Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Högupplöst respirometri för att bedöma mitokondriell funktion hos humana spermier

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

Analys av spermiernas mitokondriella funktion med högupplöst respirometri gör det möjligt att mäta syreförbrukningen hos fritt rörliga spermier i ett system med sluten kammare. Tekniken kan användas för att mäta andning i mänskliga spermier, vilket ger information om spermiernas mitokondriella egenskaper och integritet.

Abstract

Spermakvaliteten studeras ofta genom rutinmässig spermaanalys, som är beskrivande och ofta ofullständig. Manlig infertilitet är förknippad med förändrad mitokondriell aktivitet hos spermier, så mätningen av spermiernas mitokondriella funktion är en indikator på spermiekvalitet. Högupplöst respirometri är en metod för att mäta syreförbrukningen hos celler eller vävnader i ett slutet kammarsystem. Denna teknik kan implementeras för att mäta andning i mänskliga spermier och ger information om kvaliteten och integriteten hos spermiernas mitokondrier. Högupplöst respirometri gör att cellerna kan röra sig fritt, vilket är en a priori-fördel när det gäller spermier. Denna teknik kan tillämpas med intakta eller permeabiliserade spermier och möjliggör studier av intakta spermiers mitokondriella funktion och aktiviteten hos enskilda andningskedjekomplex. Det högupplösta oxigrafinstrumentet använder sensorer för att mäta syrekoncentrationen i kombination med känslig programvara för att beräkna syreförbrukningen. Uppgifterna används för att beräkna andningsindex baserat på syreförbrukningskvoterna. Följaktligen är indexen proportionerna av två syreförbrukningshastigheter och är internt normaliserade till cellantalet eller proteinmassan. De respiratoriska indexen är en indikator på spermiernas mitokondriella funktion och dysfunktion.

Introduction

Manlig infertilitet beräknas stå för 40-50 % av alla fall av infertilitet hos par1. Konventionell spermaanalys spelar en avgörande roll för att bestämma manlig fertilitet; Cirka 15 % av infertila män har dock normala spermieparametrar2. Dessutom ger rutinmässig spermaanalys begränsad information om spermiernas funktion och återspeglar inte subtila spermiedefekter3.

Spermiernas mitokondrier har en speciell struktur, eftersom de är ordnade som ett spiralformat hölje runt flagellen. Mitokondrierskidan innehåller ett varierande antal mitokondrier som är förbundna med intermitokondriella länkar och förankrade i cytoskelettet genom ordnade proteinarrangemang på det yttre mitokondriemembranet 4,5. Denna struktur gör det särskilt svårt att isolera spermiernas mitokondrier. Därför använder de flesta studier av spermiers mitokondriella funktion in situ-analyser eller demembranerade spermier6.

Spermiernas mitokondriella struktur och funktion har konsekvent kopplats till manlig infertilitet 7,8,9,10,11, vilket tyder på att analys av strukturen och funktionen hos dessa organeller kan vara en bra kandidat för att ingå i spermieanalys.

Mitokondrier spelar en viktig roll i cellulär energimetabolism, särskilt genom att använda syre för att producera adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS). I synnerhet när det gäller spermier är källan till ATP (glykolys vs. OXPHOS) omtvistad, och mycket av data är fortfarande kontroversiella och beror på olika experimentella metoder 4,12,13. Mätningar av andning med oximetri ger betydande insikter om cellens mitokondriella andningskapacitet, mitokondriella integritet och energimetabolism14,15,16. Traditionellt har denna teknik utförts med hjälp av Clarks syrgaselektrod – ett instrument som har använts för att mäta mitokondriell andning i mer än 50 år17,18. Dessutom har spermiernas mitokondriella syreförbrukning analyserats med hjälp av den klassiska Clark-syrgaselektroden 19,20,21. Högupplöst respirometri (HRR) med hjälp av oxigrafer (Oroboros) ger högre känslighet än användning av klassiska respirometriapparater22. Oxigraferna består av två kammare med injektionsportar, och varje kammare har en polarografisk syresensor. Med denna teknik är det möjligt att analysera vävnadsglas, celler och isolerade mitokondriella suspensioner. Provet rörs kontinuerligt om i kammaren, och under experimentet mäts syreförbrukningen och syrehastigheterna beräknas med hjälp av specifik programvara. Kamrarna visar minskat syreläckage, vilket är en fördel jämfört med de konventionella syrgaselektroderna14,23.

Liksom för andra celler är känsligheten hos HRR-utrustning högre när det gäller spermier än för konventionell respirometri, vilket innebär att HRR-utrustning kan användas för analys av ett begränsat antal intakta eller permeabiliserade spermier. Det finns två huvudstrategier för att bedöma spermiernas mitokondriella funktion med HRR: (a) mätning av syreförbrukningen i intakta celler, vilket innebär att reproducera andningsfunktionen i ett medium som innehåller substrat såsom glukos, eller (b) mätning av syreförbrukningen i permeabiliserade celler med hjälp av ett av OXPHOS-komplexen, med tillägg av specifika substrat för att övervaka varje funktion separat.

I den aktuella studien beskriver vi användningen av HRR för att bestämma mitokondriell andning i humana spermier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimenten godkändes av den etiska kommittén vid Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde för högupplöst respirometri för att bedöma mitokondriell funktion i intakta och permeabiliserade mänskliga spermier. Protokollet delades in i fyra olika steg: 1) beredning av provet, 2) syrekalibrering i Oroboros-instrumentet, 3) mätning av syreförbrukning för intakta och permeabiliserade celler, och 4) dataextraktion från utrustningen och analys. Förkortningar: CASA = datorstödd spermaanalys; BWW = Biggers Whitten Whittingham medium; MRM = mitokondriellt respirationsmedium; ADP = adenosindifosfat, FCCP = karbonylcyanid -p-trifluorometoxifenylhydrazon AA = antimycin A. Klicka här för att se en större version av denna figur.

OBS: Arbetsflödet för att mäta syreförbrukningen i spermier med HRR visas i figur 1. Information om material, utrustning och reagenser som används i protokollet presenteras i materialtabellen.

1. Beredning av prover

  1. Provtagning
    1. Samla in nyejakulerad mänsklig sperma genom onani efter en rekommenderad 3 dagars avhållsamhet i en steril plastbehållare. Transportera proverna omedelbart till laboratoriet.
    2. Inkubera proverna i 30-60 minuter vid rumstemperatur (RT) för att göra dem helt flytande24.
    3. Efter förvätskning förvaras proverna vid 37 °C tills försöket börjar.
  2. Spermievärdering med datorstödd spermaanalys (CASA)
    1. Blanda provet och fyll på 7 μL i en förvärmd spermieräkningskammare.
    2. Placera kammaren på den förvärmda (37 °C) stage av ett direkt ljusmikroskop.
    3. Öppna den datoriserade programvaran för spermaanalys och ange motilitets- och koncentrationsmodulen (klicka på Mot).
    4. Välj den konfiguration som motsvarar mänskliga spermieförhållanden.
      OBS: Konfigurationen måste anpassas till kammarens typ och djup samt till provarterna och systemet CASA.
    5. Analysera slumpmässigt 10 olika fält per kammare genom att klicka på knappen Analysera .
    6. Klicka på Resultat för att få provkoncentration och motilitet.
  3. Förberedelse av celler
    OBS: Om HRR inte är kalibrerad, börja med steg 2.1-2.2 innan du förbereder cellerna (steg 1.3). Det är viktigt att mäta syreförbrukningen omedelbart när spermierna återsuspenderas i mediet.
    1. Centrifugera proverna vid 400 x g i 10 minuter vid RT.
    2. Avlägsna sädesplasman och återsuspendera spermierna i 2 ml Biggers Whitten Whittingham (BWW) för experiment med intakta celler eller mitokondriellt andningsmedium (MRM) för studier med permeabiliserade celler. Mediets sammansättning visas i tabell 1.
    3. Upprepa stegen som beskrivs i steg 1.2 för studier av spermiekoncentrationen.

2. Högupplöst respirometri: OXPHOS-analys

OBS: HRR integrerar mycket känsliga oxigrafer (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Österrike) med programvara (DatLab, version 4.2; Oroboros Instruments GmbH). Experimentella data visas som syrekoncentration kontra tid (som pmol för O2/106 celler ·min−1) och som realtidstransformationer av dessa data, vilket gör det möjligt för experimentledaren att spåra andningen (syreförbrukning, syreflöde) av biologiska och biokemiska prover medan experimentet fortfarande körs. HRR kan användas för att följa andningen hos levande och rörliga celler, vilket är särskilt användbart för spermier, vars rörlighet är förknippad med spermiekvalitet och fertilitetspotential. Laboratoriet använder en HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, med två kammare. Stegen som beskrivs i detta protokoll måste utföras oberoende av varandra för båda 2 ml-kamrarna.

  1. Förberedelse av utrustning
    1. Slå på HRR och anslut den till andningsprogramvaran (DatLab) för datainsamling och analys.
    2. Byt ut 70 % etanol i oxigrafkammaren mot ddH2O. Rör om kontinuerligt med den magnetiska omrörarstången i kammaren vid 750 rpm. Låt stå i 10 minuter och aspirera den dubbeldestillerade (dd) H2O efteråt.
    3. Tvätta kammaren tre gånger med ddH2O i 5 minuter varje gång.
      OBS: Detta steg är nödvändigt för att ta bort den återstående etanolen från kamrarna. Spermier är mycket känsliga för etanol. Inspelningen kan komprometteras om det här steget utelämnas.
  2. Kalibrering av syrgassensorerna
    OBS: Kalibreringsproceduren varierar något beroende på instrumentet. Utför en luftkalibrering av den polarografiska syresensorn enligt tillverkarensbeskrivning 25. I det här avsnittet förklaras kalibreringsprotokollet kortfattat.
    1. Ta bort ddH 2 O och pipettera2ml av samma medium som används för cellberedningen in i kammaren. Placera propparna och lämna en luftväxlingsbubbla.
      OBS: Det är viktigt att känna till kammarens volym för att bestämma den exakta volymen medium som behövs.
    2. Registrera syrekalibreringsvärdena (klicka på Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) för att övervaka sensormembranets prestanda genom att röra om mediet med omrörningsstången vid 750 rpm i minst 30 minuter vid 37 °C. Använd de andra inställningarna som nämnts: förstärkning för sensor: 2; polarisationsspänning: 800 mV; Registreringsintervall: 2,0 s.
      OBS: Den förväntas få enO2-lutning okorrigerad (röd linje) inom ±2 pmol−1∙ml−1 med en stabil signal från den polarografiska sensorn.
    3. Dra musen samtidigt som du håller ned vänster musknapp och skifttangenten för att välja ett område där förändringen i syrekoncentration (Y1 O2-koncentration, blå linje) är stabil.
    4. Öppna fönstret O2 Calibration (klicka på Oxygraph > O2 Calibration). I Luftkalibrering ändrar du den valda markeringen till den region som valdes i steg 2.2.3. Avsluta med att klicka på Kalibrera och kopiera till Urklipp.
    5. Stoppa inspelningen och spara genom att klicka på Oxygraph > Ok Control > Spara och koppla från.
      OBS: Denna datauppsättning måste sparas så att den kan användas i alla dagens experiment. Kalibreringen utförs endast en gång per dag för varje medium.
  3. Titrering av digitoninpermeabilisering
    1. Öppna kammaren och aspirera mediet inuti.
    2. Fyll på minst 24 x 10 6 och högst 70 x 106 spermier i kammaren i en slutlig volym på 2 ml MRM.
      OBS: Det är viktigt att mäta antalet celler i kammaren för att justera syreförbrukningen i slutet av experimentet. Ett lägre antal celler än vad som rekommenderas kan inte mätas.
    3. Stäng kammaren genom att trycka in propparna hela vägen in och aspirera den återstående vätskan i toppen. Starta experimentet med samma inställningar som för kalibreringen: omrörningshastighet: 750 varv/min; temperatur: 37 °C; förstärkning för sensor: 2; polarisationsspänning: 800 mV; och dataregistreringsintervall: 2,0 s.
    4. För att ladda kalibreringen, dubbelklicka på Pos Calib-rutan i det nedre hörnet. Öppna kalibreringen som utfördes i steg 2.2 (klicka på Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File) och klicka på Kalibrera och kopiera till Urklipp.
      OBS: POS Calib-rutan ändras från gul till grön. Data visas i syreflödeskorrigerade per volymdiagram (Layout 05 Flöde per volym okorrigerad). Olika layouter finns i Oxygraph > Layout.
    5. Tillsätt 5 μl 0,5 M adenosindifosfat (ADP), 10 μL 2 M glutamat och 2,5 μL 0,4 M malat (slutliga koncentrationer: 1,25 mM, 10 mM och 0,5 mM). Mät syreförbrukningen tills signalen stabiliseras.
      OBS: Precision Hamilton mikrosprutor används för injektion genom laddningsöppningen i proppen. Använd en spruta per läkemedel för att undvika korskontaminering. Klicka på F4 för att registrera dig, och markera i syrgasregistret när en behandling läggs till.
      OBS: Underlagen bereds i ultrarent vatten och förvaras vid −20 °C i 3 månader.
    6. Tritera genom att tillsätta 1 μl 10 mM digitonin i successiva steg tills syreförbrukningen når en maximal nivå.
      OBS: Noggrann tvätt med vatten, 70 % etanol och 100 % etanol är viktigt om samma kammare används för två experiment på samma dag.
      OBS: Digitonin bereds i ultrarent vatten och förvaras vid −20 °C i 3 månader.
  4. Rutinprotokoll för andningsbedömning av intakta och permeabiliserade spermier (komplex I eller komplex II)
    1. Öppna kammaren och aspirera mediet inuti.
    2. Fyll på minst 24 x 10 6 och högst 70 x 106 spermier i kammaren i en slutlig volym på 2 ml BWW (intact cell analysis) eller MRM (permeabiliserad cellanalys).
    3. Starta experimentet med samma inställningar som för kalibreringen (detta beskrivs i steg 2.3.3).
    4. Ladda kalibreringen som utfördes i steg 2.2 enligt beskrivningen i steg 2.3.4.
    5. Registrera cellernas andning i minst 5 minuter tills en stabil signal erhålls. Detta mått motsvarar basal respiration i intakta celler.
    6. Om experimentet är med intakta celler, gå vidare till steg 2.4.9. För permeabiliserade celler, injicera 4,5 μL 10 mM digitonin (slutlig koncentration: 22,5 μM). Permeabilisera cellerna i 5 min.
    7. Tillsätt substrat: 10 μL 2 M glutamat och 2,5 μL 0,4 M malat (slutliga koncentrationer: 10 mM respektive 0,5 mM) för komplex I eller 20 μL 1 M succinat (slutlig koncentration: 10 mM) för komplex II. Mät syreförbrukningen tills signalen ökar och stabiliseras. Detta är tillstånd 4, vilket betyder basalkomplex I eller basalkomplex II-stödd andning i frånvaro av ADP.
      OBS: Underlagen bereds i ultrarent vatten och förvaras vid −20 °C i 3 månader.
    8. Injicera 5 μl 0,5 M ADP (slutlig koncentration: 1,25 mM). Mät syreförbrukningen tills signalen ökar och stabiliseras. Tillsatsen av ADP ökar signalen som motsvarar den maximala syreförbrukningen genom komplex I eller komplex II (tillstånd 3, i permeabiliserade celler).
    9. Tillsätt 1 μl 4 mg/ml oligomycin (slutlig koncentration: 2 μg/ml), en ATP-syntetashämmare. Mät syreförbrukningen tills signalen minskar och stabiliseras.
      OBS: Oligomycin bereds i etanol och förvaras vid −20 °C i 3 månader.
    10. Titrera genom att tillsätta 1 μl 0,1 mM till 1 mM karbonylcyanid-P-trifluormetoxifenylhydrazon (FCCP) i successiva steg tills maximal okopplad andningshastighet uppnås. Mät syreförbrukningen tills signalen ökar och stabiliseras.
      OBS: FCCP bereds i etanol och förvaras vid −20 °C i 3 månader.
    11. Den slutliga koncentrationen av FCCP är provberoende. Sluta injicera läkemedlet när syreförbrukningen börjar minska.
    12. Injicera slutligen 1 μl 5 mM antimycin A (2,5 μM slutlig koncentration). Detta är en komplex III-hämmare för att skilja mellan mitokondriell och kvarvarande syreförbrukning (icke-mitokondriell andning). För analys av komplex I, tillsätt 1 μL 1 mM rotenon (0,5 μM slutlig koncentration), en hämmare av detta komplex, istället för AA. Mät syreförbrukningen tills signalen minskar och stabiliseras.
      OBS: Läkemedlen bereds i etanol och förvaras vid −20 °C i 3 månader.

3. Extrahering och analys av data

Figure 2
Figur 2: Insamling av andningsparametrar från ett högupplöst respirometriexperiment. (A,B) Schematiska representationer av erhållna grafer, enligt beskrivningen i figur 1, för intakta respektive permeabiliserade celler. Dessa parametrar har tidigare beskrivits15. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Dra musen genom att trycka på vänster musknapp och skifttangenten för att välja regioner där syreflödet per volym korrelerat (Y2 O2 lutning uncorr., röd linje) är stabilt efter injektion av ett substrat eller hämmare. Figur 2 visar de olika parametrar som erhållits från det tidigare beskrivna registret15.
    OBS: Parametrarna beror på experimentet; alla är följande: basal andning i intakta celler och andning i närvaro av glutamat/malat eller succinat (tillstånd 4), ADP (tillstånd 3), oligomycin (protonläckage), FCCP (maximal andningsfrekvens), rotenon/AA (icke-mitokondriell andning). I permeabiliserade celler motsvarar den basala andningen tillstånd 3.
  2. Klicka på fönstren Markeringar > statistik och exportera data.
  3. Normalisera de erhållna uppgifterna per 1 miljon spermier. Enheterna för lutningarna är pmolO2·s−1·mL−1·10−6 celler.
  4. Subtrahera den icke-mitokondriella syreförbrukningen från alla värden innan du beräknar indexen.
  5. Beräkna indexen med hjälp av de olika ekvationer som tidigare beskrivits15:
    Equation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestämning av den optimala koncentrationen av digitonin i spermier
I detta protokoll presenterar vi användningen av HRR för att övervaka realtidsförändringar i OXPHOS i humana spermier. Eftersom metoden kan användas för att analysera intakta eller digitoninpermeabiliserade spermier, presenterar vi först den standardisering av digitoninkoncentrationen som krävs för att permeabilisera spermier (Figur 3).

Digitonin används för kemisk permeabilisering, vilket gör att substrat kan komma in i celler, och för att mäta mitokondriell aktivitet. Denna förening måste titreras i intakta celler för att erhålla den optimala koncentration som krävs för att säkerställa cellmembranpermeabilisering utan att äventyra mitokondriell membranintegritet. Vi utförde en titrering i närvaro av ADP, glutamat och malat. Andningsfrekvensen mättes vid baslinjen och efter gradvis tillsats av digitonin (Figur 3A). Syreförbrukningen ökar med ökande tvättmedelskoncentration och når en punkt där integriteten hos det yttre mitokondriemembranet börjar äventyras (röd pil i figur 3A). Figur 3B visar medelvärdet ± medelfelet för 4 representativa experiment. Resultatet visar att permeabiliseringen är optimal vid en digitoninkoncentration på 22,5 μM (Figur 3A,B). Mitokondriell aktivitet minskar när för stora mängder digitonin används.

Representation av framgångsrikt och suboptimalt register för spermieandning med HRR
Vid övervakning av spermiernas mitokondriella andning kan registret visualiseras som O 2 -koncentration (blå linje) och O2 flöde per volym korrelerade (röd linje) beräknade med analysprogrammet DatLab 4 i både permeabiliserade och icke-permeabiliserade celler (Figur 4). Figur 4 visar representativa kurvor för intakta (figur 4A,B) och digitoninpermeabiliserade (figur 4C,D) spermier från ett spermaprov. Figur 4A visar en framgångsrik registrering av intakta spermier från ett spermaprov, där effekterna av läkemedel som modulerar syreförbrukningen observeras, och det är möjligt att extrahera parametrarna för att beräkna indexen. Basal andning registreras i intakta celler genom syreförbrukning i närvaro av exogena substrat. Därefter mättes den icke-fosforylerande respirationsfrekvensen genom tillsats av en ATP-syntashämmare (oligomycin). Därefter injicerades protonoforen FCCP i olika koncentrationer och den maximala mitokondriella okopplade andningshastigheten bestämdes. Detta läkemedel leder till en ökning av protonpermeabiliteten i det inre membranet, vilket gör att protonernas passiva rörelse kan skingra den kemiosmotiska gradienten som orsakar en ökning av syreförbrukningen. Slutligen tillsattes AA för att hämma mitokondriell andning.

Kvaliteten på de erhållna uppgifterna är nära relaterad till cellnumret. Det är viktigt att ha en hög basal syreförbrukning för att få ett bra register. Den efterföljande analysen beror på subtila förändringar iO2-förbrukningen som kanske inte detekteras om basallinjen inte är tillräckligt hög. Cellantal som är lägre än vad som rekommenderas kan leda till ett resultat som figur 4B.

Representativa kurvor som erhålls med hjälp av protokollet för komplexa I- eller II-specifika substrat visas i figur 4C respektive figur 4D. För att studera syreförbrukningen genom mitokondriekomplex I eller komplex II tillsattes substraten malat och glutamat eller succinat efter permeabilisering av cellerna. Därefter tillsätts ADP för omvandling till ATP (tillstånd 3, aktivt komplex I eller II-beroende andning). Slutligen administreras rotenon eller AA för att hämma komplex I respektive II.

För tolkning av resultaten är det viktigt att ta hänsyn till att cellandning hämmad av oligomycin är ett direkt mått på protonläckage över mitokondriemembranet i intakta celler, vilket är jämförbart med tillstånd 4 för permeabiliserade celler (utan ADP) (Figur 2B). När det gäller intakta celler (icke-permeabiliserade) indikerar denna mängd den andel av den basala mitokondriella syreförbrukningen som är oberoende av ATP-syntesen. Den maximala andningsfrekvensen uppnås efter tillägg av flera doser FCCP. I intakta celler beror på två faktorer; aktiviteten hos elektrontransportkomplexen och antalet mitokondrier i varje cell. Tillstånd 3 av permeabiliserade celler efter tillsats av ADP liknar basal respiration av den intakta cellen vid mättande koncentrationer av exogena substrat (Figur 2B)7. Tabell 2 visar ett exempel på index som beräknats utifrån posterna i figur 4.

Figure 3
Figur 3: Bestämning av den optimala koncentrationen av digitonin för permeabilisering av humana spermier. Andningsfrekvensen uppmättes vid 37 °C i MRM-medium med glutamat, malat och adenosindifosfat. (A) Representativa spår i luftvägarna. Den blå linjen är O 2 -koncentrationen och den röda linjen representerar O2 -flödet per volym korrelerad. (B) Mitokondriernas andningsfrekvens betyder ± standardfel, n = 4. Den röda pilen representerar den optimala koncentrationen. Förkortning: dig = digitonin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativa andningsspår för syreförbrukningshastigheten erhållen med Oroboros-instrumentet. Andningsfrekvensen uppmättes vid 37 °C i (A,B) intakta och (C,D) permeabiliserade celler. Den blå linjen är O 2 -koncentrationen och den röda linjen representerar O2 -flödet per volym korrelerad. Frekvensen i A, C och D mättes med mer än 30 x 10 6 spermier, medan frekvensen i B mättes med 14 x 106 spermier. Förkortningar: Oligo = oligomycin; FCCP = karbonylcyanid -p-trifluorometoxifenylhydrazon Glu/Mal = glutamat/malat; ADP = adenosindifosfat, AA = antimycin A; Röta = rotenon. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Sammansättning av BWW- och MRM-medier för experiment med intakta respektive permeabiliserade celler. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Representativa exempel på HRR-index. Data erhölls från de spår som visas i figur 4. Indexen har beräknats enligt figur 2 och protokoll avsnitt 3. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HRR är kritiskt beroende av flera steg: (a) underhållet av utrustningen, (b) noggrann kalibrering av syresensorerna, (c) titreringen av frånkopplaren26, och slutligen, (d) adekvat användning av index som representerar mitokondriell funktion. Underhållet av utrustningen är avgörande. Det rekommenderas att byta ut membranen på den polarografiska syresensorn regelbundet och att korrigera den instrumentella bakgrunden. Omfattande tvättning efter insamling av spermier från kamrarna är avgörande för att få bra replikat, särskilt i laboratorier där instrumenten ofta används för att analysera olika vävnader eller celler. Spermier är känsliga för även små mängder rotenon, AA, oligomycin och FCCP, så tvättsteget måste utföras noggrant (minst tre gånger med etanol och ytterligare tre gånger med destillerat vatten). Kalibrering är ett avgörande steg; Det måste utföras varje dag och för varje medium som används (se protokoll steg 2.2). Frånkopplingstitreringarna måste utföras noggrant, eftersom de optimala koncentrationerna av frånkopplare måste användas för att uppnå maximal stimulering av flödet och undvika övertitrering, vilket paradoxalt nog hämmar andningen27. Den optimala koncentrationen beror på celltyp, cellkoncentration och medium och är annorlunda för permeabiliserade celler jämfört med intakta celler14. När det gäller spermaprover, där spermierna kan vara heterogena, måste kopplaren anpassas till varje prov28,29,30. Efter respirometri erhålls flera parametrar som måste korrigeras för antalet celler före analys. Tre index beräknas som gör det möjligt att tolka mitokondriernas funktion, och dessa har fördelen att de är oberoende av antalet mitokondrier och celler. Vi belyser användningen av andningskontrollkvot (RCR), som indikerar effektiviteten av mitokondriell koppling och är känslig för flera potentiella platser för dysfunktion7. Andra parametrar och index kan dock användas beroende på experimentet31.

Begränsningarna för HRR är följande: (a) enheten är inte automatiserad, så den kräver ständig närvaro av en operatör och är tidskrävande; b) HRR-anordningen har endast två kammare och endast två analyser kan utföras samtidigt. c) Kamrarna är inte avsedda för engångsbruk och kan vara kontaminerade med inhibitorer eller annan typ av vävnad. (d) Även om instrumentets känslighet är mycket hög, fann vårt team att minst 12 miljoner/ml spermier krävs för att upptäcka variationer i syreförbrukningen, så vi kunde inte mäta spermier från oligozoospermiska män; e) Operatören måste vara medveten om att mätningarna avser alla celler som finns i proverna. Spermaprover är heterogena och innehåller andra celltyper (t.ex. leukocyter). För att undvika kontaminering är det nödvändigt att använda prover med låga koncentrationer av leukocyter7. Alternativt kan ytterligare ett spermiereningssteg utföras före oximeterexperimenten (t.ex. swim-up eller swim-down)24.

Ett alternativ till HRR är användningen av den extracellulära flödesanalysatorn. Fördelarna med den extracellulära flödesanalysatorn jämfört med den högupplösta oxigrafen för mätning av spermiemetabolism är följande: (a) den extracellulära flödesanalysatorn är ett till stor del automatiserat instrument; b) Den kan mäta syreförbrukningen i plattor med 24 och 96 brunnar för screening med hög kapacitet, vilket innebär att det krävs mindre mängder biologiska prover. c) Det gör det möjligt att ytterligare mäta spermiernas glykolytiska flöde. Några fördelar med HRR jämfört med den extracellulära flödesanalysatorn är följande: (a) med HRR är kostnaden för instrumentet och förbrukningsvaror lägre; b) Vid HRR krävs inte tre till fyra replikat av varje mätning på samma sätt som i den extracellulära flödesanalysatorn, för vilken dessa replikat behövs för att hantera den höga fluorescensvariabiliteten. c) Titreringsprotokollen för substratfrikopplande inhibitorer med HRR är mycket genomförbara. c) Cellerna övervakas i rörelse och sitter inte fast. Oximetri kan analysera syreförbrukningen hos rörliga (levande) och intakta (icke-permeabiliserade) spermier 7,31,32. Detta är en fördel när det gäller spermier eftersom spermiernas vidhäftning till plastytan potentiellt kan förändra deras rörelsemönster och funktion.

HRR är känsligare än konventionell respirometri och är lämplig för medicinsk användning i humana spermier, för vilka antalet celler från varje spermaprov inte kan ökas (t.ex. odlade celler). Denna teknik kan användas för att övervaka spermieandningen från de flesta spermaprover, både från normala och infertila män. RCR kan användas som en bra indikator på mänskliga spermiers funktionsstatus, och ett gränsvärde på 3,15 (sensitivitet och specificitet på 73 % respektive 61 %) skiljer mellan spermaprover med normal och onormal konventionell spermaanalys32. HRR kan användas för att förstå spermiernas mitokondriella metabolism, som kan vara ansvarig för manlig infertilitet, och vara ett komplement till standardanalys av sperma.

Den senaste nya generationen av Oroboro-instrument möjliggör analys av syreförbrukning i samband med andra spermiefunktioner, såsom produktionen avH2O2, och kan hjälpa till att förstå spermiernas funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Fertilab Andrology-kliniken, särskilt José María Montes och Andrea Torrents, för att de gav oss tillgång till donatorer. Finansiering: A.C. stöds av bidrag från Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Ytterligare finansiering erhölls från Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. och R.S. stöds av Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 och FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. stöds av POS_FMV_2018_1_1007814 och CAP-UDELAR 2020. Siffrorna illustrerades med hjälp av Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
  3. Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
  4. Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
  5. Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
  6. Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
  7. Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
  8. Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
  9. Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
  10. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
  11. Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
  12. Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
  13. Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
  14. Gnaiger, E. Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J. A., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 325-352 (2008).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
  17. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  18. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  19. Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
  20. Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
  21. Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
  22. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
  23. Gnaiger, E. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration. , Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020).
  24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010).
  25. Gnaiger, E. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1. , Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021).
  26. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).
  27. Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
  28. Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
  29. Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
  30. Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
  31. Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
  32. Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).

Tags

Högupplöst respirometri mitokondriell funktion humana spermier spermakvalitet spermaanalys manlig infertilitet spermiemitokondriell aktivitet syreförbrukning slutna kammarsystem spermiekvalitet spermiemitokondrier intakta spermier permeabiliserade spermier andningskedjekomplex högupplöst oxigrafinstrument syrekoncentration syreförbrukningshastigheter andningsindex

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Högupplöst respirometri för att bedöma mitokondriell funktion hos humana spermier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter