Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Респирометрия высокого разрешения для оценки функции митохондрий в сперматозоидах человека

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

Анализ митохондриальной функции сперматозоидов с помощью респирометрии высокого разрешения позволяет измерять потребление кислорода свободно движущимися сперматозоидами в замкнутой камере. Метод может быть применен для измерения дыхания в сперматозоидах человека, что дает информацию о митохондриальных характеристиках и целостности сперматозоидов.

Abstract

Качество спермы часто изучается с помощью рутинного анализа спермы, который является описательным и часто неубедительным. Мужское бесплодие связано с измененной митохондриальной активностью сперматозоидов, поэтому измерение митохондриальной функции сперматозоидов является показателем качества спермы. Респирометрия высокого разрешения — это метод измерения потребления кислорода клетками или тканями в системе с закрытой камерой. Этот метод может быть применен для измерения дыхания в сперматозоидах человека и предоставляет информацию о качестве и целостности митохондрий сперматозоидов. Респирометрия с высоким разрешением позволяет клеткам свободно двигаться, что является априорным преимуществом в случае сперматозоидов. Этот метод может применяться с интактными или пермеабилизированными сперматозоидами и позволяет исследовать интактную функцию митохондрий сперматозоидов и активность отдельных комплексов дыхательной цепи. Оксиграф высокого разрешения использует датчики для измерения концентрации кислорода в сочетании с чувствительным программным обеспечением для расчета потребления кислорода. Полученные данные используются для расчета дыхательных индексов на основе коэффициентов потребления кислорода. Следовательно, индексы представляют собой пропорции двух скоростей потребления кислорода и внутренне нормируются к количеству клеток или массе белка. Дыхательные индексы являются индикатором митохондриальной функции и дисфункции сперматозоидов.

Introduction

По оценкам, мужское бесплодие составляет 40-50% всех случаев бесплодия в парах1. Обычный анализ спермы играет решающую роль в определении мужской фертильности; Тем не менее, примерно 15% бесплодных мужчин имеют нормальные параметры сперматозоидов2. Кроме того, рутинный анализ спермы дает ограниченную информацию о функции сперматозоидов и не отражает малозаметные дефекты сперматозоидов3.

Митохондрии сперматозоидов имеют особое строение, так как расположены в виде спиральной оболочки вокруг жгутиков. Митохондриальная оболочка содержит переменное число митохондрий, соединенных межмитохондриальными линкерами и закрепленных в цитоскелете упорядоченными белковыми расположениями на внешней митохондриальной мембране 4,5. Такая структура особенно затрудняет выделение митохондрий сперматозоидов. Поэтому в большинстве исследований митохондриальной функции сперматозоидов используют анализ in situ или демембрированных сперматозоидов6.

Митохондриальная структура и функции сперматозоидов последовательно связаны с мужским бесплодием 7,8,9,10,11, что позволяет предположить, что анализ структуры и функции этих органелл может быть хорошим кандидатом для включения в анализ спермы.

Митохондрии играют важную роль в клеточном энергетическом метаболизме, в частности, используя кислород для производства аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS). В сперматозоидах, в частности, источник АТФ (гликолиз против OXPHOS) является спорным, и большая часть данных остается спорной и зависит от различных экспериментальных подходов 4,12,13. Измерения дыхания с помощью оксиметрии дают важное представление о дыхательной способности митохондрий, целостности митохондрий и энергетическом метаболизме клетки14,15,16. Традиционно этот метод выполнялся с использованием кислородного электрода Кларка – прибора, который использовался для измерения митохондриального дыхания более 50лет. Кроме того, было проанализировано потребление кислорода митохондриями сперматозоидов с помощью классического кислородного электрода Кларка 19,20,21. Респирометрия высокого разрешения (HRR) с использованием оксиграфов (Oroboros) обеспечивает более высокую чувствительность, чем использование классических респирометрических приборов22. Оксиграфы состоят из двух камер с инжекционными портами, и каждая камера оснащена полярографическим датчиком кислорода. С помощью этого метода можно анализировать тканевые слайды, клетки и изолированные митохондриальные суспензии. Образец непрерывно перемешивается в камере, и во время эксперимента измеряется потребление кислорода, а скорость кислорода рассчитывается с помощью специального программного обеспечения. Камеры демонстрируют пониженную утечку кислорода, что является преимуществом по сравнению с обычными кислородными электродными устройствами 14,23.

Как и в случае с другими клетками, в случае сперматозоидов чувствительность оборудования HRR выше, чем для обычной респирометрии, что означает, что оборудование HRR может быть использовано для анализа ограниченного количества интактных или пермеабилизированных сперматозоидов. Существует две основные стратегии оценки митохондриальной функции сперматозоидов с помощью HRR: (а) измерение потребления кислорода в интактных клетках, которое включает воспроизведение дыхательной функции в среде, содержащей субстраты, такие как глюкоза, или (б) измерение потребления кислорода в пермеабилизированных клетках с использованием одного из комплексов OXPHOS с добавлением специфических субстратов для мониторинга каждой функции отдельно.

В настоящем исследовании мы описываем использование HRR для определения митохондриального дыхания в сперматозоидах человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты были одобрены Комитетом по этике Медицинского факультета Университета Республики в Монтевидео, Уругвай.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс для респирометрии высокого разрешения для оценки функции митохондрий в интактных и пермеабилизированных сперматозоидах человека. Протокол был разделен на четыре этапа: 1) подготовка образца, 2) калибровка кислорода в приборе «Ороборос», 3) измерение потребления кислорода для интактных и пермеабилизированных ячеек и 4) извлечение данных из оборудования и анализ. Сокращения: CASA = компьютерный анализ спермы; BWW = Biggers Whitten Whittingham средний; MRM = среда митохондриального дыхания; АДФ = аденозиндифосфат; FCCP = карбонильцианид --трифторметоксифенилгидразон; AA = антимицин А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс измерения потребления кислорода в сперматозоидах с помощью HRR показан на рисунке 1. Информация о материалах, оборудовании и реактивах, используемых в протоколе, представлена в Таблице материалов.

1. Пробоподготовка

  1. Отбор проб
    1. Соберите свежеэякулированную человеческую сперму путем мастурбации после рекомендуемого 3-дневного воздержания в стерильном пластиковом контейнере. Немедленно транспортируйте образцы в лабораторию.
    2. Инкубируют образцы в течение 30-60 мин при комнатной температуре (RT) до полного разжижения24.
    3. После сжижения храните образцы при температуре 37 °C до начала эксперимента.
  2. Оценка сперматозоидов с помощью компьютерного анализа спермы (CASA)
    1. Смешайте образец и загрузите 7 мкл в предварительно разогретую камеру для подсчета сперматозоидов.
    2. Поместите камеру на предварительно нагретый (37 °C) предметный столик микроскопа прямого света.
    3. Откройте компьютеризированное программное обеспечение для анализа спермы и войдите в модуль подвижности и концентрации спермы (нажмите на Mot).
    4. Выберите конфигурацию, соответствующую состоянию сперматозоидов человека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация должна быть адаптирована к типу и глубине камеры, а также к видам образцов и системе CASA.
    5. Случайным образом проанализируйте 10 различных полей в камере, нажав на кнопку «Анализировать ».
    6. Нажмите « Результаты », чтобы получить концентрацию и подвижность образца.
  3. Подготовка клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если HRR не откалиброван, начните с шагов 2.1-2.2 перед подготовкой ячеек (шаг 1.3). Важно измерять потребление кислорода сразу после того, как сперматозоиды ресуспендируют в среде.
    1. Центрифугируют образцы при 400 x g в течение 10 мин при RT.
    2. Удалите семенную плазму и ресуспендируйте сперматозоиды в 2 мл Biggers Whitten Whittingham (BWW) для экспериментов с интактными клетками или митохондриальной дыхательной средой (MRM) для исследований с пермеабилизированными клетками. Составы сред приведены в таблице 1.
    3. Повторите шаги, описанные в шаге 1.2, для исследования концентрации сперматозоидов.

2. Респирометрия высокого разрешения: анализ OXPHOS

ПРИМЕЧАНИЕ: HRR интегрирует высокочувствительные оксиграфы (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Инсбрук, Австрия) с программным обеспечением (DatLab, версия 4.2; Ороборос Инструментс ГмбХ). Экспериментальные данные отображаются в виде зависимости концентрации кислорода от времени (в виде пмоль O2/106 клеток·мин−1) и в виде преобразований этих данных в реальном времени, что позволяет экспериментатору отслеживать дыхание (потребление кислорода, поток кислорода) биологических и биохимических образцов во время эксперимента. HRR может быть использован для отслеживания дыхания живых и подвижных клеток, что особенно полезно для сперматозоидов, подвижность которых связана с качеством сперматозоидов и потенциалом фертильности. В лаборатории используется HRR Oroboros Oxygraph 2-k, Oroboros Instruments, с двумя камерами. Шаги, описанные в этом протоколе, должны выполняться независимо для обеих камер объемом 2 мл.

  1. Подготовка оборудования
    1. Включите HRR и подключите его к программному обеспечению для респирометрии (DatLab) для сбора и анализа данных.
    2. Замените 70% этанол в камере оксиграфа на ddH2O. Непрерывно перемешивайте его магнитной мешалкой в камере со скоростью 750 об/мин. Дайте ему постоять 10 минут, а затем отсосите двойную дистилляцию (dd) H2O.
    3. Промойте камеру три раза с ddH2O в течение 5 минут каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для удаления оставшегося этанола из камер. Сперматозоиды очень чувствительны к этанолу. Запись может быть скомпрометирована, если пропустить этот шаг.
  2. Калибровка лямбда-зондов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура калибровки немного отличается в зависимости от прибора. Выполняют воздушную калибровку полярографического датчика кислорода, как описано изготовителем25. В этом разделе кратко описан протокол калибровки.
    1. Удалите ddH 2 O и пипетку2мл той же среды, которая использовалась для подготовки клеток, в камеру. Установите пробки, оставив пузырь воздухообмена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно знать объем камеры, чтобы определить точный объем необходимой среды.
    2. Запишите значения калибровки кислорода (нажмите на Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp), чтобы контролировать производительность мембраны датчика, перемешивая среду с помощью мешалки при 750 об/мин в течение не менее 30 минут при 37 °C. Используйте другие настройки, как уже упоминалось: усиление для датчика: 2; поляризационное напряжение: 800 мВ; Интервал записи данных: 2,0 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается получение наклонаO2 без коррекции (красная линия) в пределах ±2 пмоль∙с−1∙мл−1 при стабильном сигнале от полярографического датчика.
    3. Перетащите мышь, удерживая левую кнопку мыши и клавишу Shift, чтобы выбрать область, где изменение концентрации кислорода (концентрация Y1 O2, синяя линия) стабильно.
    4. Откройте окно O2 Calibration (нажмите на Oxygraph > O2 Calibration). В разделе «Калибровка воздуха» измените выбранную метку на регион, выбранный на шаге 2.2.3. Завершите, нажав « Калибровка» и «Копировать в буфер обмена».
    5. Остановите запись и сохраните, нажав «Оксиграф» > « Ok Control» > «Сохранить и отключить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот набор данных должен быть сохранен, чтобы его можно было использовать во всех экспериментах дня. Калибровка выполняется только один раз в день для каждого носителя.
  3. Дигитонин-пермеабилизационное титрование
    1. Откройте камеру и аспирируйте среду внутри.
    2. Загрузите в камеру не менее 24 х 10 6 и не более 70 х 106 сперматозоидов в конечный объем 2 мл МРМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно измерить количество клеток в камере, чтобы отрегулировать потребление кислорода в конце эксперимента. Меньшее количество клеток, чем рекомендуется, не может быть измерено.
    3. Закройте камеру, протолкнув пробки до упора, и аспирируйте оставшуюся жидкость наверху. Начните эксперимент с теми же настройками, что и для калибровки: скорость перемешивания: 750 об/мин; температура: 37 °C; усиление для датчика: 2; поляризационное напряжение: 800 мВ; и интервал записи данных: 2,0 с.
    4. Чтобы загрузить калибровку, дважды щелкните по окошку Pos Calib в нижнем углу. Откройте калибровку, выполненную на шаге 2.2 (нажмите «Оксиграф» > « Калибровка O2» > «Копировать из файла»), и нажмите «Калибровка и копирование в буфер обмена».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коробка POS Calib изменится с желтого на зеленый. Данные отображаются в виде графиков расхода кислорода с поправкой на объем (Layout 05 Flux per Volume uncorrected). В Oxygraph > Layout доступны различные макеты.
    5. Добавьте 5 мкл 0,5 М аденозиндифосфата (АДФ), 10 мкл 2 М глутамата и 2,5 мкл 0,4 М малата (конечные концентрации: 1,25 мМ, 10 мМ и 0,5 мМ). Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не стабилизируется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прецизионные микрошприцы Hamilton используются для инъекций через загрузочное отверстие в пробке. Используйте один шприц для каждого препарата, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Нажмите на F4 , чтобы зарегистрироваться, и отметьте в кислородном регистре добавление процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субстраты готовят в сверхчистой воде и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
    6. Тритат путем добавления 1 мкл 10 мМ дигитонина в последовательных шагах до тех пор, пока потребление кислорода не достигнет максимального уровня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательная промывка водой, 70% этанола и 100% этанолом необходима, если одна и та же камера используется для двух экспериментов в один и тот же день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дигитонин готовят в сверхчистой воде и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
  4. Протокол рутинной дыхательной оценки интактных и пермеабилизированных сперматозоидов (комплекс I или комплекс II)
    1. Откройте камеру и аспирируйте среду внутри.
    2. Загрузите в камеру не менее 24 х 10 6 и не более 70 х 106 сперматозоидов в конечном объеме 2 мл BWW (анализ интактных клеток) или MRM (анализ пермеабилизированных клеток).
    3. Начните эксперимент с теми же настройками, что и для калибровки (это описано в шаге 2.3.3).
    4. Загрузите калибровку, выполненную на шаге 2.2, как описано в шаге 2.3.4.
    5. Записывайте дыхание клеток не менее 5 мин до получения стабильного сигнала. Этот показатель соответствует базальному дыханию в интактных клетках.
    6. Если эксперимент проводится с интактными клетками, переходите к шагу 2.4.9. Для пермеабилизированных клеток вводят 4,5 мкл 10 мМ дигитонина (конечная концентрация: 22,5 мкМ). Пермеабилизируйте клетки в течение 5 мин.
    7. Добавьте субстраты: 10 мкл 2 М глутамата и 2,5 мкл 0,4 М малата (конечные концентрации: 10 мМ и 0,5 мМ соответственно) для комплекса I или 20 мкл 1 М сукцината (конечная концентрация: 10 мМ) для комплекса II. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не усилится и не стабилизируется. Это состояние 4, что означает опорное дыхание базального комплекса I или базального комплекса II при отсутствии АДФ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субстраты готовят в сверхчистой воде и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
    8. Ввести 5 мкл 0,5 М АДФ (конечная концентрация: 1,25 мМ). Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не усилится и не стабилизируется. Добавление АДФ увеличивает сигнал, соответствующий максимальному потреблению кислорода через комплекс I или комплекс II (состояние 3, в пермеабилизированных клетках).
    9. Добавьте 1 мкл 4 мг/мл олигомицина (конечная концентрация: 2 мкг/мл), ингибитора АТФ-синтетазы. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не уменьшится и не стабилизируется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Олигомицин готовят в этаноле и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
    10. Титрование путем добавления от 1 мкл от 0,1 мМ до 1 мМ карбонилцианида--трифторметоксифенилгидразона (FCCP) в последовательные этапы до достижения максимальной скорости несвязанного дыхания. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не усилится и не стабилизируется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FCCP готовят в этаноле и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
    11. Конечная концентрация FCCP зависит от образца. Прекратите вводить препарат, когда потребление кислорода начнет снижаться.
    12. Наконец, введите 1 мкл антимицина А 5 мМ (конечная концентрация 2,5 мкМ). Это комплексный ингибитор III для различения митохондриального и остаточного потребления кислорода (немитохондриальное дыхание). Для анализа комплекса I добавляют 1 мкл 1 мМ ротенона (конечная концентрация 0,5 мкМ), ингибитора этого комплекса, вместо АА. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не уменьшится и не стабилизируется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Препараты готовят в этаноле и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.

3. Извлечение и анализ данных

Figure 2
Рисунок 2: Получение параметров дыхания из эксперимента по респирометрии с высоким разрешением. (A,B) Схематические изображения графиков, полученных, как описано на рисунке 1, для интактных и пермеабилизированных клеток соответственно. Эти параметры были описаны ранее15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Перетащите мышь, нажав левую кнопку мыши и клавишу Shift, чтобы выбрать области, где поток кислорода на объем коррелирует (Y2 O2 наклон некоррелированный, красная линия) стабилен после введения субстрата или ингибитора. На рисунке 2 показаны различные параметры, полученные из ранее описанного регистра15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры зависят от эксперимента; все они следующие: базальное дыхание в интактных клетках и дыхание в присутствии глутамата/малата или сукцината (состояние 4), АДФ (состояние 3), олигомицина (утечка протонов), FCCP (максимальная частота дыхания), ротенон/АА (немитохондриальное дыхание). В пермеабилизированных клетках базальное дыхание соответствует состоянию 3.
  2. Нажмите на окна Метки > Статистика и экспортируйте данные.
  3. Нормализуйте полученные данные на 1 миллион сперматозоидов. Единицами наклона являются пмольО2·с−1·мл−1·мл−1·10−6 клеток.
  4. Вычтите немитохондриальное потребление кислорода из всех значений перед расчетом индексов.
  5. Рассчитайте индексы, используя различные уравнения, описанные ранее15:
    Equation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Определение оптимальной концентрации дигитонина в сперматозоидах
В этом протоколе мы представляем использование HRR для мониторинга изменений OXPHOS в сперматозоидах человека в режиме реального времени. Поскольку метод может быть использован для анализа интактных или дигитонин-пермеабилизированных сперматозоидов, мы сначала представим стандартизацию концентрации дигитонина, необходимой для пермеабилизации сперматозоидов (рис. 3).

Дигитонин используется для химической пермеабилизации, которая позволяет субстратам проникать в клетки, и для измерения активности митохондрий. Это соединение должно быть титровано в интактных клетках для получения оптимальной концентрации, необходимой для обеспечения проницаемости клеточной мембраны без нарушения целостности митохондриальной мембраны. Мы проводили титрование в присутствии АДФ, глутамата и малата. Частоту дыхания измеряли на исходном уровне и после постепенного добавления дигитонина (рис. 3А). Потребление кислорода возрастает с увеличением концентрации моющего средства и достигает точки, когда целостность внешней митохондриальной мембраны начинает нарушаться (красная стрелка на рисунке 3A). На рисунке 3B показана средняя ± стандартная ошибка 4 репрезентативных экспериментов. Результат показывает, что пермеабилизация оптимальна при концентрации дигитонина 22,5 мкМ (рис. 3A,B). Митохондриальная активность снижается при использовании слишком большого количества дигитонина.

Представление успешного и неоптимального регистра дыхания сперматозоидов с помощью HRR
Во время мониторинга митохондриального дыхания сперматозоидов регистр может быть визуализирован как корреляция концентрации O2 (синяя линия) и потокаO2 на объем (красная линия), рассчитанная с помощью аналитического программного обеспечения DatLab 4 как в пермеабилизированных, так и в непермеабилизированных клетках (рис. 4). На рисунке 4 показаны репрезентативные кривые интактных (Рисунок 4A, B) и пермеабилизированных дигитонином (Рисунок 4C, D) сперматозоидов из образца спермы. На рисунке 4А представлена успешная регистрация интактных сперматозоидов из образца спермы, где наблюдаются эффекты препаратов, модулирующих потребление кислорода, и можно извлечь параметры для расчета индексов. Базальное дыхание регистрируется в интактных клетках потреблением кислорода в присутствии экзогенных субстратов. Затем скорость нефосфорилированного дыхания измеряли путем добавления ингибитора АТФ-синтазы (олигомицина). В дальнейшем вводили протонофор FCCP в различных концентрациях и определяли максимальную скорость митохондриального несвязанного дыхания. Этот препарат приводит к увеличению протонной проницаемости внутренней мембраны, что позволяет пассивному движению протонов рассеивать хемиосмотический градиент, вызывающий увеличение потребления кислорода. Наконец, был добавлен АК для ингибирования митохондриального дыхания.

Качество получаемых данных тесно связано с номером ячейки. Важно иметь высокий базальный расход кислорода для получения хороших показателей. Последующий анализ зависит от тонких изменений в потребленииО2 , которые могут быть не обнаружены, если базальная линия недостаточно высока. Меньшее количество клеток, чем рекомендуется, может привести к результату, подобному рисунку 4B.

Репрезентативные кривые, полученные с использованием протокола для сложных I или II специфических подложек, показаны на рисунке 4C и рисунке 4D соответственно. Для изучения потребления кислорода через митохондриальный комплекс I или комплекс II субстраты малат и глутамат или сукцинат добавляли после пермеабилизации клеток. Затем добавляется АДФ для превращения в АТФ (состояние 3, активный комплекс I или II зависимое дыхание). Наконец, для ингибирования комплекса I или II вводят ротенон или АК соответственно.

Для интерпретации результатов важно учитывать, что клеточное дыхание, ингибированное олигомицином, является прямым измерением скорости утечки протонов через митохондриальную мембрану в интактных клетках, что сопоставимо с состоянием 4 пермеабилизированных клеток (без АДФ) (рис. 2Б). В случае интактных клеток (непермеабилизированных) это количество указывает на долю базального митохондриального потребления кислорода, которая не зависит от синтеза АТФ. Максимальная частота дыхания достигается после добавления нескольких доз FCCP. В интактных клетках зависит от двух факторов; активность электронно-транспортных комплексов и количество митохондрий в каждой клетке. Состояние 3 пермеабилизированных клеток после добавления АДФ напоминает базальное дыхание интактной клетки при насыщенных концентрациях экзогенных субстратов (рис. 2Б)7. В таблице 2 приведен пример индексов, рассчитанных по записям на рисунке 4.

Figure 3
Рисунок 3: Определение оптимальной концентрации дигитонина для пермеабилизации сперматозоидов человека. Частоту дыхания измеряли при 37 °С в среде MRM с глутаматом, малатом и аденозиндифосфатом. (А) Репрезентативный след дыхания. Синяя линия показывает концентрацию О2, а красная линия представляет коррелированную концентрациюО2 на объем. (B) Частота митохондриального дыхания означает ± стандартную ошибку, n = 4. Красная стрелка обозначает оптимальную концентрацию. Аббревиатура: dig = digitonin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные дыхательные следы для скорости потребления кислорода, полученные с помощью прибора «Ороборос». Частоту дыхания измеряли при 37 °C в (A,B) интактных и (C,D) пермеабилизированных клетках. Синяя линия показывает концентрацию О2, а красная линия представляет коррелированную концентрациюО2 на объем. Показатели в A, C и D были измерены с помощью более чем 30 x 10 6 сперматозоидов, в то время как скорость в B была измерена с помощью 14 x 106 сперматозоидов. Сокращения: Олиго = олигомицин; FCCP = карбонильцианид --трифторметоксифенилгидразон; Glu/Mal = глутамат/малат; АДФ = аденозиндифосфат; АА = антимицин А; Гниль = ротенон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав сред BWW и MRM для экспериментов с интактными или пермеабилизированными клетками соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Репрезентативные примеры индексов HRR. Данные были получены из трасс, показанных на рисунке 4. Индексы рассчитывались в соответствии с рисунком 2 и разделом 3 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HRR критически зависит от нескольких этапов: (а) техническое обслуживание оборудования, (б) точная калибровка датчиков кислорода, (в) титрование развязки26 и, наконец, (г) адекватное использование индексов, представляющих митохондриальную функцию. Техническое обслуживание оборудования имеет решающее значение. Рекомендуется регулярно заменять мембраны полярографического датчика кислорода и корректировать инструментальный фон. Тщательная промывка после забора сперматозоидов из камер необходима для получения хороших репликаций, особенно в лабораториях, в которых инструменты часто используются для анализа различных тканей или клеток. Сперматозоиды чувствительны даже к небольшим количествам ротенона, АА, олигомицина и FCCP, поэтому этап промывки должен быть выполнен осторожно (не менее трех раз с этанолом и еще три раза с дистиллированной водой). Калибровка является важным этапом; Она должна выполняться каждый день и для каждого из используемых носителей (см. шаг протокола 2.2). Титрование с развязкой должно выполняться осторожно, так как для достижения максимальной стимуляции потока и предотвращения чрезмерного титрования, которое парадоксальным образом ингибирует дыхание27, необходимо использовать оптимальные концентрации развязывающих устройств. Оптимальная концентрация разбавителя зависит от типа ячейки, концентрации клеток и среды и отличается для пермеабилизированных клеток по сравнению с интактными ячейками14. Таким образом, в случае образцов спермы, в которых сперматозоиды могут быть неоднородными, разъединитель должен быть адаптирован к каждому образцу28,29,30. После респирометрии получается несколько параметров, которые перед анализом необходимо скорректировать на количество клеток. Вычисляются три индекса, которые позволяют интерпретировать функцию митохондрий, и их преимущество заключается в том, что они не зависят от количества митохондрий и клеток. Мы подчеркиваем использование коэффициента респираторного контроля (RCR), который указывает на эффективность митохондриального связывания и чувствителен к множественным потенциальным участкам дисфункции7. Однако в зависимости от эксперимента31 могут быть использованы и другие параметры и индексы.

Ограничения HRR заключаются в следующем: (а) устройство не автоматизировано, поэтому требует постоянного присутствия оператора и занимает много времени; (b) аппарат HRR имеет только две камеры, и одновременно могут выполняться только два анализа; (c) камеры не являются одноразовыми и могут быть загрязнены ингибиторами или другими тканями; (d) несмотря на то, что чувствительность прибора очень высока, наша команда обнаружила, что для обнаружения изменений в потреблении кислорода требуется не менее 12 миллионов/мл сперматозоидов, поэтому мы не могли измерить сперматозоиды олигозооспермных мужчин; и (e) оператор должен знать, что измерения проводятся для всех клеток, присутствующих в образцах. Образцы спермы неоднородны и содержат другие типы клеток (например, лейкоциты). Во избежание контаминации необходимо использовать образцы с низкими концентрациями лейкоцитов7. В качестве альтернативы перед экспериментами с оксиметром может быть проведена дополнительная стадия очистки сперматозоидов (например, плавание вверх или плавание)24.

Альтернативой HRR является использование анализатора внеклеточного потока. Преимущества анализатора внеклеточного потока перед оксиграфом высокого разрешения для измерения метаболизма сперматозоидов заключаются в следующем: (а) анализатор внеклеточного потока является в значительной степени автоматизированным прибором; (b) он может измерять потребление кислорода в 24-луночных и 96-луночных планшетах для высокопроизводительного скрининга, что означает, что для него требуется меньшее количество биологических образцов; и (c) позволяет дополнительно измерять гликолитический поток сперматозоидов. Некоторые преимущества HRR по сравнению с анализатором внеклеточного потока заключаются в следующем: (а) при использовании HRR стоимость прибора и расходных материалов ниже; (b) при использовании HRR не требуется три-четыре повторения каждого измерения, как в анализаторе внеклеточного потока, для которого эти реплики необходимы для решения проблемы высокой вариабельности флуоресценции; (c) осуществимость протоколов титрования ингибиторов с субстратом с HRR является высокой; и (c) клетки контролируются в движении, а не прикреплены. С помощью оксиметрии можно проанализировать потребление кислорода подвижными (живыми) и интактными (непроницаемыми) сперматозоидами 7,31,32. Это является преимуществом в случае сперматозоидов, поскольку прилипание сперматозоидов к пластиковой поверхности может потенциально изменить их движения и функции.

HRR более чувствителен, чем обычная респирометрия, и подходит для медицинского использования в сперматозоидах человека, для которых количество клеток из каждого образца спермы не может быть увеличено (например, культивируемые клетки). Этот метод может быть использован для мониторинга дыхания сперматозоидов из большинства образцов спермы, как нормальных, так и бесплодных мужчин. RCR может быть использован в качестве хорошего индикатора функционального состояния сперматозоидов человека, а пороговое значение 3,15 (чувствительность и специфичность 73% и 61% соответственно) позволяет различать образцы спермы с нормальным и аномальным обычным анализом спермы32. HRR может быть использован для понимания митохондриального метаболизма сперматозоидов, который может быть ответственен за мужское бесплодие, и быть дополнением к стандартному анализу спермы.

Новейшее новое поколение приборов Oroboro позволяет анализировать потребление кислорода в сочетании с другими функциями сперматозоидов, такими как выработкаH2O2, и может помочь понять функцию сперматозоидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить андрологическую клинику Fertilab, особенно Хосе Марию Монтеса и Андреа Торрентса, за то, что они предоставили нам доступ к донорам. Финансирование: A.C. поддерживается грантами Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Дополнительное финансирование было получено от Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Уругвай). P.I. и R.S. поддерживаются Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 и FMV_1_2017_1_136490 ANII-Уругвай). P.I. поддерживается POS_FMV_2018_1_1007814 и CAP-UDELAR 2020. Рисунки проиллюстрированы с помощью Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
  3. Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
  4. Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
  5. Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
  6. Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
  7. Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
  8. Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
  9. Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
  10. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
  11. Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
  12. Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
  13. Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
  14. Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
  17. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  18. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  19. Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
  20. Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
  21. Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
  22. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
  23. Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
  24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
  25. Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
  26. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
  27. Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
  28. Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
  29. Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
  30. Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
  31. Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
  32. Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).

Tags

Респирометрия высокого разрешения функция митохондрий сперматозоиды человека качество спермы анализ спермы мужское бесплодие митохондриальная активность сперматозоидов потребление кислорода закрытокамерная система качество спермы митохондрии сперматозоидов интактные сперматозоиды пермеабилизированные сперматозоиды комплексы дыхательных цепей оксиграф высокого разрешения концентрация кислорода скорость потребления кислорода дыхательные индексы

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Респирометрия высокого разрешения для оценки функции митохондрий в сперматозоидах человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter