。温度: 37 °C;センサーのゲイン:2;分極電圧:800mV;データ記録間隔:2.0秒。
- キャリブレーションをロードするには、下隅にある Pos Calib ボックスをダブルクリックします。手順2.2で実行したキャリブレーションを開き( Oxygraph > O2 Calibration>Copy from Fileをクリック)、[ Calibrate and Copy to Clipboard]をクリックします。
注意: POSキャリブ ボックスが黄色から緑色に変わります。データは、体積ごとに補正された酸素流量チャート(レイアウト05:体積あたりのフラックス未補正)に表示されます。 Oxygraph > Layoutでは、さまざまなレイアウトを使用できます。 - 0.5 M アデノシン二リン酸(ADP)5 μL、2 M グルタミン酸 10 μL、0.4 M リンゴ酸 2.5 μL(最終濃度:1.25 mM、10 mM、0.5 mM)を加えます。信号が安定するまで酸素消費量を測定します。
注:精密ハミルトンマイクロシリンジは、ストッパーのロードポートからの注入に使用されます。クロスコンタミネーションを避けるために、薬剤ごとに1本のシリンジを使用してください。 F4 をクリックして登録し、治療が追加されたときに酸素レジスターにマークを付けます。
注:基板は超純水で調製し、-20°Cで3ヶ月間保存します。 - 酸素消費量が最大レベルに達するまで、1 μL の 10 mM ジギトニンを連続して添加してトリチウム酸塩を添加します。
注:同じチャンバーを同じ日に2つの実験に使用する場合は、水、70%エタノール、および100%エタノールで完全に洗浄することが不可欠です。
注:ジギトニンは超純水で調製し、-20°Cで3ヶ月間保存します。
- 無傷および透過処理された精子細胞(複合体Iまたは複合体II)のルーチン呼吸評価プロトコル
- チャンバーを開き、内部の培地を吸引します。
- チャンバー内に、BWW(インタクト細胞分析)またはMRM(透過処理細胞分析)の最終容量2mLの最終容量に、少なくとも24 x 10 6および70 x 106以下の精子細胞をロードします。
- キャリブレーションと同じ設定で実験を開始します(これについては、手順2.3.3で説明します)。
- ステップ2.3.4の説明に従って、ステップ2.2で実行したキャリブレーションをロードします。
- 安定したシグナルが得られるまで、少なくとも5分間細胞の呼吸を記録します。この測定値は、無傷の細胞における基礎呼吸に相当します。
- 実験が無傷の細胞で行われる場合は、ステップ2.4.9に進みます。透過処理した細胞には、4.5 μL の 10 mM ジギトニンを注入します(最終濃度:22.5 μM)。細胞を5分間透過処理します。
- 基質を添加します:複合体Iの場合は2 Mグルタミン酸10 μL、0.4 Mリンゴ酸2.5 μL(最終濃度:それぞれ10 mMおよび0.5 mM)、複合体IIの場合は1 Mコハク酸(最終濃度:10 mM)20 μL。信号が増加して安定するまで、酸素消費量を測定します。これは状態4であり、ADPの非存在下での基底複合体Iまたは基底複合体IIの支持呼吸を意味します。
注:基板は超純水で調製し、-20°Cで3ヶ月間保存します。 - 5 μL の 0.5 M ADP (最終濃度:1.25 mM) を注入します。信号が増加して安定するまで、酸素消費量を測定します。ADPを添加すると、複合体Iまたは複合体IIを通る最大酸素消費量に対応するシグナルが増加します(状態3、透過処理細胞では)。
- ATP合成酵素阻害剤であるオリゴマイシン(最終濃度:2 μg/mL)を1 μL添加します。信号が減少して安定するまで、酸素消費量を測定します。
注:オリゴマイシンはエタノールで調製し、-20°Cで3ヶ月間保存します。 - 0.1 mMから1 mMのシアン化カルボニル-P-トリフルオロメトキシ-フェニルヒドラゾン(FCCP)を1 μL添加して、最大非共役呼吸数に達するまで連続して滴定します。信号が増加して安定するまで、酸素消費量を測定します。
注:FCCPはエタノールで調製され、-20°Cで3か月間保存されます。 - FCCPの最終濃度はサンプルによって異なります。酸素消費量が減少し始めたら、薬の注射を中止してください。
- 最後に、1 μL の 5 mM 抗マイシン A(最終濃度 2.5 μM)を注入します。これは、ミトコンドリアと残留酸素消費(非ミトコンドリア呼吸)を区別するための複合体III阻害剤です。複合体 I の分析では、AA の代わりに、この複合体の阻害剤である 1 mM ロテノン(最終濃度 0.5 μM)を 1 μL 添加します。信号が減少して安定するまで、酸素消費量を測定します。
注:薬剤はエタノールで調製され、-20°Cで3ヶ月間保存されます。
3. データの抽出と分析
図2:高分解能スピロメトリー実験による呼吸パラメータの取得。 (A,B)図1に示した、インタクト細胞と透過処理細胞について得られたグラフの模式図。これらのパラメータは、前述した15で説明した。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
- マウスの左ボタンとShiftキーを押してマウスをドラッグし、基質または阻害剤の注入後に体積あたりの酸素フラックスが相関している領域(Y2 O2 傾き補正値、赤線)を選択します。 図2 は、先に説明したレジスタ15から得られる異なるパラメータを示す。
注:パラメータは実験によって異なります。それらはすべて次の通りです:無傷の細胞における基礎呼吸とグルタミン酸/リンゴ酸またはコハク酸の存在下での呼吸(状態4)、ADP(状態3)、オリゴマイシン(プロトンリーク)、FCCP(最大呼吸数)、ロテノン/ AA(非ミトコンドリア呼吸)。透過処理された細胞では、基底呼吸は状態3に相当します。 - [マーク] ウィンドウ > [統計] ウィンドウ をクリックし、データをエクスポートします。
- 精子細胞100万個あたりのデータを正規化します。斜面の単位はpmolO2・s−1・mL−1・10−6セルである。
- 指数を計算する前に、すべての値から非ミトコンドリアの酸素消費量を差し引きます。
- 前述のさまざまな式を使用してインデックスを計算します15:
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Representative Results
精子細胞におけるジギトニンの最適濃度の決定
このプロトコルでは、ヒト精子細胞におけるOXPHOSのリアルタイム変化を監視するためのHRRの使用方法を紹介します。この分析法は、インタクトまたはジギトニン透過処理された精子の分析に使用できるため、まず、精子細胞の透過処理に必要なジギトニン濃度の標準化について紹介します(図3)。
ジギトニンは、基質を細胞内に侵入させる化学的透過処理や、ミトコンドリア活性の測定に用いられます。この化合物は、ミトコンドリア膜の完全性を損なうことなく細胞膜の透過性を確保するために必要な最適な濃度を得るために、無傷の細胞で滴定する必要があります。ADP、グルタミン酸、リンゴ酸の存在下で滴定を行いました。呼吸数は、ベースライン時およびジギトニンの段階的な添加後に測定されました(図3A)。界面活性剤濃度の上昇とともに酸素消費量が増加し、ミトコンドリアの外側の膜の完全性が損なわれ始めるポイントに達します( 図3Aの赤い矢印)。 図3B は、代表的な4つの実験の平均±標準誤差を示しています。結果は、22.5 μMのジギトニン濃度で透過処理が最適であることを示しています(図3A、B)。ミトコンドリアの活性は、ジギトニンの量が多すぎると低下します。
HRRによる精子呼吸の成功と次善のレジスターの表現
精子のミトコンドリア呼吸をモニタリングしている間、レジスターは、透過処理細胞と非透過処理細胞の両方で、DatLab 4分析ソフトウェアで計算されたO2濃度(青線)および体積あたりのO2流量(赤線)として視覚化できます(図4)。図4は、精液サンプルからの無傷の精子細胞(図4A、B)とジギトニン透過処理された精子細胞(図4C、D)の代表的な曲線を示しています。図4Aは、精液サンプルからの無傷の精子細胞の記録の成功を表しており、酸素消費を調節する薬物の影響が観察され、指標を計算するためのパラメータを抽出することができます。基底呼吸は、外因性基質の存在下での酸素消費によって無傷の細胞に記録されます。次に、ATP合成酵素阻害剤(オリゴマイシン)を添加して非リン酸化呼吸数を測定した。続いて、プロトノフォアFCCPを異なる濃度で注入し、最大ミトコンドリア非共役呼吸数を決定した。この薬は、内膜のプロトン透過性の増加をもたらし、プロトンの受動的な動きが酸素消費量の増加を引き起こす化学運動勾配を放散することを可能にする。最後に、ミトコンドリア呼吸を阻害するためにAAを添加した。
得られるデータの品質は、細胞番号と密接に関係しています。良い記録を得るには、基礎酸素消費量が多いことが重要です。その後の分析は、基底線が十分に高くない場合に検出されない可能性のあるO2 消費量の微妙な変化に依存します。細胞数が推奨値より少ない場合、 図 4B のような結果が生じる可能性があります。
複合体IまたはII特異的基質についてプロトコルを用いて得られた代表的な曲線を、それぞれ図4Cおよび図4Dに示します。ミトコンドリア複合体Iまたは複合体IIを介した酸素消費量を調べるために、細胞の透過処理後に基質リンゴ酸およびグルタミン酸またはコハク酸塩を添加しました。次に、ATPに変換するためにADPが添加されます(状態3、活動的な複合体IまたはII依存性呼吸)。最後に、ロテノンまたはAAを投与して、それぞれ複合体IまたはIIを阻害します。
結果を解釈するためには、オリゴマイシンによって阻害される細胞呼吸は、無傷の細胞におけるミトコンドリア膜を横切るプロトン漏出率の直接測定であり、これは透過処理された細胞(ADPなし)の状態4に匹敵することを考慮することが重要です(図2B)。無傷の細胞(非透過処理)の場合、この量は、ATP合成とは無関係な基礎ミトコンドリア酸素消費量の割合を示します。最大呼吸数は、FCCPを数回追加した後に到達します。.無傷の細胞では、2つの要因に依存します。電子伝達複合体の活性と各細胞内のミトコンドリアの数。ADP添加後の透過処理細胞の状態3は、外因性基質の飽和濃度における無傷細胞の基礎呼吸に類似しています(図2B)7。 表2 は、 図4のレコードから計算された指数の例を示しています。
図3:ヒト精子細胞の透過処理のためのジギトニンの最適濃度の決定。呼吸数は、グルタミン酸、リンゴ酸、およびアデノシン二リン酸を含むMRM培地中で37°Cで測定しました。(A)代表的な呼吸痕跡。青線はO2濃度、赤線は相関する体積当たりのO2流量を表す。(B)ミトコンドリアの呼吸数は、標準誤差±n=4を意味します。赤い矢印は最適な濃度を表します。略語:dig = digitonin。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:オロボロス装置を使用して得られた酸素消費率の代表的な呼吸トレース。呼吸速度は、(A,B)無傷細胞および(C,D)透過処理細胞において37°Cで測定した。青線はO2濃度、赤線は相関する体積当たりのO2流量を表す。A、C、Dの割合は30 x 10 6個以上の精子細胞で測定され、Bの割合は14 x 106個の精子細胞で測定されました。略語:オリゴ=オリゴマイシン;FCCP = シアン化カルボニル-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン;Glu/Mal = グルタミン酸/リンゴ酸;ADP = アデノシン二リン酸;AA = 抗マイシンA;腐敗=ロテノン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:インタクトまたは透過処理細胞を用いた実験用のBWW培地およびMRM培地の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2 HRR指数の代表例 データは、 図4に示すトレースから取得しました。指数は、 図2 およびプロトコルセクション3に従って計算されました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
HRRは、(a)機器のメンテナンス、(b)酸素センサーの正確な校正、(c)アンカプラー滴定26、そして最後に、(d)ミトコンドリア機能を表す指標の適切な使用といういくつかのステップに決定的に依存します。機器のメンテナンスは非常に重要です。ポーラログラフ式酸素センサーのメンブレンを定期的に交換し、機器のバックグラウンドを修正することをお勧めします。チャンバーから精子を採取した後の広範な洗浄は、特に機器がさまざまな組織や細胞の分析に頻繁に使用される実験室では、良好な複製を得るために不可欠です。精子は少量のロテノン、AA、オリゴマイシン、およびFCCPにも敏感であるため、洗浄ステップは慎重に実行する必要があります(エタノールで少なくとも3回、蒸留水でさらに3回)。キャリブレーションは重要なステップです。これは、毎日、使用するメディアごとに実行する必要があります(プロトコルステップ2.2を参照)。最適なアンカプラー濃度を使用してフラックスの最大の刺激を達成し、逆説的に呼吸を阻害する過剰滴定を回避する必要があるため、アンカプラー滴定は慎重に実行する必要があります27。最適なアンカプラー濃度は、細胞の種類、細胞濃度、および培地に依存し、透過処理された細胞とインタクト細胞では異なります14。したがって、精子細胞が不均一であり得る精子試料の場合、脱共役器は、各試料28、29、30に適合されなければならない。スピロメトリー後、分析前に細胞数を補正する必要があるいくつかのパラメータが得られます。ミトコンドリアの働きを解釈できる3つの指標が計算されており、ミトコンドリアや細胞の数に依存しないというメリットがあります。我々は、ミトコンドリアカップリングの効率を示し、機能障害の複数の潜在的な部位に敏感である呼吸制御比(RCR)の使用を強調する7。但し、実験31によっては、他のパラメータや指標を用いてもよい。
HRRの制限は次のとおりです:(a)デバイスは自動化されていないため、オペレーターの常駐が必要であり、時間がかかります。(b)HRRデバイスには2つのチャンバーしかなく、同時に実行できるアッセイは2つだけです。(c)チャンバーは使い捨てではなく、阻害剤または別の種類の組織で汚染されている可能性があります。(d)装置の感度は非常に高いが、私たちのチームは、酸素消費量の変動を検出するために少なくとも1,200万/mLの精子が必要であることを発見したため、乏精子症の男性の精子を測定することはできませんでした。(e)オペレーターは、測定値がサンプルに存在するすべての細胞に対するものであることに注意する必要があります。精液サンプルは不均一であり、他の細胞タイプ(白血球など)が含まれています。コンタミネーションを避けるためには、低濃度の白血球を含むサンプルを使用する必要があります7。あるいは、酸素濃度計の実験の前に、追加の精子精製ステップ(例えば、スイムアップまたはスイムダウン)を実行することができる24。
HRRの代替として、細胞外フラックス分析装置の使用があります。精子代謝を測定するための高分解能オキシグラフに対する細胞外フラックス分析装置の利点は次のとおりです:(a)細胞外フラックス分析装置は大部分が自動化された機器です。(b)ハイスループットスクリーニング用の24ウェルおよび96ウェルプレートの酸素消費量を測定できるため、必要な生物学的サンプルの量が少なくて済みます。(c)精子の解糖フラックスの追加測定を可能にします。細胞外フラックス分析装置に対するHRRのいくつかの利点は次のとおりです:(a)HRRを使用すると、機器と消耗品のコストが低くなります。(b)HRRでは、細胞外フラックス分析装置のように、各測定を3〜4回繰り返す必要はなく、高い蛍光変動に対処するためにこれらの繰り返しが必要です。(c)HRRによる基質脱共役阻害剤滴定プロトコルの実現可能性が高いこと。(c)細胞は動いている状態で監視され、付着していません。酸素濃度測定は、運動性(生)および無傷(非透過性)の精子の酸素消費量を分析できます7,31,32。精子の場合、精子がプラスチック表面に付着すると、精子の運動パターンや機能が変化する可能性があるため、これは有利です。
HRRは従来のスピロメトリーよりも感度が高く、各精液サンプルの細胞数を増やすことができないヒト精子(培養細胞など)の医療用途に適しています。この技術は、正常な男性と不妊症の男性の両方からのほとんどの精液サンプルからの精子呼吸を監視するために使用できます。RCRは、ヒト精子の機能状態の良好な指標として用いることができ、カットオフ値3.15(感度および特異度はそれぞれ73%および61%)は、従来の精液分析で正常および異常な精子試料を区別する32。HRRは、男性不妊の原因となる可能性のある精子のミトコンドリア代謝を理解するために使用でき、標準的な精液分析を補完するものとなります。
最新の新世代のOroboro機器は、H2O 2の産生などの他の精子機能と組み合わせて酸素消費量の分析を可能にし、精子機能の理解に役立つ可能性があります。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
ドナーへのアクセスを許可してくれたFertilab Andrologyクリニック、特にJosé María MontesとAndrea Torrentsに感謝します。資金提供:ACは、Universidad de la República(CSIC_2018、Espacio Interdisciplinario_2021)からの助成金によってサポートされています。追加資金は、Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas(ウルグアイ、PEDECIBA)から得られました。P.I. と R.S. は Universidad de la República (I+D, CSIC 2014;I+D、CSIC 2016、Iniciación a la Investigación、CSIC 2019、FMV_1_2017_1_136490 ANII-ウルグアイ)。P.I. は POS_FMV_2018_1_1007814 と CAP-UDELAR 2020 でサポートされています。図は Biorender.com を使用して示されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid free- Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A8806 | |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma Aldrich | A5285 | |
| Animycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
| DatLab sofware version 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L malic acid | Sigma Aldrich | M1000 | |
| Magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Microliter Syringes | Hamilton | 87900 or 80400 | |
| Microscope camera | Basler | acA780-75gc | |
| Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
| Monopotassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Oxygraph-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Power O2k-Respirometer | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
| Sperm Counting Chamber DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
| Succinate disodium salt | Sigma Aldrich | W327700 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
- Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
- Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
- Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
- Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
- Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
- Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
- Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
- Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
- Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
- Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
- Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
- Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
- Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
- Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
- Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
- Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
- WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
- Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
- Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
- Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
- Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
- Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
- Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
- Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).
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高分解能肺活量測定、ミトコンドリア機能、ヒト精子、精液質、精子分析、男性不妊症、精子ミトコンドリア活性、酸素消費量、密閉チャンバーシステム、精子の質、精子ミトコンドリア、無傷精子、透過精子、呼吸鎖複合体、高分解能オキシグラフ装置、酸素濃度、酸素消費率、呼吸指数Erratum
Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.
Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:
Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
to:
Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
Figure 3 in the Representative Results section was updated from:
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.
