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Respirométrie à haute résolution pour évaluer la fonction mitochondriale chez les spermatozoïdes humains

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

L’analyse de la fonction mitochondriale des spermatozoïdes par respirométrie à haute résolution permet de mesurer la consommation d’oxygène des spermatozoïdes se déplaçant librement dans un système à chambre fermée. La technique peut être appliquée pour mesurer la respiration dans les spermatozoïdes humains, ce qui fournit des informations sur les caractéristiques et l’intégrité mitochondriales des spermatozoïdes.

Abstract

La qualité du sperme est souvent étudiée par une analyse de routine du sperme, qui est descriptive et souvent peu concluante. L’infertilité masculine est associée à une altération de l’activité mitochondriale des spermatozoïdes, de sorte que la mesure de la fonction mitochondriale des spermatozoïdes est un indicateur de la qualité du sperme. La respirométrie à haute résolution est une méthode de mesure de la consommation d’oxygène des cellules ou des tissus dans un système à chambre fermée. Cette technique peut être mise en œuvre pour mesurer la respiration dans les spermatozoïdes humains et fournit des informations sur la qualité et l’intégrité des mitochondries des spermatozoïdes. La respirométrie à haute résolution permet aux cellules de se déplacer librement, ce qui est un avantage a priori dans le cas des spermatozoïdes. Cette technique peut être appliquée avec des spermatozoïdes intacts ou perméabilisés et permet d’étudier la fonction mitochondriale intacte des spermatozoïdes et l’activité des complexes de chaînes respiratoires individuels. L’instrument oxygraphe haute résolution utilise des capteurs pour mesurer la concentration d’oxygène couplés à un logiciel sensible pour calculer la consommation d’oxygène. Les données sont utilisées pour calculer les indices respiratoires en fonction des ratios de consommation d’oxygène. Par conséquent, les indices sont les proportions de deux taux de consommation d’oxygène et sont normalisés en interne au nombre de cellules ou à la masse protéique. Les indices respiratoires sont un indicateur de la fonction et du dysfonctionnement des mitochondries des spermatozoïdes.

Introduction

On estime que l’infertilité masculine représente 40 à 50 % de tous les cas d’infertilité chez les couples1. L’analyse conventionnelle du sperme joue un rôle crucial dans la détermination de la fertilité masculine ; Cependant, environ 15 % des hommes infertiles ont des paramètres de sperme normaux2. De plus, l’analyse de routine du sperme fournit des informations limitées sur la fonction des spermatozoïdes et ne reflète pas les défauts subtils des spermatozoïdes3.

Les mitochondries des spermatozoïdes ont une structure particulière, car elles sont disposées comme une gaine hélicoïdale autour des flagelles. La gaine mitochondriale contient un nombre variable de mitochondries reliées par des liants intermitochondriaux et ancrées au cytosquelette par des arrangements protéiques ordonnés sur la membrane mitochondriale externe 4,5. Cette structure rend particulièrement difficile l’isolement des mitochondries des spermatozoïdes. Par conséquent, la plupart des études sur la fonction mitochondriale des spermatozoïdes utilisent des analyses in situ ou des spermatozoïdes démembranés6.

La structure et la fonction mitochondriales des spermatozoïdes ont été systématiquement liées à l’infertilité masculine 7,8,9,10,11, ce qui suggère que l’analyse de la structure et de la fonction de ces organites peut être un bon candidat pour l’inclusion dans l’analyse du sperme.

Les mitochondries jouent un rôle important dans le métabolisme énergétique cellulaire, notamment en utilisant l’oxygène pour produire de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS). Chez les spermatozoïdes, en particulier, la source de l’ATP (glycolyse vs. OXPHOS) est contestée, et une grande partie des données reste controversée et dépend de différentes approches expérimentales 4,12,13. Les mesures de la respiration par oxymétrie offrent des informations significatives sur la capacité respiratoire mitochondriale, l’intégrité mitochondriale et le métabolisme énergétique de la cellule14,15,16. Traditionnellement, cette technique a été réalisée à l’aide de l’électrode à oxygène de Clark, un instrument utilisé pour mesurer la respiration mitochondriale depuis plus de 50 ans17,18. De plus, la consommation d’oxygène mitochondrial des spermatozoïdes a été analysée à l’aide de l’électrode à oxygène Clark classique 19,20,21. La respirométrie à haute résolution (HRR) à l’aide d’oxygraphes (Oroboros) offre une sensibilité plus élevée que l’utilisation d’appareils de respirométrie classiques22. Les oxygraphes sont composés de deux chambres avec orifices d’injection, et chaque chambre dispose d’un capteur d’oxygène polarographique. Avec cette technique, il est possible d’analyser des lames de tissus, des cellules et des suspensions mitochondriales isolées. L’échantillon est agité en continu dans la chambre, et pendant l’expérience, la consommation d’oxygène est mesurée et les taux d’oxygène sont calculés à l’aide d’un logiciel spécifique. Les chambres présentent une réduction des fuites d’oxygène, ce qui constitue un avantage par rapport aux électrodes d’oxygène conventionnelles14,23.

Comme pour les autres cellules, dans le cas des spermatozoïdes, la sensibilité de l’équipement HRR est plus élevée que celle de la respirométrie conventionnelle, ce qui signifie que l’équipement HRR peut être utilisé pour l’analyse d’un nombre limité de spermatozoïdes intacts ou perméabilisés. Il existe deux stratégies principales pour évaluer la fonction mitochondriale des spermatozoïdes par HRR : (a) mesurer la consommation d’oxygène dans les cellules intactes, ce qui implique de reproduire la fonction respiratoire dans un milieu contenant des substrats tels que le glucose, ou (b) mesurer la consommation d’oxygène dans les cellules perméabilisées à l’aide de l’un des complexes OXPHOS, avec l’ajout de substrats spécifiques pour surveiller chaque fonction séparément.

Dans la présente étude, nous décrivons l’utilisation de la HRR pour déterminer la respiration mitochondriale dans les spermatozoïdes humains.

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Protocol

Les expériences ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Faculté de médecine de l’Université de la République de Montevideo, en Uruguay.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail pour la respirométrie à haute résolution afin d’évaluer la fonction mitochondriale dans les spermatozoïdes humains intacts et perméabilisés. Le protocole a été divisé en quatre étapes différentes : 1) la préparation de l’échantillon, 2) l’étalonnage de l’oxygène dans l’instrument Oroboros, 3) la mesure de la consommation d’oxygène pour les cellules intactes et perméabilisées, et 4) l’extraction des données de l’équipement et l’analyse. Abréviations : CASA = analyse de sperme assistée par ordinateur ; BWW = Biggers Whitten Whittingham moyen ; MRM = milieu respiratoire mitochondrial ; ADP = adénosine diphosphate ; FCCP = cyanure de carbonyle -p- trifluorométhoxyphénylhydrazone ; AA = antimycine A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

REMARQUE : Le flux de travail pour mesurer la consommation d’oxygène dans les spermatozoïdes à l’aide de la HRR est illustré à la figure 1. Des informations sur les matériaux, l’équipement et les réactifs utilisés dans le protocole sont présentées dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de l’échantillon

  1. Prélèvement d’échantillons
    1. Recueillir le sperme humain fraîchement éjaculé par masturbation après une abstinence recommandée de 3 jours dans un récipient en plastique stérile. Transportez immédiatement les échantillons au laboratoire.
    2. Incuber les échantillons pendant 30 à 60 minutes à température ambiante (RT) pour qu’ils se liquéfient complètement24.
    3. Après liquéfaction, conserver les échantillons à 37 °C jusqu’au début de l’expérience.
  2. Évaluation des spermatozoïdes avec analyse assistée par ordinateur (CASA)
    1. Mélangez l’échantillon et chargez 7 μL dans une chambre de comptage des spermatozoïdes préchauffée.
    2. Placez la chambre sur la platine préchauffée (37 °C) d’un microscope à lumière directe.
    3. Ouvrez le logiciel informatisé d’analyse des spermatozoïdes et entrez dans le module de motilité et de concentration (cliquez sur Mot).
    4. Sélectionnez la configuration qui correspond aux conditions du sperme humain.
      REMARQUE : La configuration doit être adaptée au type et à la profondeur de la chambre ainsi qu’à l’espèce d’échantillon et au système CASA.
    5. Analysez au hasard 10 champs différents par chambre en cliquant sur le bouton Analyser .
    6. Cliquez sur Résultats pour obtenir la concentration et la motilité de l’échantillon.
  3. Préparation des cellules
    REMARQUE : Si le HRR n’est pas calibré, commencez par les étapes 2.1-2.2 avant de préparer les cellules (étape 1.3). Il est important de mesurer la consommation d’oxygène immédiatement lorsque les spermatozoïdes sont remis en suspension dans le milieu.
    1. Centrifuger les échantillons à 400 x g pendant 10 min à RT.
    2. Retirer le plasma séminal et remettre les spermatozoïdes en suspension dans 2 mL de Biggers Whitten Whittingham (BWW) pour des expériences avec des cellules intactes ou un milieu respiratoire mitochondrial (MRM) pour des études avec des cellules perméabilisées. Les compositions des médias sont présentées dans le tableau 1.
    3. Répétez les étapes décrites à l’étape 1.2 pour les études de concentration de spermatozoïdes.

2. Respirométrie à haute résolution : analyse OXPHOS

REMARQUE : HRR intègre des oxygraphes très sensibles (Oxygraph-2 K ; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Autriche) avec logiciel (DatLab, version 4.2 ; Oroboros Instruments GmbH). Les données expérimentales sont affichées sous forme de concentration d’oxygène en fonction du temps (en pmol de O2/106 cellules·min−1) et sous forme de transformations en temps réel de ces données, ce qui permet à l’expérimentateur de suivre la respiration (consommation d’oxygène, flux d’oxygène) d’échantillons biologiques et biochimiques pendant que l’expérience est toujours en cours. La HRR peut être utilisée pour suivre la respiration des cellules vivantes et mobiles, ce qui est particulièrement utile pour les spermatozoïdes, dont la motilité est associée à la qualité des spermatozoïdes et au potentiel de fertilité. Le laboratoire utilise un HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, avec deux chambres. Les étapes décrites dans ce protocole doivent être effectuées indépendamment pour les deux chambres de 2 mL.

  1. Préparation de l’équipement
    1. Allumez le HRR et connectez-le au logiciel de respirométrie (DatLab) pour l’acquisition et l’analyse des données.
    2. Remplacez l’éthanol à 70 % dans la chambre de l’oxygraphe par du ddH2O. Remuez-le continuellement avec la barre d’agitation magnétique dans la chambre à 750 tr/min. Laisser reposer pendant 10 min, puis aspirer le H2O doublement distillé (dd).
    3. Lavez la chambre trois fois avec du ddH2O pendant 5 min à chaque fois.
      REMARQUE : Cette étape est nécessaire pour retirer l’éthanol restant des chambres. Les spermatozoïdes sont très sensibles à l’éthanol. L’enregistrement pourrait être compromis si cette étape est omise.
  2. Calibrage des capteurs d’oxygène
    REMARQUE : La procédure d’étalonnage varie légèrement en fonction de l’instrument. Effectuez un étalonnage de l’air du capteur d’oxygène polarographique tel que décrit par le fabricant25. Dans cette section, le protocole d’étalonnage est brièvement expliqué.
    1. Retirez le ddH 2 O et pipetez2mL du même milieu que celui utilisé pour la préparation des cellules dans la chambre. Placez les bouchons en laissant une bulle d’échange d’air.
      REMARQUE : Il est important de connaître le volume de la chambre pour déterminer le volume exact de fluide nécessaire.
    2. Enregistrez les valeurs d’étalonnage de l’oxygène (cliquez sur Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) pour surveiller les performances de la membrane du capteur en agitant le fluide avec la barre d’agitation à 750 tr/min pendant au moins 30 min à 37 °C. Utilisez les autres réglages mentionnés : gain pour le capteur : 2 ; tension de polarisation : 800 mV ; Intervalle d’enregistrement des données : 2,0 s.
      NOTA : On s’attend à obtenir une pente de O 2 non corrigée (ligne rouge) à moins de ±2 pmol∙s−1∙mL−1 avec un signal stable du capteur polarographique.
    3. Faites glisser la souris tout en maintenant le bouton gauche de la souris et la touche Maj enfoncés pour sélectionner une zone où le changement de concentration en oxygène (Concentration Y1 O2, ligne bleue) est stable.
    4. Ouvrez la fenêtre O2 Calibration (cliquez sur Oxygraph > O2 Calibration). Dans Étalonnage de l’air, remplacez le repère sélectionné par la région sélectionnée à l’étape 2.2.3. Terminez en cliquant sur Calibrer et Copier dans le presse-papiers.
    5. Arrêtez l’enregistrement et enregistrez en cliquant sur Oxygraph > Ok Control > Enregistrer et déconnecter.
      REMARQUE : Ce jeu de données doit être enregistré afin de pouvoir être utilisé dans toutes les expériences de la journée. L’étalonnage n’est effectué qu’une fois par jour pour chaque milieu.
  3. Titrage par perméabilisation à la digitonine
    1. Ouvrez la chambre et aspirez le milieu à l’intérieur.
    2. Charger dans la chambre au moins 24 x 10 6 et pas plus de 70 x 106 spermatozoïdes dans un volume final de 2 mL de MRM.
      REMARQUE : Il est important de mesurer le nombre de cellules dans la chambre afin d’ajuster la consommation d’oxygène à la fin de l’expérience. Un nombre de cellules inférieur à celui recommandé ne peut pas être mesuré.
    3. Fermez la chambre en poussant les bouchons à fond et aspirez le liquide restant par le haut. Commencer l’expérience avec les mêmes réglages que pour l’étalonnage : vitesse d’agitation : 750 tr/min ; température : 37 °C ; gain pour le capteur : 2 ; tension de polarisation : 800 mV ; et intervalle d’enregistrement des données : 2,0 s.
    4. Pour charger l’étalonnage, double-cliquez sur la case Pos Calib dans le coin inférieur. Ouvrez l’étalonnage effectué à l’étape 2.2 (cliquez sur Oxygraph > O2 Calibration > Copier à partir d’un fichier), puis cliquez sur Calibrer et Copier dans le presse-papiers.
      REMARQUE : La boîte POS Calib passera du jaune au vert. Les données sont affichées dans des graphiques de débit d’oxygène corrigé par volume (Schéma 05 Flux par volume non corrigé). Différentes mises en page sont disponibles dans Oxygraph > Layout.
    5. Ajouter 5 μL d’adénosine diphosphate (ADP) à 0,5 M, 10 μL de glutamate à 2 M et 2,5 μL de malate à 0,4 M (concentrations finales : 1,25 mM, 10 mM et 0,5 mM). Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal se stabilise.
      REMARQUE : Les micro-seringues Hamilton de précision sont utilisées pour l’injection à travers l’orifice de chargement dans le bouchon. Utilisez une seringue par médicament pour éviter la contamination croisée. Cliquez sur F4 pour vous inscrire, et marquez dans le registre de l’oxygène lorsqu’un traitement est ajouté.
      REMARQUE : Les substrats sont préparés dans de l’eau ultra-pure et stockés à −20 °C pendant 3 mois.
    6. Tritate en ajoutant 1 μL de digitonine de 10 mM par étapes successives jusqu’à ce que la consommation d’oxygène atteigne un niveau maximal.
      REMARQUE : Un lavage minutieux avec de l’eau, de l’éthanol à 70 % et de l’éthanol à 100 % est essentiel si la même chambre est utilisée pour deux expériences le même jour.
      REMARQUE : La digatonine est préparée dans de l’eau ultra-pure et stockée à −20 °C pendant 3 mois.
  4. Protocole d’évaluation respiratoire de routine pour les spermatozoïdes intacts et perméabilisés (complexe I ou complexe II)
    1. Ouvrez la chambre et aspirez le milieu à l’intérieur.
    2. Charger dans la chambre au moins 24 x 10 6 et pas plus de 70 x 106 spermatozoïdes dans un volume final de 2 mL de BWW (analyse de cellules intactes) ou MRM (analyse de cellules perméabilisées).
    3. Démarrez l’expérience avec les mêmes paramètres que pour l’étalonnage (ceci est décrit à l’étape 2.3.3).
    4. Chargez l’étalonnage effectué à l’étape 2.2 comme décrit à l’étape 2.3.4.
    5. Enregistrez la respiration des cellules pendant au moins 5 min jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Cette mesure correspond à la respiration basale dans les cellules intactes.
    6. Si l’expérience porte sur des cellules intactes, passez à l’étape 2.4.9. Pour les cellules perméabilisées, injecter 4,5 μL de digitonine 10 mM (concentration finale : 22,5 μM). Perméabiliser les cellules pendant 5 min.
    7. Ajouter les substrats : 10 μL de glutamate 2 M et 2,5 μL de malate 0,4 M (concentrations finales : 10 mM et 0,5 mM, respectivement) pour le complexe I ou 20 μL de succinate 1 M (concentration finale : 10 mM) pour le complexe II. Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal augmente et se stabilise. Il s’agit de l’état 4, ce qui signifie que la respiration du complexe basal I ou du complexe basal II est soutenue en l’absence d’ADP.
      REMARQUE : Les substrats sont préparés dans de l’eau ultra-pure et stockés à −20 °C pendant 3 mois.
    8. Injecter 5 μL d’ADP 0,5 M (concentration finale : 1,25 mM). Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal augmente et se stabilise. L’ajout d’ADP augmente le signal correspondant à la consommation maximale d’oxygène à travers le complexe I ou le complexe II (état 3, dans les cellules perméabilisées).
    9. Ajouter 1 μL d’oligomycine à 4 mg/mL (concentration finale : 2 μg/mL), un inhibiteur de l’ATP synthétase. Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal diminue et se stabilise.
      REMARQUE : L’oligomycine est préparée dans de l’éthanol et stockée à −20 °C pendant 3 mois.
    10. Titrer en ajoutant 1 μL de 0,1 mM à 1 mM de cyanure de carbonyle-P-trifluorométhoxy-phénylhydrazone (FCCP) par étapes successives jusqu’à ce qu’une fréquence respiratoire maximale non couplée soit atteinte. Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal augmente et se stabilise.
      REMARQUE : Le FCCP est préparé dans de l’éthanol et stocké à −20 °C pendant 3 mois.
    11. La concentration finale de FCCP dépend de l’échantillon. Arrêtez d’injecter le médicament lorsque la consommation d’oxygène commence à diminuer.
    12. Enfin, injecter 1 μL d’antimycine A à 5 mM (concentration finale de 2,5 μM). Il s’agit d’un inhibiteur du complexe III pour discriminer entre la consommation mitochondriale et la consommation résiduelle d’oxygène (respiration non mitochondriale). Pour l’analyse du complexe I, ajouter 1 μL de roténone 1 mM (concentration finale de 0,5 μM), un inhibiteur de ce complexe, à la place de AA. Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal diminue et se stabilise.
      REMARQUE : Les médicaments sont préparés dans de l’éthanol et conservés à −20 °C pendant 3 mois.

3. Extraction et analyse des données

Figure 2
Figure 2 : Acquisition des paramètres respiratoires à partir d’une expérience de respirométrie à haute résolution. (A,B) Représentations schématiques des graphiques obtenus, tels que décrits à la figure 1, pour les cellules intactes et perméabilisées, respectivement. Ces paramètres ont déjà été décrits15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Faites glisser la souris en appuyant sur le bouton gauche de la souris et la touche majuscule pour sélectionner les régions où le flux d’oxygène par volume corrélé (Y2 O2 pente uncorr., ligne rouge) est stable après l’injection d’un substrat ou d’un inhibiteur. La figure 2 montre les différents paramètres obtenus à partir du registre décrit précédemment15.
    REMARQUE : Les paramètres dépendent de l’expérience ; tous sont les suivants : respiration basale dans les cellules intactes et respiration en présence de glutamate/malate ou de succinate (état 4), ADP (état 3), oligomycine (fuite de protons), FCCP (fréquence respiratoire maximale), roténone/AA (respiration non mitochondriale). Dans les cellules perméabilisées, la respiration basale correspond à l’état 3.
  2. Cliquez sur les fenêtres Repères > Statistiques et exportez les données.
  3. Normaliser les données obtenues pour 1 million de spermatozoïdes. Les unités des pentes sont pmolO2·s−1·mL−1·10−6 cellules.
  4. Soustrayez la consommation d’oxygène non mitochondrial de toutes les valeurs avant de calculer les indices.
  5. Calculer les indices à l’aide des différentes équations décrites ci-dessus15 :
    Equation 1

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Representative Results

Détermination de la concentration optimale de digitonine dans les spermatozoïdes
Dans ce protocole, nous présentons l’utilisation de la HRR pour surveiller en temps réel les changements d’OXPHOS dans les spermatozoïdes humains. Étant donné que la méthode peut être utilisée pour analyser des spermatozoïdes intacts ou perméabilisés à la digitonine, nous présentons d’abord la standardisation de la concentration de digitonine nécessaire pour perméabiliser les spermatozoïdes (Figure 3).

La digitonine est utilisée pour la perméabilisation chimique, qui permet aux substrats de pénétrer dans les cellules, et pour mesurer l’activité mitochondriale. Ce composé doit être titré dans des cellules intactes pour obtenir la concentration optimale requise pour assurer la perméabilisation de la membrane cellulaire sans compromettre l’intégrité de la membrane mitochondriale. Nous avons effectué un titrage en présence d’ADP, de glutamate et de malate. Les fréquences respiratoires ont été mesurées au départ et après l’ajout progressif de digitonine (Figure 3A). La consommation d’oxygène augmente avec l’augmentation de la concentration de détergent et atteint un point où l’intégrité de la membrane mitochondriale externe commence à être compromise (flèche rouge sur la figure 3A). La figure 3B montre la moyenne ± l’erreur-type de 4 expériences représentatives. Le résultat montre que la perméabilisation est optimale à une concentration de digitonine de 22,5 μM (Figure 3A,B). L’activité mitochondriale diminue lorsque des quantités trop élevées de digitonine sont utilisées.

Représentation du registre réussi et sous-optimal de la respiration des spermatozoïdes par HRR
Lors de la surveillance de la respiration mitochondriale des spermatozoïdes, le registre peut être visualisé sous forme de corrélation entre la concentration d’O 2 (ligne bleue) et le débit d’O2 par volume (ligne rouge) calculés avec le logiciel d’analyse DatLab 4 dans les cellules perméabilisées et non perméabilisées (Figure 4). La figure 4 montre des courbes représentatives de spermatozoïdes intacts (figure 4A,B) et perméabilisés à la digitonine (figure 4C,D) à partir d’un échantillon de sperme. La figure 4A représente un enregistrement réussi de spermatozoïdes intacts à partir d’un échantillon de sperme, où les effets des médicaments modulant la consommation d’oxygène sont observés, et il est possible d’extraire les paramètres de calcul des indices. La respiration basale est enregistrée dans les cellules intactes par la consommation d’oxygène en présence de substrats exogènes. Ensuite, la fréquence respiratoire non phosphorylante a été mesurée par l’ajout d’un inhibiteur de l’ATP synthase (oligomycine). Par la suite, le protonophore FCCP a été injecté à différentes concentrations et la fréquence respiratoire mitochondriale maximale non couplée a été déterminée. Ce médicament entraîne une augmentation de la perméabilité des protons de la membrane interne, ce qui permet au mouvement passif des protons de dissiper le gradient chimiosmotique qui provoque une augmentation de la consommation d’oxygène. Enfin, de l’AA a été ajouté pour inhiber la respiration mitochondriale.

La qualité des données obtenues est étroitement liée au numéro de cellule. Il est important d’avoir une consommation basale d’oxygène élevée pour obtenir un bon enregistrement. L’analyse subséquente dépend de changements subtils dans la consommation d’O2 qui peuvent ne pas être détectés si la ligne basale n’est pas assez élevée. Un nombre de cellules inférieur à celui recommandé peut conduire à un résultat comme celui de la figure 4B.

Les courbes représentatives obtenues à l’aide du protocole pour des substrats complexes I ou II spécifiques sont présentées à la figure 4C et à la figure 4D, respectivement. Pour étudier la consommation d’oxygène à travers le complexe mitochondrial I ou le complexe II, les substrats malate et glutamate ou succinate ont été ajoutés après perméabilisation des cellules. Ensuite, l’ADP est ajouté pour la conversion en ATP (état 3, respiration dépendante du complexe actif I ou II). Enfin, la roténone ou l’AA est administrée pour inhiber le complexe I ou II, respectivement.

Pour l’interprétation des résultats, il est important de considérer que la respiration cellulaire inhibée par l’oligomycine est une mesure directe du taux de fuite de protons à travers la membrane mitochondriale dans les cellules intactes, ce qui est comparable à l’état 4 des cellules perméabilisées (sans ADP) (Figure 2B). Dans le cas des cellules intactes (non perméabilisées), cette quantité indique la fraction de la consommation basale d’oxygène mitochondrial qui est indépendante de la synthèse de l’ATP. La fréquence respiratoire maximale est atteinte après l’ajout de plusieurs doses de FCCP. Dans les cellules intactes, cela dépend de deux facteurs ; l’activité des complexes de transport d’électrons et le nombre de mitochondries dans chaque cellule. L’état 3 des cellules perméabilisées après l’ajout d’ADP ressemble à la respiration basale de la cellule intacte à des concentrations saturées de substrats exogènes (Figure 2B)7. Le tableau 2 donne un exemple d’indices calculés à partir des enregistrements de la figure 4.

Figure 3
Figure 3 : Détermination de la concentration optimale de digitonine pour la perméabilisation des spermatozoïdes humains. Les fréquences respiratoires ont été mesurées à 37 °C dans un milieu MRM avec du glutamate, du malate et de l’adénosine diphosphate. (A) Tracé respiratoire représentatif. La ligne bleue représente la concentration d’O2 et la ligne rouge représente le débitd’O2 par volume corrélé. (B) La fréquence respiratoire des mitochondries signifie ± l’erreur-type, n = 4. La flèche rouge représente la concentration optimale. Abréviation : dig = digitonin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Traces respiratoires représentatives du taux de consommation d’oxygène obtenues à l’aide de l’instrument Oroboros. Les taux respiratoires ont été mesurés à 37 °C dans les cellules (A,B) intactes et (C,D) perméabilisées. La ligne bleue représente la concentration d’O2 et la ligne rouge représente le débitd’O2 par volume corrélé. Les taux en A, C et D ont été mesurés avec plus de 30 x 10 6 spermatozoïdes, tandis que le taux en B a été mesuré avec 14 x 106 spermatozoïdes. Abréviations : Oligo = oligomycine ; FCCP = cyanure de carbonyle -p- trifluorométhoxyphénylhydrazone ; Glu/Mal = glutamate/malate ; ADP = adénosine diphosphate ; AA = antimycine A ; Pourriture = roténone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition des milieux BWW et MRM pour les expériences avec des cellules intactes ou perméabilisées, respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Exemples représentatifs d’indices de HRR. Les données ont été obtenues à partir des traces présentées à la figure 4. Les indices ont été calculés conformément à la figure 2 et à la section 3 du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

La HRR dépend de plusieurs étapes : (a) l’entretien de l’équipement, (b) l’étalonnage précis des capteurs d’oxygène, (c) le titrage du découpleur26, et enfin, (d) l’utilisation adéquate d’indices représentant la fonction mitochondriale. L’entretien de l’équipement est crucial. Il est recommandé de remplacer régulièrement les membranes du capteur d’oxygène polarographique et de corriger le fond instrumental. Un lavage approfondi après le prélèvement des spermatozoïdes dans les chambres est essentiel pour obtenir de bonnes répétitions, en particulier dans les laboratoires où les instruments sont fréquemment utilisés pour analyser divers tissus ou cellules. Les spermatozoïdes sont sensibles même à de petites quantités de roténone, d’AA, d’oligomycine et de FCCP, de sorte que l’étape de lavage doit être effectuée avec soin (au moins trois fois avec de l’éthanol et trois autres fois avec de l’eau distillée). L’étalonnage est une étape cruciale ; Elle doit être réalisée tous les jours et pour chacun des supports utilisés (voir étape 2.2 du protocole). Les titrages du découpleur doivent être effectués avec soin, car les concentrations optimales du découpleur doivent être utilisées pour obtenir la stimulation maximale du flux et éviter le surtitrage, qui inhibe paradoxalement la respiration27. La concentration optimale du découpleur dépend du type de cellule, de la concentration cellulaire et du milieu et est différente pour les cellules perméabilisées par rapport aux cellules intactes14. Ainsi, dans le cas d’échantillons de spermatozoïdes, dans lesquels les spermatozoïdes peuvent être hétérogènes, le découpleur doit être adapté à chaque échantillon28,29,30. Après la respirométrie, plusieurs paramètres sont obtenus qui doivent être corrigés en fonction du nombre de cellules avant l’analyse. Trois indices sont calculés qui permettent d’interpréter la fonction mitochondriale, et ceux-ci ont l’avantage d’être indépendants du nombre de mitochondries et de cellules. Nous soulignons l’utilisation du rapport de contrôle respiratoire (RCR), qui indique l’efficacité du couplage mitochondrial et est sensible à de multiples sites potentiels de dysfonctionnement7. Cependant, d’autres paramètres et indices peuvent être utilisés en fonction de l’expérience31.

Les limites de la HRR sont les suivantes : (a) l’appareil n’est pas automatisé, il nécessite donc la présence constante d’un opérateur et prend du temps ; b) le dispositif HRR n’a que deux chambres et seuls deux essais peuvent être effectués simultanément ; c) les chambres ne sont pas à usage unique et peuvent être contaminées par des inhibiteurs ou un autre type de tissu ; (d) bien que la sensibilité de l’instrument soit très élevée, notre équipe a constaté qu’au moins 12 millions/ml de spermatozoïdes sont nécessaires pour détecter les variations de consommation d’oxygène, de sorte que nous n’avons pas pu mesurer les spermatozoïdes d’hommes oligozoospermiques ; e) l’exploitant doit savoir que les mesures concernent toutes les cellules présentes dans les échantillons. Les échantillons de sperme sont hétérogènes et contiennent d’autres types de cellules (par exemple, des leucocytes). Pour éviter la contamination, il est nécessaire d’utiliser des échantillons à faible concentration de leucocytes7. Alternativement, une étape supplémentaire de purification des spermatozoïdes peut être effectuée avant les expériences de l’oxymètre (par exemple, nager vers le haut ou vers le bas)24.

Une alternative à la HRR est l’utilisation de l’analyseur de flux extracellulaire. Les avantages de l’analyseur de flux extracellulaire par rapport à l’oxygraphe à haute résolution pour la mesure du métabolisme des spermatozoïdes sont les suivants : (a) l’analyseur de flux extracellulaire est un instrument largement automatisé ; b) il peut mesurer la consommation d’oxygène dans des plaques à 24 puits et à 96 puits pour un criblage à haut débit, ce qui signifie qu’il nécessite de plus petites quantités d’échantillons biologiques ; et (c) il permet la mesure supplémentaire du flux glycolytique des spermatozoïdes. Certains avantages de la HRR par rapport à l’analyseur de flux extracellulaire sont les suivants : (a) avec la HRR, le coût de l’instrument et des consommables est inférieur ; (b) avec la HRR, il n’est pas nécessaire d’effectuer trois à quatre répétitions de chaque mesure, comme c’est le cas dans le cas de l’analyseur de flux extracellulaire, pour lequel ces répétitions sont nécessaires pour tenir compte de la grande variabilité de la fluorescence ; c) la faisabilité des protocoles de titrage des inhibiteurs de découplage du substrat avec HRR est élevée ; et (c) les cellules sont surveillées en mouvement et non attachées. L’oxymétrie permet d’analyser la consommation d’oxygène des spermatozoïdes mobiles (vivants) et intacts (non perméabilisés) 7,31,32. Il s’agit d’un avantage dans le cas des spermatozoïdes, car l’adhésion des spermatozoïdes à la surface en plastique peut potentiellement modifier leurs schémas de mouvement et leur fonction.

La HRR est plus sensible que la respirométrie conventionnelle et convient à un usage médical dans les spermatozoïdes humains, pour lesquels le nombre de cellules de chaque échantillon de sperme ne peut pas être augmenté (comme les cellules en culture). Cette technique peut être utilisée pour surveiller la respiration des spermatozoïdes de la plupart des échantillons de sperme, à la fois d’hommes normaux et infertiles. Le RCR peut être utilisé comme un bon indicateur de l’état fonctionnel des spermatozoïdes humains, et une valeur seuil de 3,15 (sensibilité et spécificité de 73 % et 61 %, respectivement) fait la distinction entre les échantillons de sperme avec une analyse de sperme conventionnelle normale et anormale32. La HRR pourrait être utilisée pour comprendre le métabolisme mitochondrial des spermatozoïdes, qui peut être responsable de l’infertilité masculine, et être un complément à l’analyse standard du sperme.

La dernière génération d’instruments Oroboro permet d’analyser la consommation d’oxygène en conjonction avec d’autres fonctions des spermatozoïdes, telles que la production de H 2 O2, et pourrait aider à comprendre la fonction des spermatozoïdes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier la clinique d’andrologie Fertilab, en particulier José María Montes et Andrea Torrents, de nous avoir permis d’avoir accès à des donneurs. Financement : A.C. est soutenu par des subventions de l’Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Un financement supplémentaire a été obtenu du Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. et R.S. sont soutenus par l’Universidad de la República (I+D, CSIC 2014 ; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 et FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. est soutenu par POS_FMV_2018_1_1007814 et CAP-UDELAR 2020. Les figures ont été illustrées à l’aide de Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

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References

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Respirométrie à haute résolution Fonction mitochondriale Spermatozoïdes humains Qualité du sperme Analyse des spermatozoïdes Infertilité masculine Activité mitochondriale des spermatozoïdes Consommation d’oxygène Système à chambre fermée Qualité du sperme Mitochondries de spermatozoïdes Spermatozoïdes intacts Spermatozoïdes perméabilisés Complexes de chaînes respiratoires Instrument d’oxygraphie à haute résolution Concentration en oxygène Taux de consommation d’oxygène Indices respiratoires

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Respirométrie à haute résolution pour évaluer la fonction mitochondriale chez les spermatozoïdes humains
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Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

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