Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Høyoppløselig respirometri for å vurdere mitokondriell funksjon i humane spermatozoer

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

Analysen av sperm mitokondriell funksjon ved høyoppløselig respirometri tillater måling av oksygenforbruket av fritt bevegelige spermatozoer i et lukket kammersystem. Teknikken kan brukes til å måle respirasjon i humane spermatozoer, som gir informasjon om sperm mitokondrielle egenskaper og integritet.

Abstract

Sædkvalitet studeres ofte ved rutinemessig sædanalyse, som er beskrivende og ofte mangelfull. Mannlig infertilitet er assosiert med endret sperm mitokondriell aktivitet, så måling av sperm mitokondriell funksjon er en indikator på sædkvalitet. Høyoppløselig respirometri er en metode for å måle oksygenforbruket til celler eller vev i et lukket kammersystem. Denne teknikken kan implementeres for å måle respirasjon i menneskelig sæd og gir informasjon om kvaliteten og integriteten til sædmitokondriene. Høyoppløselig respirometri gjør at cellene kan bevege seg fritt, noe som er en a priori fordel når det gjelder sædceller. Denne teknikken kan brukes med intakte eller permeabiliserte spermatozoer og muliggjør studier av intakt sæd, mitokondriell funksjon og aktiviteten til individuelle respiratoriske kjedekomplekser. Det høyoppløselige oksygrafinstrumentet bruker sensorer til å måle oksygenkonsentrasjonen kombinert med sensitiv programvare for å beregne oksygenforbruket. Dataene brukes til å beregne respiratoriske indekser basert på oksygenforbruksforholdene. Følgelig er indeksene proporsjonene av to oksygenforbrukshastigheter og er internt normalisert til cellenummer eller proteinmasse. Respiratoriske indekser er en indikator på sperm, mitokondriell funksjon og dysfunksjon.

Introduction

Mannlig infertilitet er estimert til å utgjøre 40% -50% av alle tilfeller av infertilitet hos par1. Konvensjonell sædanalyse spiller en avgjørende rolle for å bestemme mannlig fruktbarhet; Imidlertid har omtrent 15% av infertile menn normale sædparametere2. I tillegg gir rutinemessig sædanalyse begrenset informasjon om sædfunksjon og gjenspeiler ikke subtile sæddefekter3.

Sperm mitokondrier har en spesiell struktur, da de er arrangert som en spiralformet skjede rundt flagellaen. Mitokondrieskjeden inneholder et variabelt antall mitokondrier forbundet med intermitokondrielle linkere og forankret til cytoskjelettet ved bestilte proteinarrangementer på den ytre mitokondriemembranen 4,5. Denne strukturen gjør det spesielt vanskelig å isolere sperm mitokondrier. Derfor bruker de fleste studier av sperm mitokondriell funksjon in situ analyser eller demembranert sperm6.

Sperm mitokondriell struktur og funksjon har vært konsekvent knyttet til mannlig infertilitet 7,8,9,10,11, noe som tyder på at analyse av strukturen og funksjonen til disse organellene kan være en god kandidat for inkludering i sædanalyse.

Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellulær energimetabolisme, spesielt ved å bruke oksygen til å produsere adenosintrifosfat (ATP) gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS). Spesielt i spermatozoa er kilden til ATP (glykolyse vs. OXPHOS) omstridt, og mye av dataene forblir kontroversielle og avhenger av forskjellige eksperimentelle tilnærminger 4,12,13. Målinger av respirasjon ved oksymetri gir betydelig innsikt i mitokondriell respiratorisk kapasitet, mitokondriell integritet og energimetabolisme i cellen14,15,16. Tradisjonelt har denne teknikken blitt utført ved hjelp av Clark oksygenelektrode - et instrument som har blitt brukt til å måle mitokondriell respirasjon i mer enn 50 år17,18. I tillegg har sperm mitokondrielt oksygenforbruk blitt analysert ved hjelp av den klassiske Clark oksygenelektroden 19,20,21. Høyoppløselig respirometri (HRR) ved bruk av oksygrafer (Oroboros) gir høyere sensitivitet enn ved bruk av klassiske respirometrienheter22. Oksygrafene består av to kamre med injeksjonsporter, og hvert kammer har en polarografisk oksygensensor. Med denne teknikken er det mulig å analysere vevslysbilder, celler og isolerte mitokondrielle suspensjoner. Prøven omrøres kontinuerlig i kammeret, og under forsøket måles oksygenforbruket, og oksygenhastigheten beregnes ved hjelp av spesifikk programvare. Kamrene viser redusert oksygenlekkasje, noe som er en fordel i forhold til de konvensjonelle oksygenelektrodeenhetene14,23.

Som med andre celler, når det gjelder spermatozoer, er følsomheten til HRR-utstyr høyere enn for konvensjonell respirometri, noe som betyr at HRR-utstyr kan brukes til analyse av et begrenset antall intakte eller permeabiliserte sædceller. Det er to hovedstrategier for å vurdere sperm mitokondriell funksjon ved HRR: (a) måling av oksygenforbruket i intakte celler, som innebærer å reprodusere respiratorisk funksjon i et medium som inneholder substrater som glukose, eller (b) måle oksygenforbruket i permeabiliserte celler ved hjelp av et av OXPHOS-kompleksene, med tilsetning av spesifikke substrater for å overvåke hver funksjon separat.

I denne studien beskriver vi bruken av HRR for å bestemme mitokondriell respirasjon i humane sædceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentene ble godkjent av etikkomiteen ved Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for høyoppløselig respirometri for å vurdere mitokondriefunksjon i intakt og permeabilisert human sæd. Protokollen ble delt inn i fire ulike trinn: 1) klargjøring av prøven, 2) oksygenkalibrering i Oroboros-instrumentet, 3) oksygenforbruksmåling for intakte og permeabiliserte celler, og 4) dataekstraksjon fra utstyret og analysen. Forkortelser: CASA = datamaskinassistert sædanalyse; BWW = Biggers Whitten Whittingham medium; MRM = mitokondriell respirasjonsmedium; ADP = adenosindifosfat; FCCP = karbonylcyanid-p- trifluormetoksyfenylhydrazon; AA = antimycin A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MERK: Arbeidsflyten for måling av oksygenforbruket i sædceller ved bruk av HRR er vist i figur 1. Informasjon om materialene, utstyret og reagensene som brukes i protokollen, presenteres i materialfortegnelsen.

1. Forberedelse av prøver

  1. Eksempel på innsamling
    1. Samle fersk ejakulert menneskelig sæd ved onani etter en anbefalt 3 dagers avholdenhet i en steril plastbeholder. Transporter prøvene umiddelbart til laboratoriet.
    2. Inkuber prøvene i 30-60 min ved romtemperatur (RT) for å væske helt24.
    3. Etter flytendegjøring oppbevares prøvene ved 37 °C til forsøket begynner.
  2. Sperm evaluering med dataassistert sperm analyse (CASA)
    1. Bland prøven, og legg 7 μL inn i et forvarmet sædtellekammer.
    2. Plasser kammeret på det forvarmede (37 °C) trinnet i et direkte lysmikroskop.
    3. Åpne den datastyrte sædanalyseprogramvaren, og skriv inn motilitets- og konsentrasjonsmodulen (klikk på Mot).
    4. Velg konfigurasjonen som tilsvarer menneskelige sædforhold.
      MERK: Konfigurasjonen må tilpasses kammerets type og dybde, samt prøveartene og systemets CASA.
    5. Analyser tilfeldig 10 forskjellige felt per kammer ved å klikke på Analyser-knappen .
    6. Klikk på Resultater for å få prøvekonsentrasjon og motilitet.
  3. Cell forberedelse
    MERK: Hvis HRR ikke er kalibrert, start med trinn 2.1-2.2 før du klargjør cellene (trinn 1.3). Det er viktig å måle oksygenforbruket umiddelbart når sædcellene resuspenderes i mediet.
    1. Sentrifuger prøvene ved 400 x g i 10 min ved RT.
    2. Fjern sædplasmaet og resuspender spermatozoa i 2 ml Biggers Whitten Whittingham (BWW) for eksperimenter med intakte celler eller mitokondrielt respirasjonsmedium (MRM) for studier med permeabiliserte celler. Medienes sammensetninger er vist i tabell 1.
    3. Gjenta trinnene beskrevet i trinn 1.2 for studier av sædkonsentrasjon.

2. Høyoppløselig respirometri: OXPHOS-analyse

MERK: HRR integrerer svært følsomme oksygrafer (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Østerrike) med programvare (DatLab, versjon 4.2; Oroboros Instruments GmbH). De eksperimentelle dataene vises som oksygenkonsentrasjon versus tid (som pmol av O2 / 106 celler · min-1) og som sanntidstransformasjoner av disse dataene, slik at eksperimentøren kan spore respirasjonen (oksygenforbruk, oksygenfluks) av biologiske og biokjemiske prøver mens eksperimentet fortsatt kjører. HRR kan brukes til å følge respirasjonen til levende og bevegelige celler, noe som er spesielt nyttig for sædceller, hvis motilitet er forbundet med sædkvalitet og fruktbarhetspotensial. Laboratoriet bruker en HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, med to kamre. Trinnene beskrevet i denne protokollen må utføres uavhengig for begge kamrene på 2 ml.

  1. Forberedelse av utstyr
    1. Slå på HRR, og koble den til respirometriprogramvaren (DatLab) for datainnsamling og analyse.
    2. Bytt ut 70% etanol i oksygrafkammeret med ddH2O. Rør den kontinuerlig med den magnetiske rørestangen i kammeret ved 750 o / min. La det stå i 10 min, og aspirer den dobbeltdestillerte (dd) H2O etterpå.
    3. Vask kammeret tre ganger med ddH2O i 5 min hver gang.
      MERK: Dette trinnet er nødvendig for å fjerne gjenværende etanol fra kamrene. Sædceller er svært følsomme for etanol. Opptaket kan bli kompromittert hvis dette trinnet utelates.
  2. Kalibrering av oksygensensorene
    MERK: Kalibreringsprosedyren varierer litt avhengig av instrumentet. Utfør en luftkalibrering av den polarografiske oksygensensoren som beskrevet av produsenten25. I denne delen forklares kalibreringsprotokollen kort.
    1. Fjern ddH 2 O og pipett2ml av samme medium som brukes til cellepreparering inn i kammeret. Plasser proppene, og la en luftutvekslingsboble.
      MERK: Det er viktig å vite volumet av kammeret for å bestemme det nøyaktige volumet av medium som trengs.
    2. Registrer oksygenkalibreringsverdiene (klikk på Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) for å overvåke ytelsen til sensormembranen ved å røre mediet med rørestangen ved 750 o / min i minst 30 minutter ved 37 ° C. Bruk de andre innstillingene som nevnt: forsterkning for sensor: 2; polarisasjonsspenning: 800 mV; Dataregistreringsintervall: 2,0 s.
      MERK: Det forventes å oppnå en O 2 skråning ukorrigert (rød linje) innen ±2 pmol∙s−1∙ml−1 med et stabilt signal fra den polarografiske sensoren.
    3. Dra musen mens du holder nede venstre museknapp og Skift-tasten for å velge et område der endringen i oksygenkonsentrasjon (Y1 O2-konsentrasjon, blå linje) er stabil.
    4. Åpne O2 Kalibreringsvinduet (klikk på Oxygraph > O2 Calibration). I Luftkalibrering endrer du det valgte merket til regionen som ble valgt i trinn 2.2.3. Avslutt med å klikke på Kalibrer og Kopier til utklippstavlen.
    5. Stopp opptaket, og lagre ved å klikke på Oxygraph > Ok Control > Save and Disconnect.
      MERK: Dette datasettet må lagres slik at det kan brukes i alle dagens eksperimenter. Kalibreringen utføres kun én gang per dag for hvert medium.
  3. Digitonin-permeabilisering titrering
    1. Åpne kammeret, og aspirer mediet inni.
    2. Belastning i kammeret minst 24 x 10 6 og ikke mer enn 70 x 106 sædceller i et endelig volum på 2 ml MRM.
      MERK: Det er viktig å måle antall celler i kammeret for å justere oksygenforbruket på slutten av forsøket. Et lavere antall celler enn anbefalt kan ikke måles.
    3. Lukk kammeret ved å skyve proppene helt inn, og aspirer den gjenværende væsken øverst. Start eksperimentet med de samme innstillingene som for kalibreringen: omrøringshastighet: 750 o / min; temperatur: 37 °C; forsterkning for sensor: 2; polarisasjonsspenning: 800 mV; og dataregistreringsintervall: 2,0 s.
    4. For å laste kalibreringen, dobbeltklikk på Pos Calib-boksen i nederste hjørne. Åpne kalibreringen som ble utført i trinn 2.2 (klikk på Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File), og klikk på Kalibrer og Kopier til utklippstavlen.
      NOTAT: POS Calib-boksen endres fra gul til grønn. Dataene vises i oksygenstrømningskorrigert per volumdiagrammer (Layout 05 Flux per volum ukorrigert). Ulike oppsett er tilgjengelige i Oxygraph > Layout.
    5. Tilsett 5 μL 0,5 M adenosindifosfat (ADP), 10 μL 2 M glutamat og 2,5 μL 0,4 M malat (endelige konsentrasjoner: 1,25 mM, 10 mM og 0,5 mM). Mål oksygenforbruket til signalet stabiliserer seg.
      MERK: Precision Hamilton mikrosprøyter brukes til injeksjon gjennom lasteporten i proppen. Bruk en sprøyte per legemiddel for å unngå krysskontaminering. Klikk på F4 for å registrere, og merk i oksygenregisteret når en behandling legges til.
      MERK: Substratene tilberedes i ultrarent vann og lagres ved -20 °C i 3 måneder.
    6. Tritat ved å tilsette 1 μL 10 mM digitonin i påfølgende trinn til oksygenopptaket når et maksimalt nivå.
      MERK: Grundig vask med vann, 70% etanol og 100% etanol er viktig hvis det samme kammeret brukes til to eksperimenter på samme dag.
      MERK: Digitonin fremstilles i ultrarent vann og lagres ved -20 °C i 3 måneder.
  4. Rutinemessig respirasjonsvurderingsprotokoll for intakte og permeabiliserte sædceller (kompleks I eller kompleks II)
    1. Åpne kammeret, og aspirer mediet inni.
    2. Belastning i kammeret minst 24 x 10 6 og ikke mer enn 70 x 106 sædceller i et endelig volum på 2 ml BWW (intakt celleanalyse) eller MRM (permeabilisert celleanalyse).
    3. Start eksperimentet med de samme innstillingene som for kalibreringen (dette er beskrevet i trinn 2.3.3).
    4. Last inn kalibreringen som ble utført i trinn 2.2 som beskrevet i trinn 2.3.4.
    5. Registrer respirasjonen av cellene i minst 5 minutter til et stabilt signal er oppnådd. Denne målingen tilsvarer basal respirasjon i intakte celler.
    6. Hvis eksperimentet er med intakte celler, fortsett til trinn 2.4.9. For permeabiliserte celler, injiser 4,5 μL 10 mM digitonin (endelig konsentrasjon: 22,5 μM). Permeabiliser cellene i 5 minutter.
    7. Tilsett substratene: 10 μL 2 M glutamat og 2,5 μL 0,4 M malat (endelige konsentrasjoner: henholdsvis 10 mM og 0,5 mM) for kompleks I eller 20 μL 1 M succinat (endelig konsentrasjon: 10 mM) for kompleks II. Mål oksygenforbruket til signalet øker og stabiliserer seg. Dette er tilstand 4, som betyr basalkompleks I eller basalkompleks II støttet respirasjon i fravær av ADP.
      MERK: Substratene tilberedes i ultrarent vann og lagres ved -20 °C i 3 måneder.
    8. Injiser 5 μL 0,5 M ADP (endelig konsentrasjon: 1,25 mM). Mål oksygenforbruket til signalet øker og stabiliserer seg. Tilsetningen av ADP øker signalet som svarer til det maksimale oksygenforbruket gjennom kompleks I eller kompleks II (tilstand 3, i permeabiliserte celler).
    9. Legg til 1 μL 4 mg/ml oligomycin (endelig konsentrasjon: 2 μg/ml), en ATP-syntetasehemmer. Mål oksygenforbruket til signalet synker og stabiliserer seg.
      MERK: Oligomycin fremstilles i etanol og oppbevares ved -20 °C i 3 måneder.
    10. Titrer ved å tilsette 1 μL 0,1 mM til 1 mM karbonylcyanid-P-trifluormetoksyfenylhydrazon (FCCP) i påfølgende trinn til en maksimal ukoblet respirasjonshastighet er nådd. Mål oksygenforbruket til signalet øker og stabiliserer seg.
      MERK: FCCP tilberedes i etanol og oppbevares ved -20 °C i 3 måneder.
    11. Den endelige konsentrasjonen av FCCP er prøveavhengig. Slutt å injisere stoffet når oksygenforbruket begynner å synke.
    12. Injiser til slutt 1 μL 5 mM antimycin A (2,5 μM endelig konsentrasjon). Dette er en kompleks III-hemmer for å diskriminere mellom mitokondrielt og gjenværende oksygenforbruk (ikke-mitokondriell respirasjon). For analyse av kompleks I, legg til 1 μL 1 mM rotenon (0, 5 μM endelig konsentrasjon), en inhibitor av dette komplekset, i stedet for AA. Mål oksygenforbruket til signalet synker og stabiliserer seg.
      MERK: Legemidlene tilberedes i etanol og oppbevares ved -20 °C i 3 måneder.

3. Datautvinning og analyse

Figure 2
Figur 2: Innsamling av respiratoriske parametere fra et høyoppløselig respirometrieksperiment. (A,B) Skjematiske fremstillinger av grafer oppnådd, som beskrevet i figur 1, for henholdsvis intakte og permeabiliserte celler. Disse parametrene er tidligere beskrevet15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Dra musen ved å trykke på venstre museknapp og Skift-tasten for å velge regioner der oksygenfluksen per volum korrelert (Y2 O2 helling uncorr., rød linje) er stabil etter injeksjon av et substrat eller en inhibitor. Figur 2 viser de ulike parameterne hentet fra registeret som tidligere er beskrevet15.
    MERK: Parametrene avhenger av eksperimentet. alle er som følger: basal respirasjon i intakte celler og respirasjon i nærvær av glutamat/malat eller succinat (tilstand 4), ADP (tilstand 3), oligomycin (protonlekkasje), FCCP (maksimal respirasjonshastighet), rotenon/AA (ikke-mitokondriell respirasjon). I permeabiliserte celler tilsvarer basal respirasjon tilstand 3.
  2. Klikk på merke- > statistikkvinduene , og eksporter dataene.
  3. Normaliser dataene som er oppnådd per 1 million sædceller. Enhetene i skråningene er pmolO2·s−1·ml−1·10−6 celler.
  4. Trekk det ikke-mitokondrielle oksygenforbruket fra alle verdiene før du beregner indeksene.
  5. Beregn indeksene ved hjelp av de ulike ligningene som tidligere er beskrevet15:
    Equation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestemmelse av optimal konsentrasjon av digitonin i sædceller
I denne protokollen presenterer vi bruken av HRR for å overvåke sanntidsendringer i OXPHOS i humane sædceller. Siden metoden kan brukes til å analysere intakt eller digitoninpermeabilisert sæd, presenterer vi først standardiseringen av digitoninkonsentrasjon som kreves for å permeabilisere sædceller (figur 3).

Digitonin brukes til kjemisk permeabilisering, som gjør at substrater kan komme inn i celler, og for måling av mitokondriell aktivitet. Denne forbindelsen må titreres i intakte celler for å oppnå den optimale konsentrasjonen som kreves for å sikre cellemembranpermeabilisering uten å kompromittere mitokondriemembranintegriteten. Vi utførte en titrering i nærvær av ADP, glutamat og malat. Respirasjonsfrekvenser ble målt ved baseline og etter gradvis tillegg av digitonin (figur 3A). Oksygenforbruket stiger med økende vaskemiddelkonsentrasjon og når et punkt der integriteten til den ytre mitokondriemembranen begynner å bli kompromittert (rød pil i figur 3A). Figur 3B viser gjennomsnittlig ± standardfeil på 4 representative eksperimenter. Resultatet viser at permeabiliseringen er optimal ved en digitoninkonsentrasjon på 22,5 μM (figur 3A,B). Mitokondriell aktivitet avtar når for høye mengder digitonin brukes.

Representasjon av vellykket og suboptimalt register over sædrespirasjon ved HRR
Under overvåking av spermikondriell respirasjon kan registeret visualiseres som O2-konsentrasjon (blå linje) ogO2-strømning per volum korrelert (rød linje) beregnet med DatLab 4-analyseprogrammet i både permeabiliserte og ikke-permeabiliserte celler (figur 4). Figur 4 viser representative kurver for intakte (figur 4A,B) og digitoninpermeabiliserte (figur 4C,D) sædceller fra en sædprøve. Figur 4A representerer en vellykket registrering av intakte sædceller fra en sædprøve, hvor effekten av medikamenter som modulerer oksygenforbruket observeres, og det er mulig å trekke ut parametrene for beregning av indeksene. Basalrespirasjon registreres i intakte celler ved oksygenforbruk i nærvær av eksogene substrater. Deretter ble den ikke-fosforylerende respirasjonshastigheten målt ved å legge til en ATP-syntasehemmer (oligomycin). Deretter ble protonoforen FCCP injisert i forskjellige konsentrasjoner, og den maksimale mitokondrielle frakoblede respirasjonshastigheten ble bestemt. Dette stoffet fører til en økning i protonpermeabiliteten til den indre membranen, noe som gjør at passiv bevegelse av protoner kan spre den kjemiosmotiske gradienten som forårsaker en økning i oksygenforbruket. Til slutt ble AA tilsatt for å hemme mitokondriell respirasjon.

Kvaliteten på dataene som er oppnådd, er nært knyttet til cellenummeret. Det er viktig å ha et høyt basalt oksygenforbruk for å få en god registrering. Den etterfølgende analysen avhenger av subtile endringer iO2-forbruk som kanskje ikke oppdages hvis basallinjen ikke er høy nok. Celletall lavere enn anbefalt kan føre til et resultat som figur 4B.

Representative kurver oppnådd ved bruk av protokollen for komplekse I- eller II-spesifikke substrater er vist i henholdsvis figur 4C og figur 4D. For å studere oksygenforbruket gjennom mitokondriekomplekset I eller kompleks II ble substratene malat og glutamat eller succinat tilsatt etter permeabilisering av cellene. Deretter legges ADP til for konvertering til ATP (tilstand 3, aktivt kompleks I eller II avhengig respirasjon). Til slutt administreres rotenon eller AA for å hemme henholdsvis kompleks I eller II.

For tolkning av resultatene er det viktig å ta i betraktning at cellulær respirasjon hemmet av oligomycin er en direkte måling av protonlekkasjerate over mitokondriemembranen i intakte celler, som er sammenlignbar med tilstanden 4 av permeabiliserte celler (uten ADP) (figur 2B). I tilfelle av intakte celler (ikke-permeabilisert), indikerer denne mengden fraksjonen av basal mitokondrielt oksygenforbruk som er uavhengig av ATP-syntese. Maksimal respirasjonshastighet nås etter tilsetning av flere doser FCCP. I intakte celler avhenger av to faktorer; aktiviteten til elektrontransportkompleksene og antall mitokondrier i hver celle. Tilstand 3 av permeabiliserte celler etter addisjon av ADP ligner basal respirasjon av den intakte cellen ved mettende konsentrasjoner av eksogene substrater (figur 2B)7. Tabell 2 viser et eksempel på indeksene beregnet ut fra postene i figur 4.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse av optimal konsentrasjon av digitonin for permeabilisering av humane sædceller. Respirasjonshastigheten ble målt til 37 °C i MRM-medium med glutamat, malat og adenosindifosfat. (A) Representativt luftveisspor. Den blå linjen erO2-konsentrasjonen , og den røde linjen representerer O2-strømmen per volum korrelert. (B) Mitokondrienes respirasjonshastighet betyr ± standardfeil, n = 4. Den røde pilen representerer den optimale konsentrasjonen. Forkortelse: dig = digitonin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative respiratoriske spor for oksygenforbruket oppnådd ved bruk av Oroboros-instrumentet. Respirasjonsfrekvensen ble målt til 37 °C i (A,B) intakte og (C,D) permeabiliserte celler. Den blå linjen erO2-konsentrasjonen, og den røde linjen representerer O2-strømmen per volum korrelert. Ratene i A, C og D ble målt med mer enn 30 x 10 6 sædceller, mens frekvensen i B ble målt med 14 x 106 sædceller. Forkortelser: Oligo = oligomycin; FCCP = karbonylcyanid-p- trifluormetoksyfenylhydrazon; Glu/Mal = glutamat/malat; ADP = adenosindifosfat; AA = antimycin A; Råte = rotenon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammensetning av BWW- og MRM-medier for eksperimenter med henholdsvis intakte eller permeabiliserte celler. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Representative eksempler på HRR-indekser. Data ble hentet fra sporene vist i figur 4. Indeksene er beregnet etter figur 2 og protokolldel 3. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HRR avhenger kritisk av flere trinn: (a) vedlikehold av utstyret, (b) nøyaktig kalibrering av oksygensensorene, (c) uncoupler-titrering26, og til slutt (d) tilstrekkelig bruk av indekser som representerer mitokondriefunksjonen. Vedlikehold av utstyr er avgjørende. Det anbefales å bytte ut membranene til den polarografiske oksygensensoren regelmessig og korrigere instrumentbakgrunnen. Omfattende vask etter samling av spermatozoa fra kamrene er avgjørende for å oppnå gode replikater, spesielt i laboratorier der instrumentene ofte brukes til å analysere forskjellige vev eller celler. Spermatozoa er følsomme for selv små mengder rotenon, AA, oligomycin og FCCP, så vasketrinnet må utføres nøye (minst tre ganger med etanol og ytterligere tre ganger med destillert vann). Kalibrering er et avgjørende trinn; Det må utføres hver dag og for hvert av mediene som brukes (se protokoll trinn 2.2). Uncoupler-titreringene må utføres nøye, da de optimale frakoblede konsentrasjonene må brukes for å oppnå maksimal stimulering av fluks og unngå overtitrering, noe som paradoksalt nok hemmer respirasjonen27. Den optimale frakoblede konsentrasjonen avhenger av celletype, cellekonsentrasjon og medium og er forskjellig for permeabiliserte celler sammenlignet med intakte celler14. Når det gjelder sædprøver, der sædcellene kan være heterogene, må frakoblingen tilpasses hver prøve28,29,30. Etter respirometri oppnås flere parametere som må korrigeres for antall celler før analyse. Det beregnes tre indekser som tillater tolkning av mitokondriell funksjon, og disse har fordelen av å være uavhengige av antall mitokondrier og celler. Vi fremhever bruken av respiratorisk kontrollforhold (RCR), som indikerer effektiviteten av mitokondriell kobling og er følsom for flere potensielle dysfunksjonssteder7. Imidlertid kan andre parametere og indekser brukes avhengig av eksperimentet31.

Begrensningene til HRR er som følger: (a) enheten er ikke automatisert, så det krever konstant tilstedeværelse av en operatør og er tidkrevende; (b) HRR-innretningen har bare to kamre, og bare to analyser kan utføres samtidig; c) kamrene ikke er til engangsbruk og kan være forurenset med hemmere eller en annen type vev, (d) Selv om følsomheten til instrumentet er svært høy, fant teamet vårt at minst 12 millioner / ml sæd er nødvendig for å oppdage variasjoner i oksygenforbruk, slik at vi ikke kunne måle sæd fra oligozoospermiske menn; og (e) operatøren må være klar over at målingene er for alle cellene som er tilstede i prøvene. Sædprøver er heterogene og inneholder andre celletyper (f.eks. leukocytter). For å unngå forurensning er det nødvendig å bruke prøver med lave konsentrasjoner av leukocytter7. Alternativt kan et ekstra sædrensingstrinn utføres før oksymeterforsøkene (f.eks. svømme opp eller svømme ned)24.

Et alternativ til HRR er bruken av den ekstracellulære fluksanalysatoren. Fordelene med den ekstracellulære fluksanalysatoren i forhold til høyoppløselig oksygraf for måling av sædmetabolisme er som følger: (a) den ekstracellulære fluksanalysatoren er et stort sett automatisert instrument; (b) den kan måle oksygenforbruket i 24-brønns og 96-brønnplater for høy gjennomstrømningsscreening, noe som betyr at det krever mindre mengder biologiske prøver; og (c) det tillater ytterligere måling av spermiens glykolytiske fluks. Noen fordeler med HRR over den ekstracellulære fluksanalysatoren er som følger: (a) med HRR er kostnaden for instrumentet og forbruksvarer lavere; (b) med HRR er det ikke nødvendig med tre til fire replikater av hver måling som i den ekstracellulære fluksanalysatoren, som disse replikatene er nødvendige for å håndtere den høye fluorescensvariabiliteten; c) gjennomførbarheten av titreringsprotokollene for substrat-frakoblede inhibitorer med HRR er høy, og (c) cellene overvåkes i bevegelse og ikke festet. Oksimetri kan analysere oksygenforbruket av motile (levende) og intakte (ikke-permeabiliserte) spermatozoer 7,31,32. Dette er en fordel når det gjelder spermatozoa, siden sædadhesjon til plastoverflaten potensielt kan endre deres bevegelsesmønstre og funksjon.

HRR er mer følsom enn konvensjonell respirometri og er egnet for medisinsk bruk i humane spermatozoer, hvor antall celler fra hver sædprøve ikke kan økes (for eksempel dyrkede celler). Denne teknikken kan brukes til å overvåke sædrespirasjon fra de fleste sædprøver, både fra normale og infertile menn. RCR kan brukes som en god indikator på human spermfunksjonell status, og en grenseverdi på 3,15 (sensitivitet og spesifisitet på henholdsvis 73% og 61%) skiller mellom sædprøver med normal og unormal konvensjonell sædanalyse32. HRR kan brukes til å forstå sperm mitokondriell metabolisme, som kan være ansvarlig for mannlig infertilitet, og være et supplement til standard sædanalyse.

Den nyeste nye generasjonen Oroboro-instrumenter tillater analyse av oksygenforbruk i forbindelse med andre sædfunksjoner, for eksempel produksjon av H 2 O2, og kan bidra til å forstå sædfunksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Fertilab Andrology klinikken, spesielt José María Montes og Andrea Torrents, for å gi oss tilgang til givere. Finansiering: AC støttes av tilskudd fra Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Ytterligere finansiering ble hentet fra Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. og R.S. støttes av Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 og FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). PI støttes av POS_FMV_2018_1_1007814 og CAP-UDELAR 2020. Figurene er illustrert med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
  3. Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
  4. Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
  5. Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
  6. Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
  7. Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
  8. Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
  9. Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
  10. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
  11. Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
  12. Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
  13. Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
  14. Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
  17. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  18. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  19. Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
  20. Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
  21. Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
  22. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
  23. Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
  24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
  25. Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
  26. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
  27. Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
  28. Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
  29. Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
  30. Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
  31. Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
  32. Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).

Tags

Høyoppløselig respirometri mitokondriell funksjon humane spermatozoer sædkvalitet sædanalyse mannlig infertilitet sperm mitokondriell aktivitet oksygenforbruk lukket kammersystem sædkvalitet sperm mitokondrier intakte sædceller permeabiliserte spermatozoer respiratoriske kjedekomplekser høyoppløselig oksygrafinstrument oksygenkonsentrasjon oksygenforbruk respiratoriske indekser

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Høyoppløselig respirometri for å vurdere mitokondriell funksjon i humane spermatozoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter