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Medicine

Respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale negli spermatozoi umani

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

L'analisi della funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante respirometria ad alta risoluzione consente di misurare il consumo di ossigeno degli spermatozoi che si muovono liberamente in un sistema a camera chiusa. La tecnica può essere applicata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani, che fornisce informazioni sulle caratteristiche e sull'integrità mitocondriale degli spermatozoi.

Abstract

La qualità dello sperma viene spesso studiata mediante lo spermiogramma di routine, che è descrittivo e spesso inconcludente. L'infertilità maschile è associata a un'alterata attività mitocondriale degli spermatozoi, quindi la misurazione della funzione mitocondriale degli spermatozoi è un indicatore della qualità dello sperma. La respirometria ad alta risoluzione è un metodo per misurare il consumo di ossigeno di cellule o tessuti in un sistema a camera chiusa. Questa tecnica può essere implementata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani e fornisce informazioni sulla qualità e l'integrità dei mitocondri degli spermatozoi. La respirometria ad alta risoluzione consente alle cellule di muoversi liberamente, il che è un vantaggio a priori nel caso degli spermatozoi. Questa tecnica può essere applicata con spermatozoi intatti o permeabilizzati e consente di studiare la funzione mitocondriale degli spermatozoi intatti e l'attività dei singoli complessi della catena respiratoria. Lo strumento ossigrafo ad alta risoluzione utilizza sensori per misurare la concentrazione di ossigeno accoppiati a un software sensibile per calcolare il consumo di ossigeno. I dati vengono utilizzati per calcolare gli indici respiratori in base ai rapporti di consumo di ossigeno. Di conseguenza, gli indici sono le proporzioni di due tassi di consumo di ossigeno e sono normalizzati internamente al numero di cellule o alla massa proteica. Gli indici respiratori sono un indicatore della funzione mitocondriale e della disfunzione degli spermatozoi.

Introduction

Si stima che l'infertilità maschile rappresenti il 40%-50% di tutti i casi di infertilità nelle coppie1. Lo spermiogramma convenzionale svolge un ruolo cruciale nel determinare la fertilità maschile; Tuttavia, circa il 15% degli uomini infertili ha parametri spermatici normali2. Inoltre, lo spermiogramma di routine fornisce informazioni limitate sulla funzione degli spermatozoi e non riflette i difetti sottili degli spermatozoi3.

I mitocondri degli spermatozoi hanno una struttura speciale, in quanto sono disposti come una guaina elicoidale attorno ai flagelli. La guaina mitocondriale contiene un numero variabile di mitocondri collegati da linker intermitocondriali e ancorati al citoscheletro da disposizioni proteiche ordinate sulla membrana mitocondriale esterna 4,5. Questa struttura rende particolarmente difficile l'isolamento dei mitocondri degli spermatozoi. Pertanto, la maggior parte degli studi sulla funzione mitocondriale degli spermatozoi utilizza analisi in situ o spermatozoi demembranati6.

La struttura e la funzione mitocondriale degli spermatozoi sono state costantemente collegate all'infertilità maschile 7,8,9,10,11, suggerendo che l'analisi della struttura e della funzione di questi organelli può essere un buon candidato per l'inclusione nell'analisi dello sperma.

I mitocondri svolgono un ruolo importante nel metabolismo energetico cellulare, in particolare utilizzando l'ossigeno per produrre adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Negli spermatozoi, in particolare, la fonte di ATP (glicolisi vs. OXPHOS) è controversa e molti dei dati rimangono controversi e dipendono da diversi approcci sperimentali 4,12,13. Le misurazioni della respirazione mediante ossimetria offrono informazioni significative sulla capacità respiratoria mitocondriale, sull'integrità mitocondriale e sul metabolismo energetico della cellula14,15,16. Tradizionalmente, questa tecnica è stata eseguita utilizzando l'elettrodo di ossigeno Clark, uno strumento che è stato utilizzato per misurare la respirazione mitocondriale per più di 50 anni17,18. Inoltre, il consumo di ossigeno mitocondriale degli spermatozoi è stato analizzato utilizzando il classico elettrodo di ossigeno Clark 19,20,21. La respirometria ad alta risoluzione (HRR) mediante ossigrafi (Oroboros) fornisce una sensibilità maggiore rispetto all'utilizzo di dispositivi di respirometria classici22. Gli ossigrafi sono composti da due camere con porte di iniezione e ogni camera ha un sensore di ossigeno polarografico. Con questa tecnica è possibile analizzare vetrini di tessuto, cellule e sospensioni mitocondriali isolate. Il campione viene continuamente agitato nella camera e, durante l'esperimento, viene misurato il consumo di ossigeno e i tassi di ossigeno vengono calcolati utilizzando un software specifico. Le camere mostrano una ridotta perdita di ossigeno, che è un vantaggio rispetto ai dispositivi convenzionali con elettrodi di ossigeno14,23.

Come per altre cellule, nel caso degli spermatozoi, la sensibilità dell'apparecchiatura HRR è superiore a quella della respirometria convenzionale, il che significa che l'apparecchiatura HRR può essere utilizzata per l'analisi di un numero limitato di spermatozoi intatti o permeabilizzati. Esistono due strategie principali per valutare la funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante HRR: (a) misurare il consumo di ossigeno nelle cellule intatte, che comporta la riproduzione della funzione respiratoria in un mezzo contenente substrati come il glucosio, o (b) misurare il consumo di ossigeno nelle cellule permeabilizzate utilizzando uno dei complessi OXPHOS, con l'aggiunta di substrati specifici per monitorare ciascuna funzione separatamente.

Nel presente studio, descriviamo l'uso dell'HRR per determinare la respirazione mitocondriale negli spermatozoi umani.

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Protocol

Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico della Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro per la respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale in spermatozoi umani intatti e permeabilizzati. Il protocollo è stato suddiviso in quattro diverse fasi: 1) preparazione del campione, 2) calibrazione dell'ossigeno nello strumento Oroboros, 3) misurazione del consumo di ossigeno per cellule intatte e permeabilizzate e 4) estrazione dei dati dall'apparecchiatura e analisi. Abbreviazioni: CASA = analisi dello sperma assistita da computer; BWW = Biggers Whitten Whittingham medio; MRM = mezzo di respirazione mitocondriale; ADP = adenosina difosfato; FCCP = cianuro di carbonile -p-trifluorometossifenilidrazone; AA = antimicina A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: Il flusso di lavoro per misurare il consumo di ossigeno negli spermatozoi utilizzando HRR è mostrato nella Figura 1. Le informazioni sui materiali, le attrezzature e i reagenti utilizzati nel protocollo sono presentate nell'Indice dei materiali.

1. Preparazione del campione

  1. Raccolta dei campioni
    1. Raccogliere lo sperma umano appena eiaculato mediante masturbazione dopo un'astinenza consigliata di 3 giorni in un contenitore di plastica sterile. Trasportare immediatamente i campioni in laboratorio.
    2. Incubare i campioni per 30-60 minuti a temperatura ambiente (RT) per liquefare completamente24.
    3. Dopo la liquefazione, conservare i campioni a 37 °C fino all'inizio dell'esperimento.
  2. Valutazione dello sperma con l'analisi dello sperma assistita da computer (CASA)
    1. Mescolare il campione e caricare 7 μL in una camera per il conteggio degli spermatozoi preriscaldata.
    2. Posizionare la camera sul tavolino preriscaldato (37 °C) di un microscopio a luce diretta.
    3. Aprire il software computerizzato per l'analisi dello sperma ed entrare nel modulo di motilità e concentrazione (cliccare su Mot).
    4. Selezionare la configurazione che corrisponde alle condizioni dello sperma umano.
      NOTA: La configurazione deve essere adattata al tipo e alla profondità della camera, nonché alla specie campione e al sistema CASA.
    5. Analizza in modo casuale 10 campi diversi per camera facendo clic sul pulsante Analizza .
    6. Fare clic su Risultati per ottenere la concentrazione e la motilità del campione.
  3. Preparazione delle cellule
    NOTA: Se l'HRR non è calibrato, iniziare con i passaggi 2.1-2.2 prima di preparare le celle (passaggio 1.3). È importante misurare il consumo di ossigeno immediatamente quando gli spermatozoi vengono risospesi nel terreno.
    1. Centrifugare i campioni a 400 x g per 10 minuti a RT.
    2. Rimuovere il plasma seminale e risospendere gli spermatozoi in 2 mL di Biggers Whitten Whittingham (BWW) per esperimenti con cellule intatte o mezzo di respirazione mitocondriale (MRM) per studi con cellule permeabilizzate. Le composizioni dei supporti sono riportate nella Tabella 1.
    3. Ripetere i passaggi descritti al punto 1.2 per gli studi sulla concentrazione degli spermatozoi.

2. Respirometria ad alta risoluzione: analisi OXPHOS

NOTA: HRR integra ossigrafi altamente sensibili (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Austria) con software (DatLab, versione 4.2; Oroboros Instruments GmbH). I dati sperimentali vengono visualizzati come concentrazione di ossigeno in funzione del tempo (come pmol di O2/106 cellule·min−1) e come trasformazioni in tempo reale di questi dati, consentendo allo sperimentatore di monitorare la respirazione (consumo di ossigeno, flusso di ossigeno) di campioni biologici e biochimici mentre l'esperimento è ancora in corso. L'HRR può essere utilizzato per seguire la respirazione delle cellule vive e mobili, il che è particolarmente utile per gli spermatozoi, la cui motilità è associata alla qualità dello sperma e al potenziale di fertilità. Il laboratorio utilizza un HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, con due camere. I passaggi descritti in questo protocollo devono essere eseguiti in modo indipendente per entrambe le camere da 2 mL.

  1. Preparazione dell'attrezzatura
    1. Accendere l'HRR e collegarlo al software di respirometria (DatLab) per l'acquisizione e l'analisi dei dati.
    2. Sostituire l'etanolo al 70% nella camera dell'ossigrafo con ddH2O. Agitare continuamente con l'ancoretta magnetica nella camera a 750 giri/min. Lasciare riposare per 10 minuti e successivamente aspirare la bidistillazione (dd) H2O.
    3. Lavare la camera tre volte con ddH2O per 5 minuti ogni volta.
      NOTA: Questo passaggio è necessario per rimuovere l'etanolo rimanente dalle camere. Gli spermatozoi sono molto sensibili all'etanolo. La registrazione potrebbe essere compromessa se questo passaggio viene omesso.
  2. Calibrazione dei sensori di ossigeno
    NOTA: La procedura di calibrazione varia leggermente a seconda dello strumento. Eseguire una calibrazione dell'aria del sensore polarografico di ossigeno come descritto dal produttore25. In questa sezione viene spiegato brevemente il protocollo di calibrazione.
    1. Rimuovere il ddH 2 O e pipettare2mL dello stesso terreno utilizzato per la preparazione delle cellule nella camera. Posizionare i tappi, lasciando una bolla di ricambio d'aria.
      NOTA: È importante conoscere il volume della camera per determinare l'esatto volume di fluido necessario.
    2. Registrare i valori di calibrazione dell'ossigeno (fare clic su Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) per monitorare le prestazioni della membrana del sensore agitando il fluido con l'ancoretta a 750 giri/min per almeno 30 minuti a 37 °C. Utilizzare le altre impostazioni come menzionato: guadagno per sensore: 2; tensione di polarizzazione: 800 mV; Intervallo di registrazione dei dati: 2,0 s.
      NOTA: Si prevede di ottenere una pendenza di O 2 non corretta (linea rossa) entro ±2 pmol∙s−1∙mL−1 con un segnale stabile dal sensore polarografico.
    3. Trascinare il mouse tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse e il tasto Maiusc per selezionare un'area in cui la variazione della concentrazione di ossigeno (concentrazione di O2 Y1, linea blu) è stabile.
    4. Aprire la finestra Calibrazione O2 (fare clic su Oxygraph > Calibrazione O2). In Calibrazione aria, modificare il contrassegno selezionato nella regione selezionata al punto 2.2.3. Termina facendo clic su Calibra e copia negli appunti.
    5. Interrompi la registrazione e salva facendo clic su Oxygraph > Ok Control > Salva e Disconnetti.
      NOTA: questo set di dati deve essere salvato in modo che possa essere utilizzato in tutti gli esperimenti del giorno. La calibrazione viene eseguita solo una volta al giorno per ciascun fluido.
  3. Titolazione di permeabilizzazione della digitonina
    1. Aprire la camera e aspirare il fluido all'interno.
    2. Caricare nella camera almeno 24 x 10 6 e non più di 70 x 106 spermatozoi in un volume finale di 2 mL di MRM.
      NOTA: È importante misurare il numero di cellule nella camera per regolare il consumo di ossigeno alla fine dell'esperimento. Non è possibile misurare un numero di celle inferiore a quello consigliato.
    3. Chiudere la camera spingendo i tappi fino in fondo e aspirare il liquido rimanente nella parte superiore. Iniziare l'esperimento con le stesse impostazioni della calibrazione: velocità di agitazione: 750 giri/min; temperatura: 37 °C; guadagno per sensore: 2; tensione di polarizzazione: 800 mV; e intervallo di registrazione dei dati: 2,0 s.
    4. Per caricare la calibrazione, fare doppio clic sulla casella Pos Calib nell'angolo in basso. Aprire la calibrazione eseguita al punto 2.2 (fare clic su Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File) e fare clic su Calibrate and Copy to Clipboard.
      NOTA: La casella POS Calib cambierà da gialla a verde. I dati vengono visualizzati nei grafici del flusso di ossigeno corretto per volume (Layout 05 Flusso per volume non corretto). Diversi layout sono disponibili in Oxygraph > Layout.
    5. Aggiungere 5 μL di adenosina difosfato 0,5 M (ADP), 10 μL di glutammato 2 M e 2,5 μL di malato 0,4 M (concentrazioni finali: 1,25 mM, 10 mM e 0,5 mM). Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non si stabilizza.
      NOTA: Le microsiringhe Hamilton di precisione vengono utilizzate per l'iniezione attraverso la porta di caricamento nel tappo. Utilizzare una siringa per farmaco per evitare la contaminazione incrociata. Fare clic su F4 per registrarsi e segnare nel registro dell'ossigeno quando viene aggiunto un trattamento.
      NOTA: I substrati vengono preparati in acqua ultrapura e conservati a -20 °C per 3 mesi.
    6. Tritate aggiungendo 1 μL di digitonina 10 mM in fasi successive fino a quando il consumo di ossigeno raggiunge un livello massimo.
      NOTA: Un lavaggio accurato con acqua, etanolo al 70% ed etanolo al 100% è essenziale se la stessa camera viene utilizzata per due esperimenti nello stesso giorno.
      NOTA: Digitonin viene preparato in acqua ultrapura e conservato a -20 °C per 3 mesi.
  4. Protocollo di valutazione respiratoria di routine per spermatozoi intatti e permeabilizzati (complesso I o complesso II)
    1. Aprire la camera e aspirare il fluido all'interno.
    2. Caricare nella camera almeno 24 x 10 6 e non più di 70 x 106 spermatozoi in un volume finale di 2 mL di BWW (analisi delle cellule intatte) o MRM (analisi delle cellule permeabilizzate).
    3. Iniziare l'esperimento con le stesse impostazioni della calibrazione (questo è descritto al punto 2.3.3).
    4. Caricare la calibrazione eseguita al punto 2.2 come descritto al punto 2.3.4.
    5. Registrare la respirazione delle cellule per almeno 5 minuti fino a quando non si ottiene un segnale stabile. Questa misurazione corrisponde alla respirazione basale nelle cellule intatte.
    6. Se l'esperimento è con cellule intatte, procedere al passaggio 2.4.9. Per le cellule permeabilizzate, iniettare 4,5 μL di digitonina 10 mM (concentrazione finale: 22,5 μM). Permeabilizzare le cellule per 5 min.
    7. Aggiungere i substrati: 10 μL di glutammato 2 M e 2,5 μL di malato 0,4 M (concentrazioni finali: 10 mM e 0,5 mM, rispettivamente) per il complesso I o 20 μL di succinato 1 M (concentrazione finale: 10 mM) per il complesso II. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non aumenta e si stabilizza. Questo è lo stato 4, che significa respirazione supportata dal complesso basale I o dal complesso basale II in assenza di ADP.
      NOTA: I substrati vengono preparati in acqua ultrapura e conservati a -20 °C per 3 mesi.
    8. Iniettare 5 μL di ADP 0,5 M (concentrazione finale: 1,25 mM). Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non aumenta e si stabilizza. L'aggiunta di ADP aumenta il segnale corrispondente al massimo consumo di ossigeno attraverso il complesso I o il complesso II (stato 3, nelle cellule permeabilizzate).
    9. Aggiungere 1 μL di oligomicina 4 mg/mL (concentrazione finale: 2 μg/mL), un inibitore dell'ATP sintetasi. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale diminuisce e si stabilizza.
      NOTA: L'oligomicina viene preparata in etanolo e conservata a -20 °C per 3 mesi.
    10. Titolare aggiungendo 1 μL di 0,1 mM a 1 mM di cianuro di carbonile-P-trifluorometossi-fenilidrazone (FCCP) in fasi successive fino a raggiungere una frequenza respiratoria massima disaccoppiata. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non aumenta e si stabilizza.
      NOTA: FCCP viene preparato in etanolo e conservato a -20 °C per 3 mesi.
    11. La concentrazione finale di FCCP dipende dal campione. Interrompere l'iniezione del farmaco quando il consumo di ossigeno inizia a diminuire.
    12. Infine, iniettare 1 μL di antimicina A 5 mM (concentrazione finale di 2,5 μM). Si tratta di un inibitore del complesso III per discriminare tra il consumo di ossigeno mitocondriale e quello residuo (respirazione non mitocondriale). Per l'analisi del complesso I, aggiungere 1 μL di rotenone 1 mM (concentrazione finale 0,5 μM), un inibitore di questo complesso, invece di AA. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale diminuisce e si stabilizza.
      NOTA: I farmaci sono preparati in etanolo e conservati a -20 °C per 3 mesi.

3. Estrazione e analisi dei dati

Figure 2
Figura 2: Acquisizione di parametri respiratori da un esperimento di respirometria ad alta risoluzione. (A,B) Rappresentazioni schematiche di grafici ottenuti, come descritto in Figura 1, rispettivamente per cellule intatte e permeabilizzate. Questi parametri sono stati descritti in precedenza15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Trascinare il mouse premendo il tasto sinistro del mouse e il tasto Maiusc per selezionare le regioni in cui il flusso di ossigeno per volume correlato (Y2 O2 slope uncorr., linea rossa) è stabile dopo l'iniezione di un substrato o di un inibitore. La figura 2 mostra i diversi parametri ottenuti dal registro precedentemente descritto15.
    NOTA: I parametri dipendono dall'esperimento; tutti sono i seguenti: respirazione basale in cellule intatte e respirazione in presenza di glutammato/malato o succinato (stato 4), ADP (stato 3), oligomicina (perdita di protoni), FCCP (frequenza respiratoria massima), rotenone/AA (respirazione non mitocondriale). Nelle cellule permeabilizzate, la respirazione basale corrisponde allo stato 3.
  2. Fare clic sulle finestre Indicatori > statistiche ed esportare i dati.
  3. Normalizza i dati ottenuti per 1 milione di spermatozoi. Le unità dei pendii sono pmolO2·s−1·mL−1·10−6 cellule.
  4. Sottrarre il consumo di ossigeno non mitocondriale da tutti i valori prima di calcolare gli indici.
  5. Calcolare gli indici utilizzando le varie equazioni precedentemente descritte15:
    Equation 1

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Representative Results

Determinazione della concentrazione ottimale di digitonina negli spermatozoi
In questo protocollo, presentiamo l'uso dell'HRR per monitorare in tempo reale i cambiamenti in OXPHOS negli spermatozoi umani. Poiché il metodo può essere utilizzato per analizzare spermatozoi intatti o permeabilizzati alle digitonine, presentiamo innanzitutto la standardizzazione della concentrazione di digitonina necessaria per permeabilizzare gli spermatozoi (Figura 3).

La digitonina viene utilizzata per la permeabilizzazione chimica, che consente ai substrati di entrare nelle cellule, e per misurare l'attività mitocondriale. Questo composto deve essere titolato in cellule intatte per ottenere la concentrazione ottimale necessaria per garantire la permeabilizzazione della membrana cellulare senza compromettere l'integrità della membrana mitocondriale. Abbiamo eseguito una titolazione in presenza di ADP, glutammato e malato. I tassi di respirazione sono stati misurati al basale e dopo l'aggiunta graduale di digitonina (Figura 3A). Il consumo di ossigeno aumenta con l'aumentare della concentrazione di detergente e raggiunge un punto in cui l'integrità della membrana mitocondriale esterna inizia ad essere compromessa (freccia rossa nella Figura 3A). La Figura 3B mostra l'errore medio ± standard di 4 esperimenti rappresentativi. Il risultato mostra che la permeabilizzazione è ottimale a una concentrazione di digitonina di 22,5 μM (Figura 3A,B). L'attività mitocondriale diminuisce quando vengono utilizzate quantità troppo elevate di digitonina.

Rappresentazione del registro riuscito e non ottimale della respirazione degli spermatozoi mediante HRR
Durante il monitoraggio della respirazione mitocondriale degli spermatozoi, il registro può essere visualizzato come concentrazione di O 2 (linea blu) e flusso di O2 per volume correlato (linea rossa) calcolati con il software di analisi DatLab 4 sia in cellule permeabilizzate che non permeabilizzate (Figura 4). La Figura 4 mostra le curve rappresentative di spermatozoi intatti (Figura 4A,B) e permeabilizzati alle digitonina (Figura 4C,D) provenienti da un campione di sperma. La Figura 4A rappresenta una registrazione riuscita di spermatozoi intatti da un campione di sperma, dove si osservano gli effetti dei farmaci che modulano il consumo di ossigeno, ed è possibile estrarre i parametri per il calcolo degli indici. La respirazione basale è registrata nelle cellule intatte dal consumo di ossigeno in presenza di substrati esogeni. Quindi, la frequenza respiratoria non fosforilante è stata misurata aggiungendo un inibitore dell'ATP sintasi (oligomicina). Successivamente, il protonoforo FCCP è stato iniettato a diverse concentrazioni ed è stata determinata la massima frequenza respiratoria disaccoppiata mitocondriale. Questo farmaco porta ad un aumento della permeabilità protonica della membrana interna, che consente al movimento passivo dei protoni di dissipare il gradiente chemiosmotico che provoca un aumento del consumo di ossigeno. Infine, è stato aggiunto AA per inibire la respirazione mitocondriale.

La qualità dei dati ottenuti è strettamente correlata al numero di celle. È importante avere un elevato consumo basale di ossigeno per ottenere un buon record. L'analisi successiva dipende da sottili cambiamenti nel consumo di O2 che potrebbero non essere rilevati se la linea basale non è sufficientemente alta. Un numero di cellule inferiore a quello raccomandato potrebbe portare a un risultato come quello della Figura 4B.

Le curve rappresentative ottenute utilizzando il protocollo per substrati specifici complessi I o II sono mostrate rispettivamente nella Figura 4C e nella Figura 4D. Per studiare il consumo di ossigeno attraverso il complesso mitocondriale I o il complesso II, i substrati malato e glutammato o succinato sono stati aggiunti dopo la permeabilizzazione delle cellule. Quindi, l'ADP viene aggiunto per la conversione in ATP (stato 3, respirazione dipendente dal complesso attivo I o II). Infine, il rotenone o l'AA vengono somministrati per inibire rispettivamente il complesso I o II.

Per l'interpretazione dei risultati, è importante considerare che la respirazione cellulare inibita dall'oligomicina è una misura diretta del tasso di perdita di protoni attraverso la membrana mitocondriale nelle cellule intatte, che è paragonabile allo stato 4 delle cellule permeabilizzate (senza ADP) (Figura 2B). Nel caso di cellule intatte (non permeabilizzate), questa quantità indica la frazione di consumo basale di ossigeno mitocondriale indipendente dalla sintesi di ATP. La frequenza respiratoria massima viene raggiunta dopo l'aggiunta di diverse dosi di FCCP. Nelle cellule intatte dipende da due fattori; l'attività dei complessi di trasporto degli elettroni e il numero di mitocondri in ogni cellula. Lo stato 3 delle cellule permeabilizzate dopo l'aggiunta di ADP assomiglia alla respirazione basale della cellula intatta a concentrazioni saturanti di substrati esogeni (Figura 2B)7. La tabella 2 mostra un esempio degli indici calcolati a partire dai dati della figura 4.

Figure 3
Figura 3: Determinazione della concentrazione ottimale di digitonina per la permeabilizzazione degli spermatozoi umani. Le frequenze respiratorie sono state misurate a 37 °C in terreno MRM con glutammato, malato e adenosina difosfato. (A) Traccia respiratoria rappresentativa. La linea blu è la concentrazione di O 2 e la linea rossa rappresenta il flusso di O2 per volume correlato. (B) La frequenza respiratoria dei mitocondri significa ± errore standard, n = 4. La freccia rossa rappresenta la concentrazione ottimale. Abbreviazione: dig = digitonina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Tracce respiratorie rappresentative per il tasso di consumo di ossigeno ottenute utilizzando lo strumento Oroboros. Le frequenze respiratorie sono state misurate a 37 °C in cellule (A,B) intatte e (C,D) permeabilizzate. La linea blu è la concentrazione di O 2 e la linea rossa rappresenta il flusso di O2 per volume correlato. I tassi in A, C e D sono stati misurati con più di 30 x 10 6 spermatozoi, mentre il tasso in B è stato misurato con 14 x 10 6 spermatozoi. Abbreviazioni: Oligo = oligomicina; FCCP = cianuro di carbonile -p-trifluorometossifenilidrazone; Glu/Mal = glutammato/malato; ADP = adenosina difosfato; AA = antimicina A; Marciume = rotenone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione dei terreni BWW e MRM per esperimenti con cellule intatte o permeabilizzate, rispettivamente. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Esempi rappresentativi di indici HRR. I dati sono stati ottenuti dalle tracce mostrate nella Figura 4. Gli indici sono stati calcolati in base alla Figura 2 e alla sezione 3 del protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

L'HRR dipende in modo critico da diverse fasi: (a) la manutenzione dell'apparecchiatura, (b) la calibrazione accurata dei sensori di ossigeno, (c) la titolazione del disaccoppiatore26 e, infine, (d) l'uso adeguato degli indici che rappresentano la funzione mitocondriale. La manutenzione dell'attrezzatura è fondamentale. Si raccomanda di sostituire regolarmente le membrane del sensore polarografico di ossigeno e di correggere lo sfondo strumentale. Un lavaggio estensivo dopo il prelievo degli spermatozoi dalle camere è essenziale per ottenere buone repliche, soprattutto nei laboratori in cui gli strumenti sono frequentemente utilizzati per analizzare vari tessuti o cellule. Gli spermatozoi sono sensibili anche a piccole quantità di rotenone, AA, oligomicina e FCCP, quindi la fase di lavaggio deve essere eseguita con attenzione (almeno tre volte con etanolo e altre tre volte con acqua distillata). La calibrazione è un passaggio cruciale; Deve essere eseguito ogni giorno e per ciascuno dei supporti utilizzati (vedere il protocollo Step 2.2). Le titolazioni di disaccoppiamento devono essere eseguite con attenzione, in quanto devono essere utilizzate le concentrazioni ottimali di disaccoppiatore per ottenere la massima stimolazione del flusso ed evitare un'eccessiva titolazione, che paradossalmente inibisce la respirazione27. La concentrazione ottimale del disaccoppiatore dipende dal tipo di cellula, dalla concentrazione cellulare e dal mezzo ed è diversa per le cellule permeabilizzate rispetto alle cellule intatte14. Pertanto, nel caso di campioni di spermatozoi, in cui gli spermatozoi possono essere eterogenei, il disaccoppiatore deve essere adattato a ciascun campione28,29,30. Dopo la respirometria si ottengono diversi parametri che devono essere corretti per il numero di cellule prima dell'analisi. Vengono calcolati tre indici che consentono l'interpretazione della funzione mitocondriale, e questi hanno il vantaggio di essere indipendenti dal numero di mitocondri e cellule. Evidenziamo l'uso del rapporto di controllo respiratorio (RCR), che indica l'efficienza dell'accoppiamento mitocondriale ed è sensibile a più potenziali siti di disfunzione7. Tuttavia, a seconda dell'esperimento, possono essere utilizzati altri parametri e indici31.

I limiti dell'HRR sono i seguenti: (a) il dispositivo non è automatizzato, quindi richiede la presenza costante di un operatore e richiede molto tempo; b) il dispositivo HRR ha solo due camere e possono essere eseguiti solo due saggi contemporaneamente; c) le camere non sono monouso e possono essere contaminate da inibitori o da un altro tipo di tessuto; (d) sebbene la sensibilità dello strumento sia molto elevata, il nostro team ha scoperto che sono necessari almeno 12 milioni/mL di spermatozoi per rilevare le variazioni nel consumo di ossigeno, quindi non abbiamo potuto misurare gli spermatozoi di maschi oligozoospermici; e (e) l'operatore deve essere consapevole che le misurazioni si riferiscono a tutte le cellule presenti nei campioni. I campioni di sperma sono eterogenei e contengono altri tipi di cellule (ad es. leucociti). Per evitare la contaminazione, è necessario utilizzare campioni con basse concentrazioni di leucociti7. In alternativa, è possibile eseguire un'ulteriore fase di purificazione degli spermatozoi prima degli esperimenti con l'ossimetro (ad esempio, swim-up o swim-down)24.

Un'alternativa all'HRR è l'uso dell'analizzatore di flusso extracellulare. I vantaggi dell'analizzatore di flusso extracellulare rispetto all'ossigrafo ad alta risoluzione per la misurazione del metabolismo degli spermatozoi sono i seguenti: (a) l'analizzatore di flusso extracellulare è uno strumento ampiamente automatizzato; b) è in grado di misurare il consumo di ossigeno in piastre da 24 e 96 pozzetti per lo screening ad alto rendimento, il che significa che richiede quantità minori di campioni biologici; e (c) consente la misurazione aggiuntiva del flusso glicolitico degli spermatozoi. Alcuni vantaggi dell'HRR rispetto all'analizzatore di flusso extracellulare sono i seguenti: (a) con l'HRR, il costo dello strumento e dei materiali di consumo è inferiore; (b) con HRR, non sono necessarie da tre a quattro repliche di ciascuna misurazione, come nell'analizzatore di flusso extracellulare, per il quale queste repliche sono necessarie per affrontare l'elevata variabilità della fluorescenza; (c) la fattibilità dei protocolli di titolazione degli inibitori del disaccoppiatore del substrato con HRR è elevata; e (c) le cellule sono monitorate in movimento e non attaccate. L'ossimetria è in grado di analizzare il consumo di ossigeno di spermatozoi mobili (vivi) e intatti (non permeabilizzati) 7,31,32. Questo è un vantaggio nel caso degli spermatozoi, poiché l'adesione degli spermatozoi alla superficie plastica può potenzialmente alterare i loro schemi di movimento e la loro funzione.

L'HRR è più sensibile della respirometria convenzionale ed è adatta per l'uso medico negli spermatozoi umani, per i quali il numero di cellule di ciascun campione di sperma non può essere aumentato (come le cellule in coltura). Questa tecnica può essere utilizzata per monitorare la respirazione degli spermatozoi dalla maggior parte dei campioni di sperma, sia di uomini normali che infertili. L'RCR può essere utilizzato come un buon indicatore dello stato funzionale degli spermatozoi umani e un valore di cut-off di 3,15 (sensibilità e specificità rispettivamente del 73% e del 61%) distingue tra campioni di sperma con spermiogramma convenzionale normale e anormale32. L'HRR potrebbe essere utilizzato per comprendere il metabolismo mitocondriale degli spermatozoi, che può essere responsabile dell'infertilità maschile, ed essere un complemento allo spermiogramma standard.

L'ultima nuova generazione di strumenti Oroboro consente l'analisi del consumo di ossigeno in combinazione con altre funzioni degli spermatozoi, come la produzione di H 2 O2, e potrebbe aiutare a comprendere la funzione degli spermatozoi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo la clinica di Andrologia Fertilab, in particolare José María Montes e Andrea Torrents, per averci permesso di accedere ai donatori. Finanziamento: A.C. è sostenuto da borse di studio dell'Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Ulteriori finanziamenti sono stati ottenuti dal Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. e R.S. sono sostenuti dall'Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 e FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. è supportato da POS_FMV_2018_1_1007814 e CAP-UDELAR 2020. Le figure sono state illustrate utilizzando Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

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References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
  3. Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
  4. Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
  5. Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
  6. Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
  7. Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
  8. Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
  9. Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
  10. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
  11. Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
  12. Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
  13. Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
  14. Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
  17. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  18. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  19. Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
  20. Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
  21. Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
  22. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
  23. Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
  24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
  25. Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
  26. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
  27. Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
  28. Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
  29. Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
  30. Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
  31. Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
  32. Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).

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Respirometria ad alta risoluzione funzione mitocondriale spermatozoi umani qualità dello sperma analisi dello sperma infertilità maschile attività mitocondriale degli spermatozoi consumo di ossigeno sistema a camera chiusa qualità degli spermatozoi mitocondri degli spermatozoi spermatozoi intatti spermatozoi permeabilizzati complessi della catena respiratoria strumento ossigrafo ad alta risoluzione concentrazione di ossigeno tassi di consumo di ossigeno indici respiratori

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale negli spermatozoi umani
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Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

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