Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרעונים אנושיים

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

ניתוח תפקוד המיטוכונדריה של הזרע על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשר למדוד את צריכת החמצן של זרעונים הנעים בחופשיות במערכת תא סגור. ניתן ליישם את הטכניקה למדידת נשימה בזרעונים אנושיים, המספקת מידע על מאפייני המיטוכונדריה של הזרע ושלמותו.

Abstract

איכות הזרע נלמדת לעתים קרובות על ידי ניתוח זרע שגרתי, שהוא תיאורי ולעתים קרובות לא חד משמעי. אי פוריות הגבר קשורה לשינוי בפעילות המיטוכונדריה של הזרע, ולכן מדידת תפקוד המיטוכונדריה של הזרע היא אינדיקטור לאיכות הזרע. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה היא שיטה למדידת צריכת החמצן של תאים או רקמות במערכת תא סגור. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי למדוד נשימה בזרע אנושי ומספקת מידע על האיכות והשלמות של מיטוכונדריית הזרע. ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשרת לתאים לנוע בחופשיות, וזה יתרון מראש במקרה של זרע. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת עם זרעונים שלמים או חדירים, ומאפשרת ללמוד את תפקוד המיטוכונדריה של זרע שלם ואת הפעילות של מתחמי שרשרת נשימה בודדים. מכשיר האוקסיגרף ברזולוציה גבוהה משתמש בחיישנים כדי למדוד את ריכוז החמצן יחד עם תוכנה רגישה כדי לחשב את צריכת החמצן. הנתונים משמשים לחישוב מדדי נשימה המבוססים על יחסי צריכת החמצן. כתוצאה מכך, המדדים הם הפרופורציות של שני שיעורי צריכת חמצן והם מנורמלים פנימית למספר התא או מסת החלבון. מדדי הנשימה הם אינדיקטור לתפקוד מיטוכונדריאלי זרע ולתפקוד לקוי.

Introduction

על פי הערכות, אי פוריות הגבר מהווה 40%-50% מכלל מקרי אי הפוריות בזוגות1. ניתוח זרע קונבנציונלי ממלא תפקיד מכריע בקביעת פוריות הגבר; עם זאת, לכ -15% מהגברים העקרים יש פרמטרים זרע תקינים2. בנוסף, ניתוח זרע שגרתי מספק מידע מוגבל על תפקוד הזרע ואינו משקף פגמים עדיניםבזרע 3.

למיטוכונדריה של זרע יש מבנה מיוחד, מכיוון שהם מסודרים כנדן סלילי סביב השוטון. מעטפת המיטוכונדריה מכילה מספר משתנה של מיטוכונדריה המחוברים על ידי מקשרים אינטרמיטוכונדריאליים ומעוגנים לשלד הציטוכונדריאלי על ידי סידורי חלבון מסודרים על קרום המיטוכונדריההחיצוני 4,5. מבנה זה מקשה במיוחד על בידוד מיטוכונדריית זרע. לכן, רוב המחקרים על תפקוד מיטוכונדריאלי של זרע משתמשים באנליזות ממוקדות או זרע דממברני6.

המבנה והתפקוד של המיטוכונדריה של הזרע נקשרו באופן עקבי לאי פוריות הגבר 7,8,9,10,11, דבר המצביע על כך שניתוח המבנה והתפקוד של אברונים אלה עשוי להיות מועמד טוב להכללה בניתוח זרע.

מיטוכונדריה ממלאים תפקיד חשוב במטבוליזם של אנרגיה תאית, במיוחד על-ידי שימוש בחמצן לייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני (OXPHOS). בזרעונים, בפרט, המקור של ATP (גליקוליזה לעומת OXPHOS) שנוי במחלוקת, וחלק גדול מהנתונים נותר שנוי במחלוקת ותלוי בגישות ניסיוניות שונות 4,12,13. מדידות של נשימה על ידי אוקסימטריה מציעות תובנות משמעותיות לגבי קיבולת הנשימה של המיטוכונדריה, שלמות המיטוכונדריה ומטבוליזם האנרגיה של התא14,15,16. באופן מסורתי, טכניקה זו בוצעה באמצעות אלקטרודת חמצן קלארק - מכשיר המשמש למדידת נשימה מיטוכונדריאלית במשך יותר מ -50 שנה17,18. בנוסף, צריכת החמצן במיטוכונדריה של הזרע נותחה באמצעות אלקטרודת החמצן הקלאסית Clark 19,20,21. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (HRR) באמצעות אוקסיגרפים (Oroboros) מספקת רגישות גבוהה יותר מאשר שימוש במכשירי רספירומטריה קלאסיים22. האוקסיגרפים מורכבים משני תאים עם יציאות הזרקה, ולכל תא יש חיישן חמצן פולרוגרפי. בעזרת טכניקה זו ניתן לנתח שקופיות רקמות, תאים ותרחיפים מיטוכונדריאליים מבודדים. הדגימה מעורבבת ללא הרף בתא, ובמהלך הניסוי נמדדת צריכת החמצן, ושיעורי החמצן מחושבים באמצעות תוכנה ספציפית. התאים מראים דליפת חמצן מופחתת, המהווה יתרון על פני מכשירי אלקטרודות חמצן קונבנציונליים 14,23.

כמו בתאים אחרים, במקרה של זרעונים, הרגישות של ציוד HRR גבוהה יותר מאשר עבור רספירומטריה קונבנציונלית, כלומר ציוד HRR יכול לשמש לניתוח של מספר מוגבל של תאי זרע שלמים או חדירים. ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות להערכת תפקוד מיטוכונדריית הזרע על ידי HRR: (א) מדידת צריכת החמצן בתאים שלמים, הכוללת שכפול תפקוד הנשימה בתווך המכיל מצעים כגון גלוקוז, או (ב) מדידת צריכת החמצן בתאים חדירתיים באמצעות אחד ממתחמי OXPHOS, עם תוספת מצעים ספציפיים לניטור כל פונקציה בנפרד.

במחקר הנוכחי אנו מתארים את השימוש ב-HRR כדי לקבוע נשימה מיטוכונדריאלית בתאי זרע אנושיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של Facultad de Medicina de la Universidad de la República, מונטווידאו, אורוגוואי.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה עבור רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרע אנושי שלם וחדיר. הפרוטוקול חולק לארבעה שלבים שונים: 1) הכנת הדגימה, 2) כיול חמצן במכשיר האורובורוס, 3) מדידת צריכת חמצן לתאים שלמים וחדירים, 4) הפקת נתונים מהציוד וניתוח. קיצורים: CASA = ניתוח זרע בעזרת מחשב; BWW = Biggers Whitten Whittingham בינוני; MRM = מדיום נשימה מיטוכונדריאלי; ADP = אדנוזין דיפוספט; FCCP = קרבוניל ציאניד -p- trifluoromethoxyphenylhydrazone; AA = אנטימיצין A. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: זרימת העבודה למדידת צריכת החמצן בתאי זרע באמצעות HRR מוצגת באיור 1. מידע על החומרים, הציוד והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול מוצג בטבלת החומרים.

1. הכנת מדגם

  1. אוסף דוגמאות
    1. אסוף זרע אנושי שנפלט טרי על ידי אוננות לאחר התנזרות מומלצת של 3 ימים במיכל פלסטיק סטרילי. להעביר את הדגימות מיד למעבדה.
    2. לדגור על הדגימות במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לנזול לחלוטין24.
    3. לאחר הנזלה, לאחסן את הדגימות ב 37 ° C עד תחילת הניסוי.
  2. הערכת זרע באמצעות ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA)
    1. ערבבו את הדגימה והעמיסו 7 μL לתוך תא ספירת זרע שחומם מראש.
    2. הניחו את התא על שלב שחומם מראש (37°C) של מיקרוסקופ אור ישיר.
    3. פתח את תוכנת ניתוח הזרע הממוחשבת והזן את מודול התנועתיות והריכוז (לחץ על Mot).
    4. בחר את התצורה המתאימה לתנאי זרע אנושיים.
      הערה: יש להתאים את התצורה לסוג ולעומק התא, כמו גם למיני הדגימה ולמערכת CASA.
    5. נתח באופן אקראי 10 שדות שונים לכל תא על ידי לחיצה על כפתור ניתוח .
    6. לחץ על תוצאות כדי לקבל את ריכוז הדגימה ואת תנועתיותה.
  3. הכנת תאים
    הערה: אם HRR אינו מכויל, התחל בשלבים 2.1-2.2 לפני הכנת התאים (שלב 1.3). חשוב למדוד את צריכת החמצן מיד כאשר תאי הזרע מושהים מחדש בתווך.
    1. צנטריפוגה את הדגימות ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב RT.
    2. הסר את פלסמת הזרע, והשהה מחדש את הזרעונים ב -2 מ"ל של Biggers Whitten Whittingham (BWW) לניסויים עם תאים שלמים או מדיום נשימה מיטוכונדריאלי (MRM) למחקרים עם תאים חדירים. הרכבי המדיה מוצגים בטבלה 1.
    3. חזור על השלבים המתוארים בשלב 1.2 עבור מחקרי ריכוז זרע.

2. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה: ניתוח OXPHOS

הערה: HRR משלב אוקסיגרפים רגישים מאוד (אוקסיגרף 2 K; Oroboros Instruments GmbH, אינסברוק, אוסטריה) עם תוכנה (DatLab, גרסה 4.2; Oroboros מכשירים GmbH). נתוני הניסוי מוצגים כריכוז חמצן לעומת זמן (כ-pmol של O2/106 תאים·min−1) וכטרנספורמציות בזמן אמת של נתונים אלה, המאפשרים לנסיין לעקוב אחר הנשימה (צריכת חמצן, שטף חמצן) של דגימות ביולוגיות וביוכימיות בזמן שהניסוי עדיין פועל. HRR יכול לשמש כדי לעקוב אחר הנשימה של תאים חיים תנועתיים, אשר שימושי במיוחד עבור זרע, אשר תנועתיות קשורה באיכות הזרע ואת פוטנציאל הפוריות. המעבדה משתמשת HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, עם שני תאים. השלבים המתוארים בפרוטוקול זה חייבים להתבצע באופן עצמאי עבור שני תאים 2 מ"ל.

  1. הכנת ציוד
    1. הפעל את HRR וחבר אותו לתוכנת הספירומטריה (DatLab) לצורך איסוף וניתוח נתונים.
    2. החלף את האתנול 70% בתא האוקסיגרף ב- ddH2O. ערבב אותו ברציפות עם פס הערבוב המגנטי בתא במהירות 750 סל"ד. תן לו לעמוד במשך 10 דקות, ולשאוף את זיקוק כפול (dd) H2O לאחר מכן.
    3. שטפו את התא שלוש פעמים עם ddH2O במשך 5 דקות בכל פעם.
      הערה: שלב זה נחוץ כדי להסיר את האתנול שנותר מן החדרים. תאי זרע רגישים מאוד לאתנול. ההקלטה עלולה להיפגע אם שלב זה יושמט.
  2. כיול חיישני החמצן
    הערה: הליך הכיול משתנה מעט בהתאם למכשיר. בצע כיול אוויר של חיישן החמצן הפולרוגרפי כמתואר על-ידי היצרן25. בחלק זה, פרוטוקול הכיול מוסבר בקצרה.
    1. הסר את ddH 2 O, פיפטה2מ"ל של אותו מדיום המשמש להכנת התא לתוך התא. מניחים את הפקקים, ומשאירים בועת חילופי אוויר.
      הערה: חשוב לדעת את נפח התא כדי לקבוע את הנפח המדויק של המדיום הדרוש.
    2. רשום את ערכי כיול החמצן (לחץ על פריסה > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) כדי לפקח על ביצועי קרום החיישן על ידי ערבוב המדיום עם מוט הערבוב ב-750 סל"ד למשך 30 דקות לפחות ב-37°C. השתמש בהגדרות האחרות כאמור: רווח לחיישן: 2; מתח קיטוב: 800 mV; מרווח הקלטת נתונים: 2.0 שניות.
      הערה: הוא צפוי לקבל שיפוע O 2 לא מתוקן (קו אדום) בתוך ±2 pmol∙s−1∙mL−1 עם אות יציב מהחיישן הפולרוגרפי.
    3. גרור את העכבר תוך לחיצה ממושכת על לחצן העכבר השמאלי ועל מקש Shift כדי לבחור אזור שבו השינוי בריכוז החמצן (ריכוז O2 Y1, קו כחול) יציב.
    4. פתח את חלון כיול O2 (לחץ על Oxygraph > O2 Calibration). בכיול אוויר, שנה את הסימון שנבחר לאזור שנבחר בשלב 2.2.3. סיים על ידי לחיצה על כיול והעתק ללוח.
    5. עצור את ההקלטה ושמור על ידי לחיצה על Oxygraph > Ok Control > Save and Disconnect.
      הערה: יש לשמור מערך נתונים זה כדי שניתן יהיה להשתמש בו בכל הניסויים של היום. הכיול מתבצע רק פעם ביום עבור כל מדיום.
  3. טיטרציה Digitonin-permeabilization
    1. פתחו את החדר, ושאפו את המדיום שבתוכו.
    2. עומס בתא לפחות 24 x 106 ולא יותר מ 70 x 106 תאי זרע בנפח סופי של 2 מ"ל של MRM.
      הערה: חשוב למדוד את מספר התאים בתא על מנת להתאים את צריכת החמצן בסוף הניסוי. לא ניתן למדוד מספר תאים נמוך מהמומלץ.
    3. סגרו את התא על ידי דחיפת הפקקים כל הדרך פנימה, ושאפו את הנוזל שנותר בחלק העליון. התחל את הניסוי עם אותן הגדרות כמו עבור הכיול: מהירות ערבוב: 750 סל"ד; טמפרטורה: 37 °C; רווח לחיישן: 2; מתח קיטוב: 800 mV; ומרווח רישום נתונים: 2.0 שניות.
    4. כדי לטעון את הכיול, לחץ פעמיים על התיבה Pos Calib בפינה התחתונה. פתח את הכיול שבוצע בשלב 2.2 (לחץ על Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File) ולחץ על Calibrate and Copy to Clipboard.
      הערה: תיבת הקופה Calib תשתנה מצהוב לירוק. הנתונים מוצגים בתרשימי זרימת חמצן מתוקנת לפי נפח (פריסה 05 שטף לכל נפח לא תוקנה). פריסות שונות זמינות ב - Oxygraph > Layout.
    5. הוסף 5 μL של 0.5 M אדנוזין דיפוספט (ADP), 10 μL של 2 M גלוטמט, ו 2.5 μL של 0.4 M malate (ריכוזים סופיים: 1.25 mM, 10 mM, ו 0.5 mM). מדוד את צריכת החמצן עד שהאות מתייצב.
      הערה: מזרקי מיקרו Precision Hamilton משמשים להזרקה דרך יציאת הטעינה בפקק. השתמש מזרק אחד לכל תרופה כדי למנוע זיהום צולב. לחץ על F4 כדי להירשם, וסמן באוגר החמצן כאשר מתווסף טיפול.
      הערה: המצעים מוכנים במים טהורים במיוחד ומאוחסנים ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
    6. Tritate על ידי הוספת 1 μL של 10 mM digitonin בשלבים עוקבים עד צריכת החמצן מגיע לרמה מקסימלית.
      הערה: שטיפה יסודית במים, 70% אתנול ו-100% אתנול חיונית אם אותו תא משמש לשני ניסויים באותו יום.
      הערה: דיגיטונין מוכן במים טהורים במיוחד ומאוחסן ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
  4. פרוטוקול הערכה נשימתי שגרתי לתאי זרע שלמים וחדירים, (קומפלקס I או קומפלקס II)
    1. פתחו את החדר, ושאפו את המדיום שבתוכו.
    2. עומס בתא לפחות 24 x 106 ולא יותר מ 70 x 106 תאי זרע בנפח סופי של 2 מ"ל של BWW (ניתוח תאים שלמים) או MRM (ניתוח תאים חדירים).
    3. התחל את הניסוי עם אותן הגדרות כמו עבור הכיול (זה מתואר בשלב 2.3.3).
    4. טען את הכיול שבוצע בשלב 2.2 כמתואר בשלב 2.3.4.
    5. רשום את הנשימה של התאים לפחות 5 דקות עד לקבלת אות יציב. מדידה זו מתאימה לנשימה בסיסית בתאים שלמים.
    6. אם הניסוי הוא עם תאים שלמים, המשך לשלב 2.4.9. עבור תאים חדירים, להזריק 4.5 μL של 10 mM digitonin (ריכוז סופי: 22.5 μM). חדיר את התאים במשך 5 דקות.
    7. הוסף את המצע: 10 μL של 2 M גלוטמט ו- 2.5 μL של 0.4 M malate (ריכוזים סופיים: 10 mM ו- 0.5 mM, בהתאמה) עבור קומפלקס I או 20 μL של 1 M succinate (ריכוז סופי: 10 mM) עבור קומפלקס II. מדוד את צריכת החמצן עד שהאות גדל ומתייצב. זהו מצב 4, כלומר קומפלקס בסיסי I או קומפלקס בסיסי II נתמך נשימה בהיעדר ADP.
      הערה: המצעים מוכנים במים טהורים במיוחד ומאוחסנים ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
    8. יש להזריק 5 μL של 0.5 M ADP (ריכוז סופי: 1.25 mM). מדוד את צריכת החמצן עד שהאות גדל ומתייצב. תוספת של ADP מגדילה את האות המתאים לצריכת החמצן המרבית באמצעות קומפלקס I או קומפלקס II (מצב 3, בתאים חדירים).
    9. הוסף 1 μL של 4 מ"ג / מ"ל אוליגומיצין (ריכוז סופי: 2 מיקרוגרם / מ"ל), מעכב סינטטאז ATP. מדדו את צריכת החמצן עד שהאות פוחת ומתייצב.
      הערה: אוליגומיצין מוכן אתנול ומאוחסן ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
    10. טיטראט על ידי הוספת 1 μL של 0.1 mM ל 1 mM קרבוניל ציאניד-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone (FCCP) בשלבים עוקבים עד לקצב נשימה בלתי מצומד מרבי. מדוד את צריכת החמצן עד שהאות גדל ומתייצב.
      הערה: FCCP מוכן אתנול ומאוחסן ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
    11. הריכוז הסופי של FCCP הוא תלוי דגימה. להפסיק להזריק את התרופה כאשר צריכת החמצן מתחילה לרדת.
    12. לבסוף, להזריק 1 μL של 5 mM antimycin A (ריכוז סופי 2.5 μM). זהו מעכב III מורכב כדי להבחין בין צריכת החמצן המיטוכונדריאלית לבין צריכת החמצן השיורית (נשימה שאינה מיטוכונדריאלית). לניתוח של קומפלקס I, להוסיף 1 μL של 1 mM rotenone (ריכוז סופי 0.5 μM), מעכב של קומפלקס זה, במקום AA. מדדו את צריכת החמצן עד שהאות פוחת ומתייצב.
      הערה: התרופות מוכנות באתנול ומאוחסנות ב -20 ° C במשך 3 חודשים.

3. חילוץ וניתוח נתונים

Figure 2
איור 2: רכישת פרמטרים נשימתיים מניסוי רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. (A,B) ייצוגים סכמטיים של גרפים שהתקבלו, כמתואר באיור 1, עבור תאים שלמים וחדירים, בהתאמה. פרמטרים אלה תוארו בעבר15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. גרור את העכבר על-ידי לחיצה על לחצן העכבר השמאלי ועל מקש Shift כדי לבחור אזורים שבהם שטף החמצן לכל נפח מתואם (Y2 O2 שיפוע uncorr., קו אדום) יציב לאחר הזרקת מצע או מעכב. איור 2 מציג את הפרמטרים השונים שהתקבלו מהאוגר שתואר קודם לכן15.
    הערה: הפרמטרים תלויים בניסוי; כולם כדלקמן: נשימה בסיסית בתאים שלמים ונשימה בנוכחות גלוטמט/מלאט או סוקצינאט (מצב 4), ADP (מצב 3), אוליגומיצין (דליפת פרוטון), FCCP (קצב נשימה מרבי), רוטנון/AA (נשימה לא מיטוכונדריאלית). בתאים חדירים, נשימה בסיסית מתאימה למצב 3.
  2. לחץ על החלונות Marks > Statistics וייצא את הנתונים.
  3. לנרמל את הנתונים המתקבלים לכל מיליון תאי זרע. יחידות המדרונות הן pmolO2·s−1·mL−1·10−6 תאים.
  4. הפחיתו את צריכת החמצן הלא מיטוכונדריאלית מכל הערכים לפני חישוב המדדים.
  5. חישוב המדדים באמצעות המשוואות השונות שתוארו לעיל15:
    Equation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קביעת ריכוז אופטימלי של דיגיטונין בתאי זרע
בפרוטוקול זה, אנו מציגים את השימוש ב-HRR כדי לנטר שינויים בזמן אמת ב-OXPHOS בתאי זרע אנושיים. מאחר שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח זרע שלם או חדור דיגיטונין, אנו מציגים תחילה את הסטנדרטיזציה של ריכוז הדיגיטונין הנדרש כדי לחלחל תאי זרע (איור 3).

דיגיטונין משמש לחדירה כימית, המאפשרת למצעים להיכנס לתאים, ולמדידת פעילות מיטוכונדריאלית. תרכובת זו חייבת לעבור טיטרציה בתאים שלמים כדי להשיג את הריכוז האופטימלי הדרוש כדי להבטיח חדירות של קרום התא מבלי לפגוע בשלמות קרום המיטוכונדריה. ביצענו טיטרציה בנוכחות ADP, גלוטמט ומלאט. קצב הנשימה נמדד בתחילת המחקר ולאחר ההוספה ההדרגתית של דיגיטונין (איור 3A). צריכת החמצן עולה ככל שריכוז חומרי הניקוי עולה ומגיע לנקודה שבה שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית מתחילה להיפגע (חץ אדום באיור 3A). איור 3B מראה את שגיאת התקן הממוצעת ± של 4 ניסויים מייצגים. התוצאה מראה שחדירות היא אופטימלית בריכוז דיגיטונין של 22.5 מיקרומטר (איור 3A,B). פעילות המיטוכונדריה פוחתת כאשר משתמשים בכמויות גבוהות מדי של דיגיטונין.

ייצוג רישום מוצלח ולא אופטימלי של נשימת זרע על ידי HRR
במהלך ניטור הנשימה המיטוכונדריאלית של הזרע, ניתן לדמיין את האוגר כריכוז O 2 (קו כחול) וזרימת O2 לכל נפח מתואם (קו אדום) המחושב באמצעות תוכנת הניתוח DatLab 4 הן בתאים חדירתיים והן בתאים שאינם חדירים. איור 4 מראה עקומות מייצגות של תאי זרע שלמים (איור 4A,B) ותאי זרע חדירים לדיגיטונין (איור 4C,D) מדגימת זרע. איור 4A מייצג רישום מוצלח של תאי זרע שלמים מדגימת זרע, שם נצפות ההשפעות של תרופות המווסתות את צריכת החמצן, וניתן לחלץ את הפרמטרים לחישוב המדדים. נשימה בסיסית נרשמת בתאים שלמים על ידי צריכת חמצן בנוכחות מצעים אקסוגניים. לאחר מכן, קצב הנשימה הלא-זרחני נמדד על ידי הוספת מעכב ATP סינתאז (אוליגומיצין). לאחר מכן, הפרוטונופור FCCP הוזרק בריכוזים שונים ונקבע קצב הנשימה המיטוכונדריאלי הבלתי מצומד המקסימלי. תרופה זו מובילה לעלייה בחדירות הפרוטונים של הממברנה הפנימית, המאפשרת תנועה פסיבית של פרוטונים כדי לפזר את השיפוע הכימוסמוטי שגורם לעלייה בצריכת החמצן. לבסוף, AA נוסף כדי לעכב נשימה מיטוכונדריאלית.

איכות הנתונים המתקבלים קשורה קשר הדוק למספר התא. חשוב להיות בעל צריכת חמצן בסיסית גבוהה כדי להשיג שיא טוב. הניתוח הבא תלוי בשינויים עדינים בצריכת O2 שעשויים שלא להתגלות אם הקו הבסיסי אינו גבוה מספיק. ספירת תאים נמוכה מהמומלץ יכולה להוביל לתוצאה כמו איור 4B.

עקומות מייצגות שהתקבלו באמצעות פרוטוקול עבור מצעים ספציפיים מורכבים I או II מוצגות באיור 4C ובאיור 4D, בהתאמה. כדי לחקור את צריכת החמצן דרך קומפלקס מיטוכונדריאלי I או קומפלקס II, הסובסטרטים מלאט וגלוטמט או סוקצינאט נוספו לאחר חדירה של התאים. לאחר מכן, ADP מתווסף להמרה ל- ATP (מצב 3, נשימה תלויה בקומפלקס פעיל I או II). לבסוף, רוטנון או AA ניתנים כדי לעכב קומפלקס I או II, בהתאמה.

לצורך פענוח התוצאות, חשוב לקחת בחשבון שנשימה תאית המעוכבת על-ידי אוליגומיצין היא מדידה ישירה של קצב דליפת פרוטונים דרך הממברנה המיטוכונדריאלית בתאים שלמים, אשר דומה למצב 4 של תאים חדירתיים (ללא ADP) (איור 2B). במקרה של תאים שלמים (שאינם חדירים), כמות זו מציינת את החלק של צריכת החמצן המיטוכונדריאלית הבסיסית שאינה תלויה בסינתזה של ATP. קצב הנשימה המרבי מושג לאחר תוספת של מספר מנות של FCCP. בתאים שלמים תלוי בשני גורמים; פעילות מתחמי הובלת האלקטרונים ומספר המיטוכונדריה בכל תא. מצב 3 של תאים חדירים, לאחר הוספת ADP, דומה לנשימה בסיסית של התא השלם בריכוזים רוויים של מצעים אקסוגניים (איור 2B)7. בלוח 2 מוצגת דוגמה למדדים המחושבים מתוך הרישומים באיור 4.

Figure 3
איור 3: קביעת הריכוז האופטימלי של דיגיטונין לחדירת תאי זרע אנושיים. קצבי הנשימה נמדדו ב-37 מעלות צלזיוס ב-MRM בינוני עם גלוטמט, מלאט ואדנוזין דיפוספט. (A) עקבות נשימתיים מייצגים. הקו הכחול הוא ריכוז O 2, והקו האדום מייצג את זרימת O2 לכל נפח מתואם. (B) קצב נשימה מיטוכונדריה פירושו ± שגיאת תקן, n = 4. החץ האדום מייצג את הריכוז האופטימלי. קיצור: dig = digitonin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: עקבות נשימה מייצגות לקצב צריכת החמצן המתקבל באמצעות מכשיר Oroboros. קצבי הנשימה נמדדו ב-37 מעלות צלזיוס בתאים (A,B) שלמים ו-(C,D) חלדורים. הקו הכחול הוא ריכוז O 2, והקו האדום מייצג את זרימת O2 לכל נפח מתואם. השיעורים ב- A, C ו- D נמדדו עם יותר מ 30 x 10 6 תאי זרע, ואילו השיעור ב- B נמדד עם 14 x 106 תאי זרע. קיצורים: אוליגו = אוליגומיצין; FCCP = קרבוניל ציאניד -p- trifluoromethoxyphenylhydrazone; Glu/Mal = גלוטמט/מלאט; ADP = אדנוזין דיפוספט; AA = אנטימיצין A; ריקבון = רוטנון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב מדיה BWW ו-MRM לניסויים בתאים שלמים או חדים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: דוגמאות מייצגות למדדי HRR. הנתונים התקבלו מהעקבות המוצגים באיור 4. המדדים חושבו לפי איור 2 ופרוטוקול סעיף 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HRR תלוי באופן קריטי במספר שלבים: (א) תחזוקת הציוד, (ב) כיול מדויק של חיישני החמצן, (ג) טיטרציית uncoupler26, ולבסוף, (ד) שימוש נאות במדדים המייצגים את תפקוד המיטוכונדריה. תחזוקת הציוד היא קריטית. מומלץ להחליף את קרומי חיישן החמצן הפולרוגרפי באופן קבוע ולתקן את הרקע האינסטרומנטלי. שטיפה נרחבת לאחר איסוף של זרעונים מן החדרים הוא חיוני כדי להשיג עותקים משוכפלים טובים, במיוחד במעבדות שבהן המכשירים משמשים לעתים קרובות כדי לנתח רקמות או תאים שונים. זרעונים רגישים אפילו לכמויות קטנות של רוטנון, AA, אוליגומיצין ו-FCCP, ולכן שלב השטיפה חייב להתבצע בזהירות (לפחות שלוש פעמים עם אתנול ועוד שלוש פעמים עם מים מזוקקים). כיול הוא צעד מכריע; זה חייב להתבצע כל יום עבור כל מדיה בשימוש (ראה פרוטוקול שלב 2.2). הטיטרציות הלא מצומדות חייבות להתבצע בזהירות, שכן יש להשתמש בריכוזי uncoupler אופטימליים כדי להשיג את הגירוי המרבי של השטף ולהימנע מטיטרציה יתר, אשר באופן פרדוקסלי מעכבת את הנשימה27. הריכוז האופטימלי של uncoupler תלוי בסוג התא, ריכוז התא והמדיום והוא שונה עבור תאים חדירים בהשוואה לתאים שלמים14. לכן, במקרה של דגימות זרע, שבהן תאי הזרע עשויים להיות הטרוגניים, יש להתאים את המצמד לכל דגימה28,29,30. לאחר רספירומטריה, מתקבלים מספר פרמטרים שיש לתקן עבור מספר התאים לפני הניתוח. מחושבים שלושה מדדים המאפשרים פענוח של תפקוד המיטוכונדריה, ולאלה יש יתרון בכך שהם בלתי תלויים במספר המיטוכונדריה והתאים. אנו מדגישים את השימוש ביחס שליטה נשימתית (RCR), המצביע על יעילות הצימוד המיטוכונדריאלי ורגיש למספר אתרים פוטנציאליים של תפקוד לקוי7. עם זאת, ניתן להשתמש בפרמטרים ומדדים אחרים בהתאם לניסוי31.

המגבלות של HRR הן כדלקמן: (א) המכשיר אינו אוטומטי, ולכן הוא דורש נוכחות מתמדת של מפעיל והוא גוזל זמן; (ב) למכשיר HRR יש רק שני תאים, וניתן לבצע רק שתי בדיקות בו זמנית; (ג) התאים אינם חד-פעמיים ויכולים להיות מזוהמים במעכבים או בסוג אחר של רקמה; (ד) למרות שהרגישות של המכשיר גבוהה מאוד, הצוות שלנו מצא שלפחות 12 מיליון/מ"ל זרע נדרשים כדי לזהות שינויים בצריכת החמצן, כך שלא יכולנו למדוד זרע מזכרים אוליגוזוספרמיים; ו-(ה) על המפעיל להיות מודע לכך שהמדידות הן עבור כל התאים הקיימים בדגימות. דגימות זרע הן הטרוגניות ומכילות סוגי תאים אחרים (למשל, לויקוציטים). כדי למנוע זיהום, יש צורך להשתמש בדגימות עם ריכוזים נמוכים של לויקוציטים7. לחלופין, ניתן לבצע שלב טיהור זרע נוסף לפני ניסויי אוקסימטר (למשל, שחייה למעלה או שחייה למטה)24.

חלופה ל- HRR היא השימוש במנתח שטף חוץ-תאי. היתרונות של מנתח השטף החוץ תאי על פני אוקסיגרף ברזולוציה גבוהה למדידת חילוף החומרים של הזרע הם כדלקמן: (א) מנתח השטף החוץ תאי הוא מכשיר אוטומטי במידה רבה; (ב) הוא יכול למדוד את צריכת החמצן בצלחות של 24 בארות ו-96 בארות לצורך סינון בתפוקה גבוהה, כלומר הוא דורש כמויות קטנות יותר של דגימות ביולוגיות; ו-(ג) הוא מאפשר מדידה נוספת של שטף גליקוליטי של זרע. כמה יתרונות של HRR על פני מנתח שטף חוץ-תאי הם כדלקמן: (א) עם HRR, עלות המכשיר והחומרים המתכלים נמוכה יותר; (ב) עם HRR, שלושה עד ארבעה עותקים משוכפלים של כל מדידה אינם נדרשים כמו במנתח השטף החוץ-תאי, שעבורו יש צורך בהעתקים אלה כדי להתמודד עם השונות הפלואורסצנטית הגבוהה; (ג) ההיתכנות של פרוטוקולי הטיטרציה של מעכבי המצע עם HRR היא גבוהה; ו-(ג) התאים מנוטרים בתנועה ולא מחוברים. אוקסימטריה יכולה לנתח את צריכת החמצן של זרעונים תנועתיים (חיים) ושלמים (לא חדירים) 7,31,32. זהו יתרון במקרה של זרעונים, שכן הידבקות זרע למשטח הפלסטיק עלולה לשנות את דפוסי התנועה והתפקוד שלהם.

HRR רגיש יותר מרספירומטריה קונבנציונלית ומתאים לשימוש רפואי בזרעונים אנושיים, שעבורם לא ניתן להגדיל את מספר התאים מכל דגימת זרע (כגון תאים בתרבית). טכניקה זו יכולה לשמש לניטור נשימת זרע מרוב דגימות הזרע, הן מגברים נורמליים והן מגברים עקרים. RCR יכול לשמש כאינדיקטור טוב למצב התפקודי של זרע אנושי, וערך חתך של 3.15 (רגישות וספציפיות של 73% ו -61%, בהתאמה) מבחין בין דגימות זרע עם ניתוח זרע קונבנציונלי תקין ולא תקין32. HRR יכול לשמש להבנת חילוף החומרים המיטוכונדריאלי של הזרע, אשר עשוי להיות אחראי לאי פוריות הגבר, ולהוות השלמה לניתוח זרע סטנדרטי.

הדור החדש האחרון של מכשירי אורובורו מאפשר ניתוח של צריכת חמצן בשילוב עם פונקציות זרע אחרות, כגון ייצור H 2 O2, ויכול לעזור להבין את תפקוד הזרע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות למרפאת Fertilab Andrology, במיוחד חוסה מריה מונטס ואנדראה טורנטס, שאפשרו לנו גישה לתורמים. מימון: A.C. נתמך על ידי מענקים מאוניברסיטת הרפובליקה (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). מימון נוסף הושג מ- Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, אורוגוואי). P.I. ו- R.S. נתמכים על ידי Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 ו- FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. נתמך על ידי POS_FMV_2018_1_1007814 ו- CAP-UDELAR 2020. האיורים אוירו באמצעות Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
  3. Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
  4. Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
  5. Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
  6. Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
  7. Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
  8. Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
  9. Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
  10. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
  11. Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
  12. Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
  13. Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
  14. Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
  17. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  18. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  19. Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
  20. Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
  21. Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
  22. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
  23. Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
  24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
  25. Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
  26. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
  27. Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
  28. Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
  29. Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
  30. Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
  31. Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
  32. Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).

Tags

ספירומטריה ברזולוציה גבוהה תפקוד מיטוכונדריאלי זרעונים אנושיים איכות זרע ניתוח זרע פוריות הגבר פעילות מיטוכונדרית זרע צריכת חמצן מערכת תא סגור איכות זרע מיטוכונדריה זרע זרע שלם זרעונים חדירים קומפלקסים של שרשרת הנשימה מכשיר אוקסיגרף ברזולוציה גבוהה ריכוז חמצן שיעורי צריכת חמצן מדדי נשימה

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרעונים אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter