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Medicine

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

Die Analyse der Mitochondrienfunktion von Spermien mittels hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von frei beweglichen Spermien in einem geschlossenen Kammersystem. Die Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden, die Informationen über die mitochondrialen Eigenschaften und die Integrität der Spermien liefert.

Abstract

Die Samenqualität wird oft durch eine routinemäßige Samenanalyse untersucht, die beschreibend und oft nicht schlüssig ist. Männliche Unfruchtbarkeit ist mit einer veränderten mitochondrialen Aktivität der Spermien verbunden, so dass die Messung der mitochondrialen Funktion der Spermien ein Indikator für die Spermienqualität ist. Die hochauflösende Respirometrie ist eine Methode zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Zellen oder Geweben in einem geschlossenen Kammersystem. Diese Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden und liefert Informationen über die Qualität und Integrität der Spermienmitochondrien. Die hochauflösende Respirometrie ermöglicht es den Zellen, sich frei zu bewegen, was bei Spermien a priori von Vorteil ist. Diese Technik kann mit intakten oder permeabilisierten Spermien angewendet werden und ermöglicht die Untersuchung der intakten Mitochondrienfunktion der Spermien und der Aktivität einzelner Atmungskettenkomplexe. Das hochauflösende Oxygraph-Gerät verwendet Sensoren zur Messung der Sauerstoffkonzentration in Verbindung mit einer empfindlichen Software zur Berechnung des Sauerstoffverbrauchs. Die Daten werden verwendet, um Atmungsindizes auf der Grundlage der Sauerstoffverbrauchsverhältnisse zu berechnen. Folglich sind die Indizes die Anteile von zwei Sauerstoffverbrauchsraten und werden intern auf die Zellzahl oder Proteinmasse normiert. Die Atmungsindizes sind ein Indikator für die mitochondriale Funktion und Dysfunktion der Spermien.

Introduction

Es wird geschätzt, dass männliche Unfruchtbarkeit 40%-50% aller Fälle von Unfruchtbarkeit bei Paaren ausmacht1. Die konventionelle Samenanalyse spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der männlichen Fruchtbarkeit. Etwa 15 % der unfruchtbaren Männer haben jedoch normale Spermienparameter2. Darüber hinaus liefert die routinemäßige Samenanalyse nur begrenzte Informationen über die Spermienfunktion und spiegelt keine subtilen Spermiendefekte wider3.

Spermienmitochondrien haben eine besondere Struktur, da sie als spiralförmige Hülle um die Geißeln angeordnet sind. Die mitochondriale Hülle enthält eine variable Anzahl von Mitochondrien, die durch intermitochondriale Linker verbunden und durch geordnete Proteinanordnungen auf der äußeren Mitochondrienmembran mit dem Zytoskelett verankert sind 4,5. Diese Struktur macht es besonders schwierig, die Mitochondrien der Spermien zu isolieren. Daher werden in den meisten Studien zur mitochondrialen Funktion von Spermien In-situ-Analysen oder demembranierte Spermien verwendet6.

Die mitochondriale Struktur und Funktion der Spermien wurde konsistent mit männlicher Unfruchtbarkeit in Verbindung gebracht 7,8,9,10,11, was darauf hindeutet, dass die Analyse der Struktur und Funktion dieser Organellen ein guter Kandidat für die Einbeziehung in die Spermienanalyse sein könnte.

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle im zellulären Energiestoffwechsel, insbesondere durch die Verwendung von Sauerstoff zur Herstellung von Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS). Insbesondere bei Spermien ist die Quelle von ATP (Glykolyse vs. OXPHOS) umstritten, und viele der Daten bleiben umstritten und hängen von verschiedenen experimentellen Ansätzen ab 4,12,13. Messungen der Atmung mittels Oximetrie bieten signifikante Einblicke in die mitochondriale Atmungskapazität, die mitochondriale Integrität und den Energiestoffwechsel der Zelle14,15,16. Traditionell wurde diese Technik mit der Clark-Sauerstoffelektrode durchgeführt - einem Instrument, das seit mehr als 50 Jahren zur Messung der mitochondrialen Atmung verwendet wird17,18. Darüber hinaus wurde der mitochondriale Sauerstoffverbrauch der Spermien mit der klassischen Clark-Sauerstoffelektrode 19,20,21 analysiert. Die hochauflösende Respirometrie (HRR) mit Oxygraphen (Oroboros) bietet eine höhere Sensitivität als die Verwendung klassischer Respirometriegeräte22. Die Oxygraphen bestehen aus zwei Kammern mit Injektionsanschlüssen, und jede Kammer verfügt über einen polarographischen Sauerstoffsensor. Mit dieser Technik ist es möglich, Gewebeobjektträger, Zellen und isolierte mitochondriale Suspensionen zu analysieren. Die Probe wird in der Kammer kontinuierlich gerührt, und während des Experiments wird der Sauerstoffverbrauch gemessen und die Sauerstoffraten mit einer speziellen Software berechnet. Die Kammern weisen eine reduzierte Sauerstoffleckage auf, was ein Vorteil gegenüber den herkömmlichen Sauerstoffelektrodenvorrichtungen14,23 ist.

Wie bei anderen Zellen ist auch bei Spermien die Empfindlichkeit der HRR-Geräte höher als bei der herkömmlichen Respirometrie, was bedeutet, dass HRR-Geräte für die Analyse einer begrenzten Anzahl intakter oder permeabilisierter Samenzellen verwendet werden können. Es gibt zwei Hauptstrategien zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion von Spermien mittels HRR: (a) Messung des Sauerstoffverbrauchs in intakten Zellen, bei der die Atmungsfunktion in einem Medium, das Substrate wie Glukose enthält, reproduziert wird, oder (b) Messung des Sauerstoffverbrauchs in permeabilisierten Zellen unter Verwendung eines der OXPHOS-Komplexe, wobei spezifische Substrate hinzugefügt werden, um jede Funktion separat zu überwachen.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir den Einsatz von HRR zur Bestimmung der mitochondrialen Atmung in menschlichen Samenzellen.

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Protocol

Die Experimente wurden von der Ethikkommission der Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay, genehmigt.

Figure 1
Abbildung 1: Arbeitsablauf für hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion in intakten und permeabilisierten menschlichen Spermien. Das Protokoll wurde in vier verschiedene Schritte unterteilt: 1) Vorbereitung der Probe, 2) Sauerstoffkalibrierung im Oroboros-Instrument, 3) Messung des Sauerstoffverbrauchs für intakte und permeabilisierte Zellen und 4) Datenextraktion aus dem Gerät und Analyse. Abkürzungen: CASA = computergestützte Spermienanalyse; BWW = Biggers Whitten Whittingham mittel; MRM = mitochondriales Atmungsmedium; ADP = Adenosindiphosphat; FCCP = Carbonylcyanid -p-Trifluormethoxyphenylhydrazon; AA = Antimycin A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HINWEIS: Der Arbeitsablauf zur Messung des Sauerstoffverbrauchs in Spermien mit HRR ist in Abbildung 1 dargestellt. Informationen zu den Materialien, Geräten und Reagenzien, die im Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Probe

  1. Musterkollektion
    1. Sammeln Sie frisch ejakuliertes menschliches Sperma durch Masturbation nach einer empfohlenen 3-tägigen Abstinenz in einem sterilen Kunststoffbehälter. Transportieren Sie die Proben sofort ins Labor.
    2. Inkubieren Sie die Proben für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur (RT), um sie vollständig zu verflüssigen24.
    3. Lagern Sie die Proben nach der Verflüssigung bei 37 °C, bis das Experiment beginnt.
  2. Spermienauswertung mit computergestützter Spermienanalyse (CASA)
    1. Mischen Sie die Probe und geben Sie 7 μl in eine vorgewärmte Spermienzählkammer.
    2. Stellen Sie die Kammer auf den vorgewärmten (37 °C) Tisch eines Direktlichtmikroskops.
    3. Öffnen Sie die computergestützte Spermienanalyse-Software und geben Sie das Modul Beweglichkeit und Konzentration auf (klicken Sie auf Mot).
    4. Wählen Sie die Konfiguration aus, die den Bedingungen für menschliche Spermien entspricht.
      HINWEIS: Die Konfiguration muss an die Art und Tiefe der Kammer sowie an die Probenart und das System CASA angepasst werden.
    5. Analysieren Sie nach dem Zufallsprinzip 10 verschiedene Felder pro Kammer, indem Sie auf die Schaltfläche Analysieren klicken.
    6. Klicken Sie auf Ergebnisse , um die Probenkonzentration und -motilität zu erhalten.
  3. Vorbereitung der Zellen
    HINWEIS: Wenn der HRR nicht kalibriert ist, beginnen Sie mit den Schritten 2.1-2.2, bevor Sie die Zellen vorbereiten (Schritt 1.3). Es ist wichtig, den Sauerstoffverbrauch sofort zu messen, wenn die Samenzellen im Medium resuspendiert werden.
    1. Die Proben werden bei 400 x g für 10 min bei RT zentrifugiert.
    2. Entfernen Sie das Samenplasma und resuspendieren Sie die Spermien in 2 ml Biggers Whitten Whittingham (BWW) für Experimente mit intakten Zellen oder mitochondriales Atmungsmedium (MRM) für Studien mit permeabilisierten Zellen. Die Zusammensetzung der Medien ist in Tabelle 1 dargestellt.
    3. Wiederholen Sie die in Schritt 1.2 beschriebenen Schritte für Spermienkonzentrationsuntersuchungen.

2. Hochauflösende Respirometrie: OXPHOS-Analyse

HINWEIS: HRR integriert hochempfindliche Oxygraphen (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Österreich) mit Software (DatLab, Version 4.2; Oroboros Instruments GmbH). Die experimentellen Daten werden als Sauerstoffkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit (als pmol von O2/106 Zellen·min−1) und als Echtzeittransformationen dieser Daten angezeigt, so dass der Experimentator die Atmung (Sauerstoffverbrauch, Sauerstofffluss) biologischer und biochemischer Proben verfolgen kann, während das Experiment noch läuft. Die HRR kann verwendet werden, um die Atmung lebender und beweglicher Zellen zu verfolgen, was besonders für Spermien nützlich ist, deren Beweglichkeit mit der Spermienqualität und dem Fruchtbarkeitspotenzial verbunden ist. Das Labor verwendet einen HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, mit zwei Kammern. Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte müssen für beide 2-ml-Kammern unabhängig voneinander durchgeführt werden.

  1. Vorbereitung der Ausrüstung
    1. Schalten Sie den HRR ein und verbinden Sie ihn mit der Respirometrie-Software (DatLab) zur Datenerfassung und -analyse.
    2. Ersetzen Sie das 70%ige Ethanol in der Oxygraphenkammer durch ddH2O. Rühren Sie es kontinuierlich mit dem magnetischen Rührstab in der Kammer bei 750 U/min um. 10 min stehen lassen und anschließend das doppelt destillierte (dd)H2Oabsaugen.
    3. Waschen Sie die Kammer dreimal mit ddH2O für jeweils 5 Minuten.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um das verbleibende Ethanol aus den Kammern zu entfernen. Samenzellen reagieren sehr empfindlich auf Ethanol. Die Aufzeichnung könnte beeinträchtigt werden, wenn dieser Schritt weggelassen wird.
  2. Kalibrierung der Sauerstoffsensoren
    HINWEIS: Das Kalibrierungsverfahren variiert je nach Gerät leicht. Eine Luftkalibrierung des polarographischen Sauerstoffsensors durchführen, wie vom Hersteller25 beschrieben. In diesem Abschnitt wird das Kalibrierungsprotokoll kurz erläutert.
    1. Entfernen Sie dasddH2O und pipettieren Sie 2 ml desselben Mediums, das für die Zellvorbereitung verwendet wurde, in die Kammer. Setzen Sie die Stopfen auf und lassen Sie eine Luftaustauschblase erhalten.
      HINWEIS: Es ist wichtig, das Volumen der Kammer zu kennen, um das genaue Volumen des benötigten Mediums zu bestimmen.
    2. Notieren Sie die Sauerstoffkalibrierwerte (klicken Sie auf Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp), um die Leistung der Sensormembran zu überwachen, indem Sie das Medium mit dem Rührstab bei 750 U/min für mindestens 30 min bei 37 °C rühren. Verwenden Sie die anderen Einstellungen wie erwähnt: Verstärkung für Sensor: 2; Polarisationsspannung: 800 mV; Datenaufzeichnungsintervall: 2,0 s.
      ANMERKUNG: Es wird erwartet, dass eine unkorrigierteO2-Steigung (rote Linie) innerhalb von ±2 pmol∙s−1∙mL−1 mit einem stabilen Signal des polarographischen Sensors erzielt wird.
    3. Ziehen Sie die Maus bei gedrückter linker Maustaste und Umschalttaste, um einen Bereich auszuwählen, in dem die Änderung der Sauerstoffkonzentration (Y1 O2-Konzentration, blaue Linie) stabil ist.
    4. Öffnen Sie das Fenster O2-Kalibrierung (klicken Sie auf Oxygraph > O2-Kalibrierung). Ändern Sie in der Luftkalibrierung die ausgewählte Markierung in den in Schritt 2.2.3 ausgewählten Bereich. Klicken Sie abschließend auf Kalibrieren und in Zwischenablage kopieren.
    5. Stoppen Sie die Aufnahme und speichern Sie, indem Sie auf Oxygraph > Ok Control > Save and Disconnect klicken.
      HINWEIS: Dieses Dataset muss gespeichert werden, damit es in allen Experimenten des Tages verwendet werden kann. Die Kalibrierung wird nur einmal pro Tag für jedes Medium durchgeführt.
  3. Digitonin-Permeabilisierungs-Titration
    1. Öffnen Sie die Kammer und saugen Sie das Medium im Inneren an.
    2. In die Kammer werden mindestens 24 x 10 6 und nicht mehr als 70 x 106 Samenzellen in einem Endvolumen von 2 ml MRM geladen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Anzahl der Zellen in der Kammer zu messen, um den Sauerstoffverbrauch am Ende des Experiments anzupassen. Eine geringere Anzahl von Zellen als empfohlen kann nicht gemessen werden.
    3. Schließen Sie die Kammer, indem Sie die Stopfen ganz hineindrücken und saugen Sie die restliche Flüssigkeit oben an. Starten Sie das Experiment mit den gleichen Einstellungen wie bei der Kalibrierung: Rührgeschwindigkeit: 750 U/min; Temperatur: 37 °C; Verstärkung für Sensor: 2; Polarisationsspannung: 800 mV; und Datenaufzeichnungsintervall: 2,0 s.
    4. Um die Kalibrierung zu laden, doppelklicken Sie auf das Feld Pos Calib in der unteren Ecke. Öffnen Sie die in Schritt 2.2 durchgeführte Kalibrierung (klicken Sie auf Oxygraph > O2-Kalibrierung > Aus Datei kopieren) und klicken Sie auf Kalibrieren und in Zwischenablage kopieren.
      HINWEIS: Die POS-Calib-Box wechselt von gelb zu grün. Die Daten werden in Diagrammen mit Sauerstoffdurchfluss pro Volumen korrigiert angezeigt (Layout 05 Fluss pro Volumen unkorrigiert). In Oxygraph > Layout stehen verschiedene Layouts zur Verfügung.
    5. Fügen Sie 5 μl 0,5 M Adenosindiphosphat (ADP), 10 μl 2 M Glutamat und 2,5 μl 0,4 M Malat hinzu (Endkonzentrationen: 1,25 mM, 10 mM und 0,5 mM). Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis sich das Signal stabilisiert hat.
      HINWEIS: Präzisions-Mikrospritzen von Hamilton werden für die Injektion durch die Ladeöffnung im Stopfen verwendet. Verwenden Sie eine Spritze pro Medikament, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Klicken Sie auf F4 , um sich zu registrieren, und markieren Sie im Sauerstoffregister, wenn eine Behandlung hinzugefügt wird.
      HINWEIS: Die Substrate werden in Reinstwasser vorbereitet und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.
    6. Tritatieren Sie durch Zugabe von 1 μl 10 mM Digitonin in aufeinanderfolgenden Schritten, bis der Sauerstoffverbrauch ein maximales Niveau erreicht.
      HINWEIS: Eine gründliche Reinigung mit Wasser, 70 % Ethanol und 100 % Ethanol ist unerlässlich, wenn dieselbe Kammer für zwei Experimente am selben Tag verwendet wird.
      HINWEIS: Digitonin wird in Reinstwasser hergestellt und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.
  4. Routinemäßiges Protokoll zur Beurteilung der Atemwege für intakte und permeabilisierte Samenzellen (Komplex I oder Komplex II)
    1. Öffnen Sie die Kammer und saugen Sie das Medium im Inneren an.
    2. Mindestens 24 x 10 6 und nicht mehr als 70 x 106 Samenzellen in einem Endvolumen von 2 ml BWW (intakte Zellanalyse) oder MRM (permeabilisierte Zellanalyse) in die Kammer geben.
    3. Starten Sie das Experiment mit den gleichen Einstellungen wie bei der Kalibrierung (dies ist in Schritt 2.3.3 beschrieben).
    4. Laden Sie die in Schritt 2.2 durchgeführte Kalibrierung wie in Schritt 2.3.4 beschrieben.
    5. Zeichnen Sie die Atmung der Zellen mindestens 5 Minuten lang auf, bis ein stabiles Signal erhalten wird. Diese Messung entspricht der basalen Atmung in intakten Zellen.
    6. Wenn das Experiment mit intakten Zellen durchgeführt wird, fahren Sie mit Schritt 2.4.9 fort. Bei permeabilisierten Zellen werden 4,5 μl 10 mM Digitonin (Endkonzentration: 22,5 μM) injiziert. Permeabilisieren Sie die Zellen für 5 Minuten.
    7. Fügen Sie die Substrate hinzu: 10 μl 2 M Glutamat und 2,5 μl 0,4 M Malat (Endkonzentrationen: 10 mM bzw. 0,5 mM) für Komplex I oder 20 μL 1 M Succinat (Endkonzentration: 10 mM) für Komplex II. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal ansteigt und sich stabilisiert. Dies ist Zustand 4, was bedeutet, dass der Basalkomplex I oder der Basalkomplex II die Atmung in Abwesenheit von ADP unterstützt.
      HINWEIS: Die Substrate werden in Reinstwasser vorbereitet und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.
    8. Injizieren Sie 5 μl 0,5 M ADP (Endkonzentration: 1,25 mM). Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal ansteigt und sich stabilisiert. Die Zugabe von ADP erhöht das Signal, das dem maximalen Sauerstoffverbrauch durch Komplex I oder Komplex II entspricht (Zustand 3, in permeabilisierten Zellen).
    9. Fügen Sie 1 μl 4 mg/ml Oligomycin (Endkonzentration: 2 μg/ml), einen ATP-Synthetase-Inhibitor, hinzu. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal abnimmt und sich stabilisiert.
      HINWEIS: Oligomycin wird in Ethanol hergestellt und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.
    10. Titrieren durch Zugabe von 1 μl 0,1 mM zu 1 mM Carbonylcyanid-P-trifluormethoxy-phenylhydrazon (FCCP) in aufeinanderfolgenden Schritten, bis eine maximale entkoppelte Atmungsrate erreicht ist. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal ansteigt und sich stabilisiert.
      HINWEIS: FCCP wird in Ethanol hergestellt und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.
    11. Die Endkonzentration von FCCP ist probenabhängig. Hören Sie auf, das Medikament zu injizieren, wenn der Sauerstoffverbrauch zu sinken beginnt.
    12. Zum Schluss injizieren Sie 1 μl 5 mM Antimycin A (2,5 μM Endkonzentration). Dabei handelt es sich um einen Komplex-III-Inhibitor zur Unterscheidung zwischen dem mitochondrialen und dem Restsauerstoffverbrauch (nicht-mitochondriale Atmung). Für die Analyse von Komplex I wird anstelle von AA 1 μl 1 μl 1 mM Rotenon (0,5 μM Endkonzentration), ein Inhibitor dieses Komplexes, zugegeben. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal abnimmt und sich stabilisiert.
      HINWEIS: Die Arzneimittel werden in Ethanol zubereitet und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.

3. Datenextraktion und -analyse

Figure 2
Abbildung 2: Erfassung von respiratorischen Parametern aus einem hochauflösenden Respirometrie-Experiment. (A,B) Schematische Darstellungen von Graphen, die wie in Abbildung 1 beschrieben für intakte bzw. permeabilisierte Zellen erhalten wurden. Diese Parameter wurden bereits beschrieben15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Ziehen Sie die Maus, indem Sie die linke Maustaste und die Umschalttaste drücken, um Bereiche auszuwählen, in denen der Sauerstofffluss pro Volumen korreliert (Y2 O2 slope uncorr., rote Linie) nach der Injektion eines Substrats oder Inhibitors stabil ist. Figur 2 zeigt die verschiedenen Parameter, die aus dem zuvor beschriebenen Register15 gewonnen werden.
    HINWEIS: Die Parameter hängen vom Experiment ab. alle sind wie folgt: basale Atmung in intakten Zellen und Atmung in Gegenwart von Glutamat/Malat oder Succinat (Zustand 4), ADP (Zustand 3), Oligomycin (Protonenleck), FCCP (maximale Atemfrequenz), Rotenon/AA (nicht-mitochondriale Atmung). In permeabilisierten Zellen entspricht die basale Atmung dem Zustand 3.
  2. Klicken Sie auf die Fenster Markierungen > Statistiken , und exportieren Sie die Daten.
  3. Normalisieren Sie die erhaltenen Daten pro 1 Million Samenzellen. Die Einheiten der Steigungen sind pmolO2·s−1·mL−1·10−6 Zellen.
  4. Subtrahieren Sie den nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch von allen Werten, bevor Sie die Indizes berechnen.
  5. Berechnen Sie die Indizes mit den verschiedenen Gleichungen, die zuvor15 beschrieben wurden:
    Equation 1

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Representative Results

Bestimmung der optimalen Konzentration von Digitonin in Samenzellen
In diesem Protokoll stellen wir die Verwendung von HRR vor, um Veränderungen von OXPHOS in menschlichen Samenzellen in Echtzeit zu überwachen. Da die Methode zur Analyse von intakten oder Digitonin-permeabilisierten Spermien verwendet werden kann, stellen wir zunächst die Standardisierung der Digitoninkonzentration vor, die für die Permeabilisierung von Spermien erforderlich ist (Abbildung 3).

Digitonin wird für die chemische Permeabilisierung verwendet, die es Substraten ermöglicht, in Zellen einzudringen, und zur Messung der mitochondrialen Aktivität. Diese Verbindung muss in intakten Zellen titriert werden, um die optimale Konzentration zu erhalten, die erforderlich ist, um die Permeabilisierung der Zellmembran zu gewährleisten, ohne die Integrität der mitochondrialen Membran zu beeinträchtigen. Wir führten eine Titration in Gegenwart von ADP, Glutamat und Malat durch. Die Atemfrequenz wurde zu Studienbeginn und nach der allmählichen Zugabe von Digitonin gemessen (Abbildung 3A). Der Sauerstoffverbrauch steigt mit steigender Waschmittelkonzentration und erreicht einen Punkt, an dem die Integrität der äußeren Mitochondrienmembran beeinträchtigt wird (roter Pfeil in Abbildung 3A). Abbildung 3B zeigt den Mittelwert ± Standardfehlers von 4 repräsentativen Experimenten. Das Ergebnis zeigt, dass die Permeabilisierung bei einer Digitoninkonzentration von 22,5 μM optimal ist (Abbildung 3A,B). Die Mitochondrienaktivität nimmt ab, wenn zu hohe Mengen an Digitonin verwendet werden.

Darstellung des erfolgreichen und suboptimalen Registers der Spermienatmung mittels HRR
Während der Überwachung der mitochondrialen Atmung der Spermien kann das Register als O2-Konzentration (blaue Linie) undO2-Fluss pro Volumen (rote Linie) visualisiert werden, die mit der Analysesoftware DatLab 4 sowohl in permeabilisierten als auch in nicht-permeabilisierten Zellen berechnet wurden (Abbildung 4). Abbildung 4 zeigt repräsentative Kurven von intakten (Abbildung 4A,B) und Digitonin-permeabilisierten (Abbildung 4C,D) Samenzellen aus einer Samenprobe. Abbildung 4A zeigt eine erfolgreiche Aufnahme intakter Samenzellen aus einer Samenprobe, bei der die Wirkung von Medikamenten beobachtet wird, die den Sauerstoffverbrauch modulieren, und es ist möglich, die Parameter für die Berechnung der Indizes zu extrahieren. Die basale Atmung wird in intakten Zellen durch den Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von exogenen Substraten erfasst. Anschließend wurde die nicht-phosphorylierende Atmungsrate durch Zugabe eines ATP-Synthase-Inhibitors (Oligomycin) gemessen. Anschließend wurde der Protonophor FCCP in unterschiedlichen Konzentrationen injiziert und die maximale mitochondriale entkoppelte Atmungsrate bestimmt. Dieses Medikament führt zu einer Erhöhung der Protonenpermeabilität der inneren Membran, die es der passiven Bewegung von Protonen ermöglicht, den chemiosmotischen Gradienten aufzulösen, der zu einem Anstieg des Sauerstoffverbrauchs führt. Schließlich wurde AA hinzugefügt, um die mitochondriale Atmung zu hemmen.

Die Qualität der gewonnenen Daten steht in engem Zusammenhang mit der Zellzahl. Es ist wichtig, einen hohen basalen Sauerstoffverbrauch zu haben, um eine gute Bilanz zu erhalten. Die anschließende Analyse hängt von subtilen Veränderungen desO2-Verbrauchs ab, die möglicherweise nicht erkannt werden, wenn die Basallinie nicht hoch genug ist. Eine niedrigere Zellzahl als empfohlen kann zu einem Ergebnis wie in Abbildung 4B führen.

Repräsentative Kurven, die mit dem Protokoll für komplexe I- oder II-spezifische Substrate erhalten wurden, sind in Abbildung 4C bzw. Abbildung 4D dargestellt. Um den Sauerstoffverbrauch durch den mitochondrialen Komplex I oder Komplex II zu untersuchen, wurden nach Permeabilisierung der Zellen die Substrate Malat und Glutamat oder Succinat zugegeben. Dann wird ADP zur Umwandlung in ATP (Zustand 3, aktive Komplex-I- oder II-abhängige Atmung) hinzugefügt. Schließlich wird Rotenon oder AA verabreicht, um den Komplex I bzw. II zu hemmen.

Für die Interpretation der Ergebnisse ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die durch Oligomycin gehemmte Zellatmung eine direkte Messung der Protonenleckrate über die mitochondriale Membran in intakten Zellen ist, die mit dem Zustand 4 permeabilisierter Zellen (ohne ADP) vergleichbar ist (Abbildung 2B). Bei intakten Zellen (nicht permeabilisiert) gibt diese Menge den Anteil des basalen mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs an, der unabhängig von der ATP-Synthese ist. Die maximale Atemfrequenz wird nach der Zugabe mehrerer Dosen FCCP erreicht. In intakten Zellen hängt von zwei Faktoren ab; die Aktivität der Elektronentransportkomplexe und die Anzahl der Mitochondrien in jeder Zelle. Zustand 3 permeabilisierter Zellen nach Zugabe von ADP ähnelt der basalen Atmung der intakten Zelle bei Sättigungskonzentrationen exogener Substrate (Abbildung 2B)7. Tabelle 2 zeigt ein Beispiel für die Indizes, die aus den Datensätzen in Abbildung 4 berechnet wurden.

Figure 3
Abbildung 3: Bestimmung der optimalen Konzentration von Digitonin für die Permeabilisierung menschlicher Samenzellen. Die Atemfrequenz wurde bei 37 °C in MRM-Medium mit Glutamat, Malat und Adenosindiphosphat gemessen. (A) Repräsentative Spur der Atemwege. Die blaue Linie stellt die O2-Konzentration dar, und die rote Linie stellt denO2-Durchfluss pro Volumen dar. (B) Die Atmungsrate der Mitochondrien bedeutet ± Standardfehler, n = 4. Der rote Pfeil stellt die optimale Konzentration dar. Abkürzung: dig = Digitonin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Atemwegsspuren für den Sauerstoffverbrauch, die mit dem Oroboros-Instrument ermittelt wurden. Die Atmungsraten wurden bei 37 °C in (A,B) intakten und (C,D) permeabilisierten Zellen gemessen. Die blaue Linie stellt die O2-Konzentration dar, und die rote Linie stellt denO2-Durchfluss pro Volumen dar. Die Raten in A, C und D wurden mit mehr als 30 x 10 6 Samenzellen gemessen, während die Rate in B mit 14 x 106 Samenzellen gemessen wurde. Abkürzungen: Oligo = Oligomycin; FCCP = Carbonylcyanid -p-Trifluormethoxyphenylhydrazon; Glu/Mal = Glutamat/Malat; ADP = Adenosindiphosphat; AA = antimycin A; Rot = Rotenon. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zusammensetzung von BWW- und MRM-Medien für Experimente mit intakten bzw. permeabilisierten Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Repräsentative Beispiele für HRR-Indizes. Die Daten wurden aus den in Abbildung 4 gezeigten Spuren gewonnen. Die Indizes wurden gemäß Abbildung 2 und Protokollabschnitt 3 berechnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Die HRR hängt entscheidend von mehreren Schritten ab: (a) der Wartung der Geräte, (b) der genauen Kalibrierung der Sauerstoffsensoren, (c) der Entkopplertitration26 und schließlich (d) der angemessenen Verwendung von Indizes, die die mitochondriale Funktion darstellen. Die Wartung der Geräte ist von entscheidender Bedeutung. Es wird empfohlen, die Membranen des polarographischen Sauerstoffsensors regelmäßig auszutauschen und den instrumentellen Untergrund zu korrigieren. Ein ausgiebiges Waschen nach der Entnahme von Spermien aus den Kammern ist unerlässlich, um gute Replikate zu erhalten, insbesondere in Labors, in denen die Instrumente häufig zur Analyse verschiedener Gewebe oder Zellen verwendet werden. Spermien reagieren empfindlich auf kleine Mengen an Rotenon, AA, Oligomycin und FCCP, daher muss der Waschschritt vorsichtig durchgeführt werden (mindestens dreimal mit Ethanol und weitere dreimal mit destilliertem Wasser). Die Kalibrierung ist ein entscheidender Schritt. Sie muss täglich und für jedes der verwendeten Medien durchgeführt werden (siehe Protokollschritt 2.2). Die Titrationen der Entkoppler müssen sorgfältig durchgeführt werden, da die optimalen Entkopplerkonzentrationen verwendet werden müssen, um die maximale Stimulation des Flussmittels zu erreichen und eine Übertitration zu vermeiden, die paradoxerweise die Atmung hemmt27. Die optimale Entkopplerkonzentration hängt vom Zelltyp, der Zellkonzentration und dem Medium ab und unterscheidet sich bei permeabilisierten Zellen im Vergleich zu intakten Zellen14. So muss bei Samenproben, bei denen die Samenzellen heterogen sein können, der Entkoppler an jede Probe28,29,30 angepasst werden. Nach der Respirometrie erhält man mehrere Parameter, die vor der Analyse für die Anzahl der Zellen korrigiert werden müssen. Es werden drei Indizes berechnet, die die Interpretation der mitochondrialen Funktion ermöglichen, und diese haben den Vorteil, dass sie unabhängig von der Anzahl der Mitochondrien und Zellen sind. Wir heben die Verwendung der Respiratory Control Ratio (RCR) hervor, die die Effizienz der mitochondrialen Kopplung angibt und empfindlich auf mehrere potenzielle Dysfunktionen reagiert7. Je nach Versuch31 können jedoch auch andere Parameter und Indizes verwendet werden.

Die Einschränkungen der HRR sind wie folgt: (a) Das Gerät ist nicht automatisiert, erfordert also die ständige Anwesenheit eines Bedieners und ist zeitaufwändig; b) das HRR-Gerät hat nur zwei Kammern, und es können nur zwei Assays gleichzeitig durchgeführt werden; c) die Kammern sind nicht zum einmaligen Gebrauch bestimmt und können mit Hemmstoffen oder anderen Gewebearten kontaminiert sein; (d) Obwohl die Empfindlichkeit des Instruments sehr hoch ist, stellte unser Team fest, dass mindestens 12 Millionen/ml Spermien erforderlich sind, um Schwankungen im Sauerstoffverbrauch zu erkennen, so dass wir keine Spermien von oligozoospermischen Männchen messen konnten. und e) der Prüfer muss sich darüber im Klaren sein, dass die Messungen für alle in den Proben vorhandenen Zellen gelten. Samenproben sind heterogen und enthalten andere Zelltypen (z.B. Leukozyten). Um eine Kontamination zu vermeiden, ist es notwendig, Proben mit niedrigen Konzentrationen von Leukozyten zu verwenden7. Alternativ kann vor den Oximeter-Experimenten ein zusätzlicher Spermienreinigungsschritt durchgeführt werden (z. B. Swim-up oder Swim-down)24.

Eine Alternative zur HRR ist der Einsatz des extrazellulären Flussanalysators. Die Vorteile des extrazellulären Flussanalysators gegenüber dem hochauflösenden Oxygraphen zur Messung des Spermienstoffwechsels sind wie folgt: (a) Der extrazelluläre Flussanalysator ist ein weitgehend automatisiertes Instrument; b) es kann den Sauerstoffverbrauch in 24-Well- und 96-Well-Platten für das Hochdurchsatz-Screening messen, was bedeutet, dass kleinere Mengen biologischer Proben erforderlich sind; und (c) es ermöglicht die zusätzliche Messung des glykolytischen Flusses der Spermien. Einige Vorteile der HRR gegenüber dem extrazellulären Flussanalysator sind wie folgt: (a) Mit HRR sind die Kosten für das Gerät und die Verbrauchsmaterialien niedriger; b) bei HRR sind nicht drei bis vier Wiederholungen jeder Messung erforderlich, wie dies beim extrazellulären Flussanalysator der Fall ist, für den diese Replikate erforderlich sind, um die hohe Fluoreszenzvariabilität zu berücksichtigen. c) die Durchführbarkeit der Titrationsprotokolle für Substrat-Entkoppler-Inhibitoren mit HRR ist hoch; und (c) die Zellen in Bewegung überwacht und nicht anhaften. Die Oximetrie kann den Sauerstoffverbrauch von beweglichen (lebenden) und intakten (nicht permeabilisierten) Spermien analysieren 7,31,32. Dies ist bei Spermien von Vorteil, da die Adhäsion der Spermien an der Kunststoffoberfläche möglicherweise ihre Bewegungsmuster und Funktionen verändern kann.

Die HRR ist empfindlicher als die herkömmliche Respirometrie und eignet sich für den medizinischen Einsatz bei menschlichen Spermien, bei denen die Anzahl der Zellen aus jeder Samenprobe nicht erhöht werden kann (z. B. kultivierte Zellen). Diese Technik kann verwendet werden, um die Spermienatmung der meisten Samenproben zu überwachen, sowohl von normalen als auch von unfruchtbaren Männern. RCR kann als guter Indikator für den funktionellen Status menschlicher Spermien verwendet werden, und ein Cut-off-Wert von 3,15 (Sensitivität und Spezifität von 73 % bzw. 61 %) unterscheidet zwischen Spermienproben mit normalem und abnormalem konventionellem Samentest32. HRR könnte verwendet werden, um den mitochondrialen Stoffwechsel von Spermien zu verstehen, der für männliche Unfruchtbarkeit verantwortlich sein kann, und eine Ergänzung zur Standard-Samenanalyse sein.

Die neueste neue Generation von Oroboro-Instrumenten ermöglicht die Analyse des Sauerstoffverbrauchs in Verbindung mit anderen Spermienfunktionen, wie z.B. der Produktion vonH2O2, und könnte helfen, die Spermienfunktion zu verstehen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken der Klinik Fertilab Andrology, insbesondere José María Montes und Andrea Torrents, für den Zugang zu Spendern. Finanzierung: A.C. wird durch Stipendien der Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021) unterstützt. Zusätzliche Mittel wurden vom Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay) eingeworben. P.I. und R.S. werden unterstützt von der Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 und FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. wird von POS_FMV_2018_1_1007814 und CAP-UDELAR 2020 unterstützt. Die Figuren wurden mit Biorender.com illustriert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

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References

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Tags

Hochauflösende Respirometrie Mitochondrienfunktion menschliche Spermien Samenqualität Spermienanalyse männliche Unfruchtbarkeit Mitochondrienaktivität der Spermien Sauerstoffverbrauch geschlossenes Kammersystem Spermienqualität Spermienmitochondrien intakte Spermien permeabilisierte Spermien Atmungskettenkomplexe hochauflösendes Oxygraphengerät Sauerstoffkonzentration Sauerstoffverbrauchsraten Atmungsindizes

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien
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Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

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