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Respirometria de Alta Resolução para Avaliação da Função Mitocondrial em Espermatozoides Humanos

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

A análise da função mitocondrial espermática por respirometria de alta resolução permite medir o consumo de oxigênio de espermatozoides que se movem livremente em um sistema de câmara fechada. A técnica pode ser aplicada para medir a respiração em espermatozoides humanos, o que fornece informações sobre as características mitocondriais e integridade dos espermatozoides.

Abstract

A qualidade do sêmen é frequentemente estudada pela análise seminal de rotina, que é descritiva e muitas vezes inconclusiva. A infertilidade masculina está associada à atividade mitocondrial alterada dos espermatozoides, de modo que a medição da função mitocondrial dos espermatozoides é um indicador da qualidade dos espermatozoides. A respirometria de alta resolução é um método de medir o consumo de oxigênio de células ou tecidos em um sistema de câmara fechada. Esta técnica pode ser implementada para medir a respiração em espermatozoides humanos e fornece informações sobre a qualidade e integridade das mitocôndrias espermáticas. A respirometria de alta resolução permite que as células se movam livremente, o que é uma vantagem a priori no caso dos espermatozoides. Esta técnica pode ser aplicada com espermatozoides intactos ou permeabilizados e permite o estudo da função mitocondrial intacta dos espermatozoides e da atividade de complexos de cadeias respiratórias individuais. O instrumento de oxigrafia de alta resolução usa sensores para medir a concentração de oxigênio juntamente com um software sensível para calcular o consumo de oxigênio. Os dados são usados para calcular índices respiratórios com base nas razões de consumo de oxigênio. Consequentemente, os índices são as proporções de duas taxas de consumo de oxigênio e são normalizados internamente para o número celular ou massa proteica. Os índices respiratórios são um indicador da função e disfunção mitocondrial dos espermatozoides.

Introduction

Estima-se que a infertilidade masculina seja responsável por 40%-50% de todos os casos de infertilidade em casais1. A análise seminal convencional desempenha um papel crucial na determinação da fertilidade masculina; no entanto, aproximadamente 15% dos homens inférteis apresentam parâmetros espermáticos normais2. Além disso, a análise seminal de rotina fornece informações limitadas sobre a função espermática e não reflete defeitos sutis espermáticos3.

As mitocôndrias espermáticas têm uma estrutura especial, pois estão dispostas como uma bainha helicoidal ao redor dos flagelos. A bainha mitocondrial contém um número variável de mitocôndrias conectadas por ligantes intermitocondriais e ancoradas ao citoesqueleto por arranjos proteicos ordenados na membrana mitocondrial externa 4,5. Esta estrutura torna particularmente difícil isolar as mitocôndrias dos espermatozoides. Portanto, a maioria dos estudos sobre a função mitocondrial dos espermatozoides utiliza análises in situ ou espermatozoides desembrandados6.

A estrutura e a função mitocondrial espermática têm sido consistentemente associadas à infertilidade masculina 7,8,9,10,11, sugerindo que a análise da estrutura e função dessas organelas pode ser uma boa candidata para inclusão na análise espermática.

As mitocôndrias desempenham um papel importante no metabolismo energético celular, particularmente usando oxigênio para produzir trifosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa (OXPHOS). Nos espermatozoides, em particular, a fonte de ATP (glicólise vs. OXPHOS) é contestada, e muitos dos dados permanecem controversos e dependem de diferentes abordagens experimentais4,12,13. Medidas da respiração por oximetria oferecem informações significativas sobre a capacidade respiratória mitocondrial, integridade mitocondrial e metabolismo energético da célula14,15,16. Tradicionalmente, essa técnica tem sido realizada com o eletrodo de oxigênio de Clark, instrumento utilizado para medir a respiração mitocondrial há mais de 50 anos17,18. Além disso, o consumo de oxigênio mitocondrial dos espermatozoides foi analisado utilizando-se o clássico eletrodo de oxigênio de Clark 19,20,21. A respirometria de alta resolução (FCR) utilizando oxígrafos (Oroboros) fornece maior sensibilidade do que usando os aparelhos de respirometria clássica22. Os oxígrafos são compostos por duas câmaras com portas de injeção, e cada câmara possui um sensor polarográfico de oxigênio. Com essa técnica, é possível analisar lâminas teciduais, células e suspensões mitocondriais isoladas. O espécime é continuamente agitado na câmara e, durante o experimento, o consumo de oxigênio é medido e as taxas de oxigênio são calculadas usando um software específico. As câmaras apresentam menor extravasamento de oxigênio, o que é uma vantagem sobre os aparelhos convencionais de eletrodos de oxigênio14,23.

Como acontece com outras células, no caso dos espermatozoides, a sensibilidade do equipamento HRR é maior do que para a respirometria convencional, o que significa que o equipamento HRR pode ser usado para a análise de um número limitado de espermatozoides intactos ou permeabilizados. Existem duas estratégias principais para avaliar a função mitocondrial espermática pela HRR: (a) medir o consumo de oxigênio em células intactas, que envolve a reprodução da função respiratória em um meio contendo substratos como glicose, ou (b) medir o consumo de oxigênio em células permeabilizadas usando um dos complexos de OXFOS, com a adição de substratos específicos para monitorar cada função separadamente.

No presente estudo, descrevemos o uso da HRR para determinar a respiração mitocondrial em espermatozoides humanos.

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Protocol

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade da República, Montevidéu, Uruguai.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho para respirometria de alta resolução para avaliar a função mitocondrial em espermatozoides humanos intactos e permeabilizados. O protocolo foi dividido em quatro etapas distintas: 1) preparação da amostra, 2) calibração do oxigênio no instrumento Oroboros, 3) medição do consumo de oxigênio para células intactas e permeabilizadas e 4) extração dos dados do equipamento e análise. Abreviações: CASA = análise espermática assistida por computador; BWW = Biggers Whitten Whittingham médio; MRM = meio de respiração mitocondrial; ADP = difosfato de adenosina; FCCP = cianeto de carbonila -p- trifluorometoxifenilhidrazona; AA = antimicina A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: O fluxo de trabalho para medir o consumo de oxigênio em células espermáticas usando HRR é mostrado na Figura 1. As informações sobre os materiais, equipamentos e reagentes utilizados no protocolo são apresentadas na Tabela de Materiais.

1. Preparação da amostra

  1. Coleta de amostras
    1. Coletar sêmen humano recém-ejaculado por masturbação após uma abstinência recomendada de 3 dias em um recipiente plástico estéril. Transportar as amostras imediatamente para o laboratório.
    2. Incubar as amostras por 30-60 min à temperatura ambiente (TR) para liquefazer completamente24.
    3. Após liquefação, armazenar as amostras a 37 °C até ao início da experiência.
  2. Avaliação espermática com análise espermática auxiliada por computador (CASA)
    1. Misture a amostra e carregue 7 μL em uma câmara de contagem de espermatozoides pré-aquecida.
    2. Coloque a câmara no estágio pré-aquecido (37 °C) de um microscópio de luz direta.
    3. Abra o software computadorizado de análise de espermatozoides e, entre no módulo de motilidade e concentração (clique em Mot).
    4. Selecione a configuração que corresponde às condições do esperma humano.
      NOTA: A configuração deve ser adaptada ao tipo e profundidade da câmara, bem como à espécie de amostra e ao sistema CASA.
    5. Analise aleatoriamente 10 campos diferentes por câmara clicando no botão Analisar .
    6. Clique em Resultados para obter a concentração e motilidade da amostra.
  3. Preparação celular
    NOTA: Se a HRR não estiver calibrada, comece com os passos 2.1-2.2 antes de preparar as células (passo 1.3). É importante medir o consumo de oxigênio imediatamente quando os espermatozoides são ressuspensos no meio.
    1. Centrifugar as amostras a 400 x g durante 10 min em RT.
    2. Remover o plasma seminal e ressuspender os espermatozoides em 2 mL de Biggers Whitten Whittingham (BWW) para experimentos com células intactas ou meio respiratório mitocondrial (MRM) para estudos com células permeabilizadas. As composições das mídias são mostradas na Tabela 1.
    3. Repita os passos descritos no passo 1.2 para estudos de concentração de espermatozoides.

2. Respirometria de alta resolução: análise de OXPHOS

NOTA: HRR integra oxigrafias altamente sensíveis (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Áustria) com software (DatLab, versão 4.2; Oroboros Instruments GmbH). Os dados experimentais são apresentados como a concentração de oxigênio versus o tempo (como pmol de O2/106 células·min−1) e como transformações em tempo real desses dados, permitindo ao experimentador rastrear a respiração (consumo de oxigênio, fluxo de oxigênio) de amostras biológicas e bioquímicas enquanto o experimento ainda está em execução. A HRR pode ser usada para acompanhar a respiração de células vivas e móveis, o que é particularmente útil para espermatozoides, cuja motilidade está associada à qualidade espermática e potencial de fertilidade. O laboratório utiliza um HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, com duas câmaras. As etapas descritas neste protocolo devem ser realizadas independentemente para ambas as câmaras de 2 mL.

  1. Preparação do equipamento
    1. Ligue o HRR e conecte-o ao software de respirometria (DatLab) para aquisição e análise de dados.
    2. Substitua o etanol a 70% na câmara oxigráfica por ddH2O. Agite-o continuamente com a barra de agitação magnética na câmara a 750 rpm. Deixe descansar por 10 min, e aspirar o bidestilado (dd) H2O depois.
    3. Lave a câmara três vezes com ddH2O por 5 min cada vez.
      NOTA: Esta etapa é necessária para remover o etanol restante das câmaras. Os espermatozoides são muito sensíveis ao etanol. A gravação pode ser comprometida se essa etapa for omitida.
  2. Calibração dos sensores de oxigênio
    NOTA: O procedimento de calibração varia ligeiramente dependendo do instrumento. Efectuar uma calibração do ar do sensor polarográfico de oxigénio conforme descrito pelo fabricante25. Nesta seção, o protocolo de calibração é explicado brevemente.
    1. Retirar o ddH 2 O e pipetar2mL do mesmo meio utilizado para o preparo celular para a câmara. Coloque as rolhas, deixando uma bolha de troca de ar.
      NOTA: É importante saber o volume da câmara para determinar o volume exato de meio necessário.
    2. Registre os valores de calibração de oxigênio (clique em Layout > 01 Calibração Exp. Gr3-Temp) para monitorar o desempenho da membrana do sensor agitando o meio com a barra de agitação a 750 rpm por pelo menos 30 min a 37 °C. Use as outras configurações como mencionado: ganho para sensor: 2; tensão de polarização: 800 mV; Intervalo de gravação de dados: 2,0 s.
      NOTA: Espera-se obter uma inclinação O 2 não corrigida (linha vermelha) dentro de ±2 pmol∙s−1∙mL−1 com um sinal estável do sensor polarográfico.
    3. Arraste o mouse enquanto mantém pressionado o botão esquerdo do mouse e a tecla shift para selecionar uma área onde a mudança na concentração de oxigênio (Concentração de O2 Y1, linha azul) é estável.
    4. Abra a janela Calibração do O2 (clique em Oxigrafo > Calibração do O2). Em Calibração do ar, altere a marca selecionada para a região selecionada na etapa 2.2.3. Termine clicando em Calibrar e Copiar para a Área de Transferência.
    5. Pare a gravação e salve clicando em Oxygraph > Ok Control > Save and Disconnect.
      Observação : esse conjunto de dados deve ser salvo para que ele possa ser usado em todos os experimentos do dia. A calibração é realizada apenas uma vez ao dia para cada meio.
  3. Titulação digitonina-permeabilização
    1. Abra a câmara e aspirar o meio para dentro.
    2. Carregar na câmara pelo menos 24 x 10 6 e não mais do que 70 x 106 espermatozoides em um volume final de 2 mL de MRM.
      NOTA: É importante medir o número de células na câmara para ajustar o consumo de oxigênio ao final do experimento. Um número menor de células do que o recomendado não pode ser medido.
    3. Feche a câmara empurrando as rolhas até o fim e aspirar o líquido restante na parte superior. Inicie o experimento com as mesmas configurações da calibração: velocidade de agitação: 750 rpm; temperatura: 37 °C; ganho para sensor: 2; tensão de polarização: 800 mV; e intervalo de registro dos dados: 2,0 s.
    4. Para carregar a calibração, clique duas vezes na caixa Pos Calib no canto inferior. Abra a calibração realizada na etapa 2.2 (clique em Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File), e clique em Calibrar e Copy to Clipboard.
      NOTA: A caixa POS Calib mudará de amarelo para verde. Os dados são exibidos em gráficos de fluxo de oxigênio corrigido por volume (Layout 05 Fluxo por Volume não corrigido). Diferentes layouts estão disponíveis no Oxygraph > Layout.
    5. Adicionar 5 μL de difosfato de adenosina 0,5 M (ADP), 10 μL de glutamato 2 M e 2,5 μL de malato 0,4 M (concentrações finais: 1,25 mM, 10 mM e 0,5 mM). Meça o consumo de oxigênio até que o sinal se estabilize.
      NOTA: As microseringas Hamilton de precisão são utilizadas para injeção através da porta de carregamento na rolha. Use uma seringa por medicamento para evitar contaminação cruzada. Clique em F4 para se registrar e marcar no registro de oxigênio quando um tratamento é adicionado.
      NOTA: Os substratos são preparados em água ultrapura e armazenados a −20 °C por 3 meses.
    6. Tritato adicionando 1 μL de digitonina 10 mM em etapas sucessivas até que o consumo de oxigênio atinja um nível máximo.
      NOTA: A lavagem completa com água, etanol 70% e etanol 100% é essencial se a mesma câmara for usada para dois experimentos no mesmo dia.
      NOTA: Digitonin é preparado em água ultrapura e armazenado a -20 °C por 3 meses.
  4. Protocolo de rotina de avaliação respiratória de espermatozoides intactos e permeabilizados (complexo I ou complexo II)
    1. Abra a câmara e aspirar o meio para dentro.
    2. Carregar na câmara pelo menos 24 x 10 6 e não mais do que 70 x 106 espermatozoides em um volume final de 2 mL de BWW (análise de células intactas) ou MRM (análise de células permeabilizadas).
    3. Iniciar a experiência com as mesmas definições da calibração (isto é descrito no passo 2.3.3).
    4. Carregue a calibração efectuada no passo 2.2 conforme descrito no passo 2.3.4.
    5. Registrar a respiração das células por pelo menos 5 min até que um sinal estável seja obtido. Essa medida corresponde à respiração basal em células intactas.
    6. Se a experiência for com células intactas, avance para o passo 2.4.9. Para células permeabilizadas, injetar 4,5 μL de digitonina 10 mM (concentração final: 22,5 μM). Permeabilizar as células por 5 min.
    7. Adicionar os substratos: 10 μL de glutamato 2 M e 2,5 μL de malato 0,4 M (concentrações finais: 10 mM e 0,5 mM, respectivamente) para o complexo I ou 20 μL de succinato 1 M (concentração final: 10 mM) para o complexo II. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal aumente e se estabilize. Este é o estado 4, que significa respiração suportada pelo complexo basal I ou complexo basal II na ausência de ADP.
      NOTA: Os substratos são preparados em água ultrapura e armazenados a −20 °C por 3 meses.
    8. Injetar 5 μL de ADP 0,5 M (concentração final: 1,25 mM). Meça o consumo de oxigênio até que o sinal aumente e se estabilize. A adição de ADP aumenta o sinal correspondente ao consumo máximo de oxigênio através do complexo I ou complexo II (estado 3, em células permeabilizadas).
    9. Adicionar 1 μL de 4 mg/mL de oligomicina (concentração final: 2 μg/mL), um inibidor da ATP sintetase. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal diminua e se estabilize.
      NOTA: A oligomicina é preparada em etanol e armazenada a -20 °C durante 3 meses.
    10. Titular adicionando 1 μL de 0,1 mM a 1 mM de cianeto de carbonila-P-trifluorometoxi-fenilhidrazona (FCCP) em etapas sucessivas até atingir uma taxa máxima de respiração desacoplado. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal aumente e se estabilize.
      NOTA: O FCCP é preparado em etanol e armazenado a -20 °C durante 3 meses.
    11. A concentração final de FCCP é dependente da amostra. Pare de injetar a droga quando o consumo de oxigênio começa a diminuir.
    12. Finalmente, injetar 1 μL de antimicina A 5 mM (concentração final de 2,5 μM). Trata-se de um inibidor do complexo III para discriminar o consumo mitocondrial e o consumo residual de oxigênio (respiração não mitocondrial). Para a análise do complexo I, adicionar 1 μL de rotenona 1 mM (concentração final de 0,5 μM), um inibidor desse complexo, em vez de AA. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal diminua e se estabilize.
      NOTA: Os medicamentos são preparados em etanol e armazenados a -20 °C por 3 meses.

3. Extração e análise dos dados

Figure 2
Figura 2: Aquisição dos parâmetros respiratórios de um experimento de respirometria de alta resolução. (A,B) Representações esquemáticas dos gráficos obtidos, conforme descrito na Figura 1, para células intactas e permeabilizadas, respectivamente. Esses parâmetros foram descritospreviamente15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Arraste o mouse pressionando o botão esquerdo do mouse e a tecla Shift para selecionar regiões onde o fluxo de oxigênio por volume correlacionado (inclinação Y2 O2 uncorr., linha vermelha) é estável após a injeção de um substrato ou inibidor. A Figura 2 mostra os diferentes parâmetros obtidos a partir do registro descritoanteriormente15.
    NOTA: Os parâmetros dependem do experimento; todos eles: respiração basal em células intactas e respiração na presença de glutamato/malato ou succinato (estado 4), ADP (estado 3), oligomicina (vazamento de prótons), FCCP (taxa respiratória máxima), rotenona/AA (respiração não mitocondrial). Nas células permeabilizadas, a respiração basal corresponde ao estado 3.
  2. Clique nas janelas Marcas > Estatísticas e exporte os dados.
  3. Normalizar os dados obtidos por 1 milhão de espermatozoides. As unidades das encostas são células pmolO2·s−1·mL−1·10−6.
  4. Subtrair o consumo de oxigênio não mitocondrial de todos os valores antes de calcular os índices.
  5. Calcule os índices usando as várias equações descritas anteriormente15:
    Equation 1

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Representative Results

Determinação da concentração ótima de digitonina em espermatozoides
Neste protocolo, apresentamos o uso da HRR para monitorar em tempo real as mudanças no OXPHOS em espermatozoides humanos. Uma vez que o método pode ser usado para analisar espermatozoides intactos ou permeabilizados por digitonina, apresentamos primeiramente a padronização da concentração de digitonina necessária para permeabilizar os espermatozoides (Figura 3).

A digitonina é usada para permeabilização química, que permite a entrada de substratos nas células, e para medir a atividade mitocondrial. Este composto deve ser titulado em células intactas para obter a concentração ideal necessária para garantir a permeabilização da membrana celular sem comprometer a integridade da membrana mitocondrial. Realizamos titulação na presença de ADP, glutamato e malato. As taxas respiratórias foram medidas no início do estudo e após a adição gradual de digitonina (Figura 3A). O consumo de oxigênio aumenta com o aumento da concentração de detergente e chega a um ponto em que a integridade da membrana mitocondrial externa começa a ser comprometida (seta vermelha na Figura 3A). A Figura 3B mostra a média ± o erro padrão de 4 experimentos representativos. O resultado mostra que a permeabilização é ótima em uma concentração de digitonina de 22,5 μM (Figura 3A,B). A atividade mitocondrial diminui quando quantidades muito altas de digitonina são usadas.

Representação do registro bem-sucedido e subótimo da respiração espermática pela HRR
Durante o monitoramento da respiração mitocondrial espermática, o registro pode ser visualizado como concentração de O 2 (linha azul) e fluxo de O2 por volume correlacionado (linha vermelha) calculado com o software de análise DatLab 4 em células permeabilizadas e não permeabilizadas (Figura 4). A Figura 4 mostra curvas representativas de espermatozoides intactos (Figura 4A,B) e permeabilizados por digitonina (Figura 4C,D) de uma amostra de sêmen. A Figura 4A representa um registro bem-sucedido de espermatozoides intactos a partir de uma amostra de sêmen, onde são observados os efeitos de drogas moduladoras do consumo de oxigênio, sendo possível extrair os parâmetros para o cálculo dos índices. A respiração basal é registrada em células intactas pelo consumo de oxigênio na presença de substratos exógenos. Em seguida, a taxa respiratória não fosforilante foi medida pela adição de um inibidor da ATP sintase (oligomicina). Posteriormente, o protonóforo FCCP foi injetado em diferentes concentrações e a taxa máxima de respiração mitocondrial não acoplada foi determinada. Essa droga leva a um aumento da permeabilidade de prótons da membrana interna, o que permite que o movimento passivo de prótons dissipe o gradiente quimiosmótico que causa um aumento no consumo de oxigênio. Finalmente, AA foi adicionado para inibir a respiração mitocondrial.

A qualidade dos dados obtidos está intimamente relacionada com o número da célula. É importante ter um alto consumo basal de oxigênio para obter um bom registro. A análise subsequente depende de mudanças sutis no consumo de O2 que podem não ser detectadas se a linha basal não for alta o suficiente. Contagens de células abaixo do recomendado podem levar a um resultado como o da Figura 4B.

As curvas representativas obtidas pelo protocolo para substratos específicos do complexo I ou II são mostradas na Figura 4C e na Figura 4D, respectivamente. Para estudar o consumo de oxigênio através do complexo mitocondrial I ou complexo II, os substratos malato e glutamato ou succinato foram adicionados após a permeabilização das células. Em seguida, o ADP é adicionado para conversão em ATP (estado 3, respiração dependente do complexo I ou II ativo). Finalmente, rotenona ou AA são administrados para inibir o complexo I ou II, respectivamente.

Para interpretação dos resultados, é importante considerar que a respiração celular inibida pela oligomicina é uma medida direta da taxa de extravasamento de prótons através da membrana mitocondrial em células intactas, que é comparável ao estado 4 das células permeabilizadas (sem ADP) (Figura 2B). No caso de células intactas (não permeabilizadas), essa quantidade indica a fração de consumo de oxigênio mitocondrial basal que é independente da síntese de ATP. A taxa respiratória máxima é atingida após a adição de várias doses de FCCP. Em células intactas depende de dois fatores; a atividade dos complexos de transporte de elétrons e o número de mitocôndrias em cada célula. O estado 3 das células permeabilizadas após a adição de ADP assemelha-se à respiração basal da célula intacta em concentrações saturadas de substratos exógenos (Figura 2B)7. A Tabela 2 mostra um exemplo dos índices calculados a partir dos registros da Figura 4.

Figure 3
Figura 3: Determinação da concentração ótima de digitonina para a permeabilização de espermatozoides humanos. As taxas respiratórias foram medidas a 37 °C em meio MRM com glutamato, malato e difosfato de adenosina. (A) Traço respiratório representativo. A linha azul é a concentração de O 2, e a linha vermelha representa o fluxo de O2 por volume correlacionado. (B) Taxa respiratória mitocondrial significa ± erro padrão, n = 4. A seta vermelha representa a concentração ideal. Abreviação: dig = digitonina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Traços respiratórios representativos para a taxa de consumo de oxigênio obtida com o instrumento Oroboros. As taxas respiratórias foram medidas a 37 °C em (A,B) células intactas e (C,D) permeabilizadas. A linha azul é a concentração de O 2, e a linha vermelha representa o fluxo de O2 por volume correlacionado. As taxas em A, C e D foram medidas com mais de 30 x 10 6 espermatozoides, enquanto a taxa em B foi medida com 14 x 106 espermatozoides. Abreviações: Oligo = oligomicina; FCCP = cianeto de carbonila -p- trifluorometoxifenilhidrazona; Glu/Mal = glutamato/malato; ADP = difosfato de adenosina; AA = antimicina A; Podridão = rotenona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição dos meios BWW e MRM para experimentos com células intactas ou permeabilizadas, respectivamente. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Exemplos representativos de índices de FCR. Os dados foram obtidos a partir dos traços mostrados na Figura 4. Os índices foram calculados de acordo com a Figura 2 e a seção 3 do protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

A HRR depende criticamente de várias etapas: (a) a manutenção do equipamento, (b) a calibração precisa dos sensores de oxigênio, (c) a titulação do desacoplador26 e, finalmente, (d) o uso adequado de índices que representem a função mitocondrial. A manutenção do equipamento é fundamental. Recomenda-se substituir as membranas do sensor polarográfico de oxigênio regularmente e corrigir o fundo instrumental. A lavagem extensiva após a coleta de espermatozoides das câmaras é essencial para a obtenção de boas réplicas, especialmente em laboratórios nos quais os instrumentos são frequentemente usados para analisar vários tecidos ou células. Os espermatozoides são sensíveis até mesmo a pequenas quantidades de rotenona, AA, oligomicina e FCCP, por isso a etapa de lavagem deve ser realizada com cuidado (pelo menos três vezes com etanol e outras três vezes com água destilada). A calibração é uma etapa crucial; Deve ser realizada todos os dias e para cada um dos meios utilizados (ver passo de protocolo 2.2). As titulações do desacoplador devem ser realizadas com cuidado, pois as concentrações ideais do desacoplador devem ser utilizadas para atingir a estimulação máxima do fluxo e evitar a titulação excessiva, que paradoxalmente inibe a respiração27. A concentração ótima do desacoplador depende do tipo celular, da concentração celular e do meio e é diferente para células permeabilizadas em comparação com células intactas14. Assim, no caso de amostras de espermatozoides, nas quais os espermatozoides podem ser heterogêneos, o desacoplador deve ser adaptado a cada amostra28,29,30. Após a respirometria, obtêm-se vários parâmetros que devem ser corrigidos para o número de células antes da análise. São calculados três índices que permitem a interpretação da função mitocondrial, e estes têm a vantagem de serem independentes do número de mitocôndrias e células. Destaca-se o uso da razão de controle respiratório (RCR), que indica a eficiência do acoplamento mitocondrial e é sensível a múltiplos sítios potenciais dedisfunção7. Entretanto, outros parâmetros e índices podem ser utilizados dependendo do experimento31.

As limitações da FCR são: (a) o dispositivo não é automatizado, por isso requer a presença constante de um operador e é demorado; (b) o dispositivo HRR tem apenas duas câmaras, e apenas dois ensaios podem ser realizados simultaneamente; c) As câmaras não são de utilização única e podem estar contaminadas com inibidores ou outro tipo de tecido; (d) embora a sensibilidade do instrumento seja muito alta, nossa equipe descobriu que pelo menos 12 milhões/mL de espermatozoides são necessários para detectar variações no consumo de oxigênio, então não pudemos medir espermatozoides de machos oligozoospérmicos; e (e) o operador deve estar ciente de que as medições são para todas as células presentes nas amostras. As amostras de sêmen são heterogêneas e contêm outros tipos celulares (por exemplo, leucócitos). Para evitar contaminação, é necessário o uso de amostras com baixas concentrações de leucócitos7. Alternativamente, uma etapa adicional de purificação espermática pode ser realizada antes dos experimentos com oxímetro (por exemplo, nadar para cima ou para baixo)24.

Uma alternativa à HRR é o uso do analisador de fluxo extracelular. As vantagens do analisador de fluxo extracelular sobre o oxígrafo de alta resolução para medir o metabolismo espermático são as seguintes: (a) o analisador de fluxo extracelular é um instrumento amplamente automatizado; (b) pode medir o consumo de oxigênio em placas de 24 e 96 poços para triagem de alto rendimento, o que significa que requer menores quantidades de amostras biológicas; e (c) permite a medição adicional do fluxo glicolítico espermático. Algumas vantagens da FCR sobre o analisador de fluxo extracelular são: (a) com a FCR, o custo do instrumento e dos consumíveis é menor; (b) com a HRR, não são necessárias três a quatro repetições de cada medida, como no analisador de fluxo extracelular, para o qual essas réplicas são necessárias para lidar com a alta variabilidade de fluorescência; (c) a viabilidade dos protocolos de titulação do inibidor do desacoplador do substrato com a HRR é alta; e (c) as células são monitoradas em movimento e não ligadas. A oximetria pode analisar o consumo de oxigênio de espermatozoides móveis (vivos) e intactos (não permeabilizados) 7,31,32. Esta é uma vantagem no caso dos espermatozoides, uma vez que a adesão dos espermatozoides à superfície plástica pode potencialmente alterar seus padrões de movimento e função.

A HRR é mais sensível do que a respirometria convencional e é adequada para uso médico em espermatozoides humanos, para os quais o número de células de cada amostra de sêmen não pode ser aumentado (como células cultivadas). Essa técnica pode ser usada para monitorar a respiração espermática da maioria das amostras de sêmen, tanto de homens normais quanto inférteis. O RCR pode ser usado como um bom indicador do estado funcional do espermatozoide humano, e um valor de corte de 3,15 (sensibilidade e especificidade de 73% e 61%, respectivamente) distingue amostras de espermatozoides com análise de sêmen convencional normal e anormal32. A HRR poderia ser usada para entender o metabolismo mitocondrial dos espermatozoides, que pode ser responsável pela infertilidade masculina, e ser um complemento à análise padrão do sêmen.

A última nova geração de instrumentos Oroboro permite a análise do consumo de oxigênio em conjunto com outras funções do esperma, como a produção de H 2 O2, e pode ajudar a entender a função espermática.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer à clínica de Andrologia Fertilab, especialmente José María Montes e Andrea Torrents, por nos permitir o acesso aos doadores. Financiamento: A.C. é apoiado por bolsas da Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Financiamento adicional foi obtido do Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguai). P.I. e R.S. são apoiados pela Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 e FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguai). P.I. é apoiado pelo POS_FMV_2018_1_1007814 e CAP-UDELAR 2020. As figuras foram ilustradas com Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

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References

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Tags

Respirometria de Alta Resolução Função Mitocondrial Espermatozoides Humanos Qualidade do Sêmen Análise de Espermatozoides Infertilidade Masculina Atividade Mitocondrial de Espermatozoides Consumo de Oxigênio Sistema de Câmara Fechada Qualidade do Esperma Mitocôndrias Espermáticas Espermatozoides Intactos Espermatozoides Permeabilizados Complexos de Cadeias Respiratórias Instrumento de Oxígrafo de Alta Resolução Concentração de Oxigênio Taxas de Consumo de Oxigênio Índices Respiratórios

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Respirometria de Alta Resolução para Avaliação da Função Mitocondrial em Espermatozoides Humanos
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Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

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