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Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

Abstract

La calidad del semen a menudo se estudia mediante análisis de semen de rutina, que es descriptivo y a menudo no concluyente. La infertilidad masculina se asocia con una alteración de la actividad mitocondrial de los espermatozoides, por lo que la medición de la función mitocondrial de los espermatozoides es un indicador de la calidad del esperma. La respirometría de alta resolución es un método para medir el consumo de oxígeno de células o tejidos en un sistema de cámara cerrada. Esta técnica se puede implementar para medir la respiración en espermatozoides humanos y proporciona información sobre la calidad e integridad de las mitocondrias de los espermatozoides. La respirometría de alta resolución permite que las células se muevan libremente, lo que supone una ventaja a priori en el caso de los espermatozoides. Esta técnica se puede aplicar con espermatozoides intactos o permeabilizados y permite el estudio de la función mitocondrial de los espermatozoides intactos y la actividad de los complejos de cadenas respiratorias individuales. El instrumento oxígrafo de alta resolución utiliza sensores para medir la concentración de oxígeno junto con un software sensible para calcular el consumo de oxígeno. Los datos se utilizan para calcular los índices respiratorios en función de los índices de consumo de oxígeno. En consecuencia, los índices son las proporciones de dos tasas de consumo de oxígeno y se normalizan internamente al número de células o masa proteica. Los índices respiratorios son un indicador de la función y disfunción mitocondrial de los espermatozoides.

Introduction

Se estima que la infertilidad masculina representa entre el 40% y el 50% de todos los casos de infertilidad en las parejas1. El análisis de semen convencional juega un papel crucial en la determinación de la fertilidad masculina; sin embargo, aproximadamente el 15% de los hombres infértiles tienen parámetros espermatozoides normales2. Además, el análisis rutinario del semen proporciona información limitada sobre la función de los espermatozoides y no refleja defectos sutiles de los espermatozoides3.

Las mitocondrias de los espermatozoides tienen una estructura especial, ya que están dispuestas como una vaina helicoidal alrededor de los flagelos. La vaina mitocondrial contiene un número variable de mitocondrias conectadas por enlazadores intermitocondriales y ancladas al citoesqueleto mediante disposiciones proteicas ordenadas en la membrana mitocondrial externa 4,5. Esta estructura hace que sea particularmente difícil aislar las mitocondrias de los espermatozoides. Por lo tanto, la mayoría de los estudios de la función mitocondrial de los espermatozoides utilizan análisis in situ o espermatozoides desembranados6.

La estructura y función mitocondrial de los espermatozoides se ha relacionado consistentemente con la infertilidad masculina 7,8,9,10,11, lo que sugiere que el análisis de la estructura y función de estos orgánulos puede ser un buen candidato para su inclusión en el análisis de espermatozoides.

Las mitocondrias desempeñan un papel importante en el metabolismo energético celular, en particular mediante el uso de oxígeno para producir trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS). En los espermatozoides, en particular, la fuente de ATP (glucólisis vs. OXPHOS) es discutida, y gran parte de los datos siguen siendo controvertidos y dependen de diferentes enfoques experimentales 4,12,13. Las mediciones de la respiración por oximetría ofrecen información significativa sobre la capacidad respiratoria mitocondrial, la integridad mitocondrial y el metabolismo energético de la célula14,15,16. Tradicionalmente, esta técnica se ha realizado utilizando el electrodo de oxígeno Clark, un instrumento que se ha utilizado para medir la respiración mitocondrial durante más de 50 años17,18. Además, se ha analizado el consumo de oxígeno mitocondrial de los espermatozoides utilizando el electrodo de oxígeno clásico de Clark 19,20,21. La respirometría de alta resolución (HRR) con oxígrafos (Oroboros) proporciona una mayor sensibilidad que con los dispositivos de respirometría clásicos22. Los oxígrafos están compuestos por dos cámaras con puertos de inyección, y cada cámara tiene un sensor polarográfico de oxígeno. Con esta técnica, es posible analizar portaobjetos de tejidos, células y suspensiones mitocondriales aisladas. La muestra se agita continuamente en la cámara y, durante el experimento, se mide el consumo de oxígeno y se calculan las tasas de oxígeno utilizando un software específico. Las cámaras muestran una fuga de oxígeno reducida, lo que es una ventaja sobre los dispositivos convencionales de electrodos de oxígeno14,23.

Al igual que ocurre con otras células, en el caso de los espermatozoides, la sensibilidad de los equipos de HRR es mayor que la de la respirometría convencional, por lo que los equipos de HRR pueden utilizarse para el análisis de un número limitado de espermatozoides intactos o permeabilizados. Existen dos estrategias principales para evaluar la función mitocondrial de los espermatozoides mediante HRR: (a) medir el consumo de oxígeno en células intactas, lo que implica reproducir la función respiratoria en un medio que contiene sustratos como la glucosa, o (b) medir el consumo de oxígeno en células permeabilizadas utilizando uno de los complejos OXPHOS, con la adición de sustratos específicos para monitorizar cada función por separado.

En el presente estudio, describimos el uso de HRR para determinar la respiración mitocondrial en espermatozoides humanos.

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Protocol

Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo para la respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos intactos y permeabilizados. El protocolo se dividió en cuatro pasos diferentes: 1) preparación de la muestra, 2) calibración de oxígeno en el instrumento Oroboros, 3) medición del consumo de oxígeno para células intactas y permeabilizadas, y 4) extracción de datos del equipo y análisis. Abreviaturas: CASA = análisis de espermatozoides asistido por computadora; BWW = Biggers Whitten Whittingham medio; MRM = medio respiratorio mitocondrial; ADP = difosfato de adenosina; FCCP = cianuro de carbonilo -p- trifluorometoxifenilhidrazona; AA = antimicina A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: El flujo de trabajo para medir el consumo de oxígeno en los espermatozoides mediante HRR se muestra en la Figura 1. La información sobre los materiales, equipos y reactivos utilizados en el protocolo se presenta en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la muestra

  1. Recogida de muestras
    1. Recoja semen humano recién eyaculado mediante masturbación después de una abstinencia recomendada de 3 días en un recipiente de plástico estéril. Transportar las muestras inmediatamente al laboratorio.
    2. Incubar las muestras durante 30-60 min a temperatura ambiente (RT) para licuarlas completamente24.
    3. Después de la licuefacción, almacenar las muestras a 37 °C hasta que comience el experimento.
  2. Evaluación de espermatozoides con análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)
    1. Mezcle la muestra y cargue 7 μL en una cámara de recuento de espermatozoides precalentada.
    2. Coloque la cámara en la platina precalentada (37 °C) de un microscopio de luz directa.
    3. Abra el software de análisis de espermatozoides computarizado e ingrese al módulo de motilidad y concentración (haga clic en Mot).
    4. Seleccione la configuración que corresponda a las condiciones de los espermatozoides humanos.
      NOTA: La configuración debe adaptarse al tipo y profundidad de la cámara, así como a la especie de muestra y al sistema CASA.
    5. Analice aleatoriamente 10 campos diferentes por cámara haciendo clic en el botón Analizar .
    6. Haga clic en Resultados para obtener la concentración y la motilidad de la muestra.
  3. Preparación celular
    NOTA: Si el HRR no está calibrado, comience con los pasos 2.1-2.2 antes de preparar las celdas (paso 1.3). Es importante medir el consumo de oxígeno inmediatamente cuando los espermatozoides se resuspenden en el medio.
    1. Centrifugar las muestras a 400 x g durante 10 min a RT.
    2. Extraer el plasma seminal y resuspender los espermatozoides en 2 ml de Biggers Whitten Whittingham (BWW) para experimentos con células intactas o medio de respiración mitocondrial (MRM) para estudios con células permeabilizadas. Las composiciones de los medios se muestran en la Tabla 1.
    3. Repita los pasos descritos en el paso 1.2 para los estudios de concentración de espermatozoides.

2. Respirometría de alta resolución: análisis OXPHOS

NOTA: HRR integra oxígrafos de alta sensibilidad (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Austria) con software (DatLab, versión 4.2; Oroboros Instruments GmbH). Los datos experimentales se muestran como la concentración de oxígeno en función del tiempo (como pmol de O2/106 células·min−1) y como transformaciones en tiempo real de estos datos, lo que permite al experimentador realizar un seguimiento de la respiración (consumo de oxígeno, flujo de oxígeno) de muestras biológicas y bioquímicas mientras el experimento aún está en marcha. La HRR se puede utilizar para seguir la respiración de las células vivas y móviles, lo que es particularmente útil para los espermatozoides, cuya motilidad está asociada con la calidad del esperma y el potencial de fertilidad. El laboratorio utiliza un HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, con dos cámaras. Los pasos descritos en este protocolo deben realizarse de forma independiente para ambas cámaras de 2 ml.

  1. Preparación del equipo
    1. Encienda el HRR y conéctelo al software de respirometría (DatLab) para la adquisición y el análisis de datos.
    2. Reemplace el etanol al 70% en la cámara del oxígrafo con ddH2O. Remuévalo continuamente con la barra de agitación magnética en la cámara a 750 rpm. Déjalo reposar durante 10 minutos y luego aspira el H2O de doble destilación (dd).
    3. Lave la cámara tres veces con ddH2O durante 5 minutos cada vez.
      NOTA: Este paso es necesario para eliminar el etanol restante de las cámaras. Los espermatozoides son muy sensibles al etanol. La grabación podría verse comprometida si se omite este paso.
  2. Calibración de los sensores de oxígeno
    NOTA: El procedimiento de calibración varía ligeramente según el instrumento. Realice una calibración de aire del sensor polarográfico de oxígeno como lo describe el fabricante25. En esta sección, se explica brevemente el protocolo de calibración.
    1. Retire el ddH 2 O y pipetee2ml del mismo medio utilizado para la preparación celular en la cámara. Coloque los tapones, dejando una burbuja de intercambio de aire.
      NOTA: Es importante conocer el volumen de la cámara para determinar el volumen exacto de medio necesario.
    2. Registre los valores de calibración de oxígeno (haga clic en Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) para controlar el rendimiento de la membrana del sensor agitando el medio con la barra de agitación a 750 rpm durante al menos 30 minutos a 37 °C. Utilice los otros ajustes mencionados: ganancia para el sensor: 2; voltaje de polarización: 800 mV; Intervalo de registro de datos: 2,0 s.
      NOTA: Se espera obtener una pendiente de O 2 no corregida (línea roja) dentro de ±2 pmol∙s−1∙mL−1 con una señal estable del sensor polarográfico.
    3. Arrastre el ratón mientras mantiene pulsado el botón izquierdo del ratón y la tecla Mayús para seleccionar un área en la que el cambio en la concentración de oxígeno (Concentración de O2 Y1, línea azul) sea estable.
    4. Abra la ventana Calibración de Ø2 (haga clic en Oxígrafo > Calibración de O2). En Calibración de aire, cambie la marca seleccionada a la región seleccionada en el paso 2.2.3. Termine haciendo clic en Calibrar y copiar al portapapeles.
    5. Detenga la grabación y guárdela haciendo clic en Oxygraph > Ok Control > Guardar y Desconectar.
      NOTA: Este conjunto de datos debe guardarse para que se pueda utilizar en todos los experimentos del día. La calibración solo se realiza una vez al día para cada medio.
  3. Valoración de la permeabilización de la digitonina
    1. Abra la cámara y aspire el medio en el interior.
    2. Cargue en la cámara al menos 24 x 10 6 y no más de 70 x 106 espermatozoides en un volumen final de 2 ml de MRM.
      NOTA: Es importante medir el número de células en la cámara para ajustar el consumo de oxígeno al final del experimento. No se puede medir un número de celdas inferior al recomendado.
    3. Cierre la cámara empujando los tapones hasta el fondo y aspire el líquido restante en la parte superior. Inicie el experimento con los mismos ajustes que para la calibración: velocidad de agitación: 750 rpm; temperatura: 37 °C; ganancia para el sensor: 2; voltaje de polarización: 800 mV; e intervalo de registro de datos: 2,0 s.
    4. Para cargar la calibración, haga doble clic en el cuadro Pos Calib en la esquina inferior. Abra la calibración realizada en el paso 2.2 (haga clic en Oxígrafo > Calibración de O2 > Copiar desde archivo) y haga clic en Calibrar y copiar al portapapeles.
      NOTA: La caja POS Calib cambiará de amarillo a verde. Los datos se muestran en gráficos de flujo de oxígeno corregido por volumen (Diseño 05 Flujo por volumen sin corregir). Hay diferentes diseños disponibles en Oxygraph > Layout.
    5. Añadir 5 μL de difosfato de adenosina (ADP) 0,5 M, 10 μL de glutamato 2 M y 2,5 μL de malato 0,4 M (concentraciones finales: 1,25 mM, 10 mM y 0,5 mM). Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal se estabilice.
      NOTA: Las microjeringas Hamilton de precisión se utilizan para la inyección a través del puerto de carga en el tapón. Use una jeringa por medicamento para evitar la contaminación cruzada. Haga clic en F4 para registrarse y marque en el registro de oxígeno cuando se agregue un tratamiento.
      NOTA: Los sustratos se preparan en agua ultrapura y se almacenan a -20 °C durante 3 meses.
    6. Tritato añadiendo 1 μL de 10 mM de digitonina en pasos sucesivos hasta que el consumo de oxígeno alcance un nivel máximo.
      NOTA: El lavado a fondo con agua, 70% de etanol y 100% de etanol es esencial si se utiliza la misma cámara para dos experimentos en el mismo día.
      NOTA: La digitonina se prepara en agua ultrapura y se almacena a -20 °C durante 3 meses.
  4. Protocolo de valoración respiratoria rutinaria de espermatozoides intactos y permeabilizados (complejo I o complejo II)
    1. Abra la cámara y aspire el medio en el interior.
    2. Cargue en la cámara al menos 24 x 10 6 y no más de 70 x 106 espermatozoides en un volumen final de 2 ml de BWW (análisis de células intactas) o MRM (análisis de células permeabilizadas).
    3. Inicie el experimento con la misma configuración que para la calibración (esto se describe en el paso 2.3.3).
    4. Cargue la calibración realizada en el paso 2.2 como se describe en el paso 2.3.4.
    5. Registre la respiración de las células durante al menos 5 minutos hasta obtener una señal estable. Esta medida corresponde a la respiración basal en células intactas.
    6. Si el experimento es con células intactas, continúe con el paso 2.4.9. Para células permeabilizadas, inyectar 4,5 μL de digitonina 10 mM (concentración final: 22,5 μM). Permeabilizar las células durante 5 min.
    7. Añadir los sustratos: 10 μL de glutamato 2 M y 2,5 μL de malato 0,4 M (concentraciones finales: 10 mM y 0,5 mM, respectivamente) para el complejo I o 20 μL de succinato 1 M (concentración final: 10 mM) para el complejo II. Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal aumente y se estabilice. Este es el estado 4, que significa respiración apoyada por el complejo basal I o el complejo basal II en ausencia de ADP.
      NOTA: Los sustratos se preparan en agua ultrapura y se almacenan a -20 °C durante 3 meses.
    8. Inyectar 5 μL de 0,5 M de ADP (concentración final: 1,25 mM). Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal aumente y se estabilice. La adición de ADP aumenta la señal correspondiente al consumo máximo de oxígeno a través del complejo I o del complejo II (estado 3, en células permeabilizadas).
    9. Añadir 1 μL de 4 mg/mL de oligomicina (concentración final: 2 μg/mL), un inhibidor de la ATP sintetasa. Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal disminuya y se estabilice.
      NOTA: La oligomicina se prepara en etanol y se almacena a -20 °C durante 3 meses.
    10. Valorar añadiendo 1 μL de 0,1 mM a 1 mM de cianuro de carbonilo-P-trifluorometoxi-fenilhidrazona (FCCP) en pasos sucesivos hasta alcanzar una tasa respiratoria desacoplada máxima. Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal aumente y se estabilice.
      NOTA: El FCCP se prepara en etanol y se almacena a -20 °C durante 3 meses.
    11. La concentración final de FCCP depende de la muestra. Deje de inyectarse la droga cuando el consumo de oxígeno comience a disminuir.
    12. Por último, inyectar 1 μL de 5 mM de antimicina A (concentración final de 2,5 μM). Se trata de un inhibidor del complejo III para discriminar entre el consumo de oxígeno mitocondrial y residual (respiración no mitocondrial). Para el análisis del complejo I, añadir 1 μL de 1 mM de rotenona (0,5 μM de concentración final), un inhibidor de este complejo, en lugar de AA. Mida el consumo de oxígeno hasta que la señal disminuya y se estabilice.
      NOTA: Los medicamentos se preparan en etanol y se almacenan a -20 °C durante 3 meses.

3. Extracción y análisis de datos

Figure 2
Figura 2: Adquisición de parámetros respiratorios a partir de un experimento de respirometría de alta resolución. (A,B) Representaciones esquemáticas de los gráficos obtenidos, como se describe en la Figura 1, para células intactas y permeabilizadas, respectivamente. Estos parámetros han sido descritos previamente15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Arrastre el ratón pulsando el botón izquierdo del ratón y la tecla Mayús para seleccionar las regiones en las que el flujo de oxígeno por volumen correlacionado (pendiente Y2 O2, línea roja) es estable después de la inyección de un sustrato o inhibidor. En la Figura 2 se muestran los diferentes parámetros obtenidos del registro anteriormente descrito15.
    NOTA: Los parámetros dependen del experimento; todos ellos son los siguientes: respiración basal en células intactas y respiración en presencia de glutamato/malato o succinato (estado 4), ADP (estado 3), oligomicina (fuga de protones), FCCP (frecuencia respiratoria máxima), rotenona/AA (respiración no mitocondrial). En las células permeabilizadas, la respiración basal corresponde al estado 3.
  2. Haga clic en las ventanas Marcas > Estadísticas y exporte los datos.
  3. Normalizar los datos obtenidos por 1 millón de espermatozoides. Las unidades de las pendientes son pmolO2·s−1·mL−1·10−6 células.
  4. Reste el consumo de oxígeno no mitocondrial de todos los valores antes de calcular los índices.
  5. Calcule los índices utilizando las diversas ecuaciones descritas anteriormente15:
    Equation 1

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Representative Results

Determinación de la concentración óptima de digitonina en los espermatozoides
En este protocolo, presentamos el uso de HRR para monitorizar en tiempo real los cambios en OXPHOS en espermatozoides humanos. Dado que el método se puede utilizar para analizar espermatozoides intactos o permeabilizados con digitonina, primero presentamos la estandarización de la concentración de digitonina necesaria para permeabilizar los espermatozoides (Figura 3).

La digitonina se utiliza para la permeabilización química, que permite que los sustratos entren en las células, y para medir la actividad mitocondrial. Este compuesto debe valorarse en células intactas para obtener la concentración óptima requerida para garantizar la permeabilización de la membrana celular sin comprometer la integridad de la membrana mitocondrial. Se realizó una valoración en presencia de ADP, glutamato y malato. Las frecuencias respiratorias se midieron al inicio y después de la adición gradual de digitonina (Figura 3A). El consumo de oxígeno aumenta con el aumento de la concentración de detergente y llega a un punto en el que la integridad de la membrana mitocondrial externa comienza a verse comprometida (flecha roja en la Figura 3A). La Figura 3B muestra la media ± el error estándar de 4 experimentos representativos. El resultado muestra que la permeabilización es óptima a una concentración de digitonina de 22,5 μM (Figura 3A,B). La actividad mitocondrial disminuye cuando se utilizan cantidades demasiado altas de digitonina.

Representación del registro exitoso y subóptimo de la respiración de los espermatozoides mediante HRR
Durante el monitoreo de la respiración mitocondrial de los espermatozoides, el registro se puede visualizar como la concentración de O2 (línea azul) y el flujo deO2 por volumen correlacionado (línea roja) calculados con el software de análisis DatLab 4 en células permeabilizadas y no permeabilizadas (Figura 4). La Figura 4 muestra curvas representativas de espermatozoides intactos (Figura 4A, B) y permeados a la digitonina (Figura 4C, D) de una muestra de semen. La Figura 4A representa un registro exitoso de espermatozoides intactos a partir de una muestra de semen, donde se observan los efectos de los fármacos moduladores del consumo de oxígeno, y es posible extraer los parámetros para el cálculo de los índices. La respiración basal se registra en células intactas por el consumo de oxígeno en presencia de sustratos exógenos. A continuación, se midió la frecuencia respiratoria no fosforilante mediante la adición de un inhibidor de la ATP sintasa (oligomicina). Posteriormente, se inyectó el protronóforo FCCP a diferentes concentraciones y se determinó la frecuencia respiratoria mitocondrial desacoplada máxima. Este fármaco conduce a un aumento de la permeabilidad de protones de la membrana interna, lo que permite que el movimiento pasivo de los protones disipe el gradiente quimiosmótico que provoca un aumento en el consumo de oxígeno. Finalmente, se agregó AA para inhibir la respiración mitocondrial.

La calidad de los datos obtenidos está estrechamente relacionada con el número de células. Es importante tener un alto consumo basal de oxígeno para obtener un buen registro. El análisis posterior depende de cambios sutiles en el consumo deO2 que pueden no detectarse si la línea basal no es lo suficientemente alta. Los recuentos de células inferiores a los recomendados podrían dar lugar a un resultado similar al de la Figura 4B.

Las curvas representativas obtenidas utilizando el protocolo para sustratos específicos complejos I o II se muestran en la Figura 4C y la Figura 4D, respectivamente. Para estudiar el consumo de oxígeno a través del complejo mitocondrial I o del complejo II, se añadieron los sustratos malato y glutamato o succinato después de la permeabilización de las células. A continuación, se añade ADP para su conversión a ATP (estado 3, respiración dependiente del complejo activo I o II). Finalmente, se administra rotenona o AA para inhibir el complejo I o II, respectivamente.

Para la interpretación de los resultados, es importante considerar que la respiración celular inhibida por la oligomicina es una medida directa de la tasa de fuga de protones a través de la membrana mitocondrial en células intactas, que es comparable al estado 4 de las células permeabilizadas (sin ADP) (Figura 2B). En el caso de células intactas (no permeabilizadas), esta cantidad indica la fracción del consumo basal de oxígeno mitocondrial que es independiente de la síntesis de ATP. La frecuencia respiratoria máxima se alcanza después de la adición de varias dosis de FCCP. En las células intactas depende de dos factores; la actividad de los complejos de transporte de electrones y el número de mitocondrias en cada célula. El estado 3 de las células permeabilizadas después de la adición de ADP se asemeja a la respiración basal de la célula intacta a concentraciones saturadas de sustratos exógenos (Figura 2B)7. En la Tabla 2 se muestra un ejemplo de los índices calculados a partir de los registros de la Figura 4.

Figure 3
Figura 3: Determinación de la concentración óptima de digitonina para la permeabilización de espermatozoides humanos. Las tasas de respiración se midieron a 37 °C en medio MRM con glutamato, malato y difosfato de adenosina. (A) Traza respiratoria representativa. La línea azul es la concentración de O2 y la línea roja representa el flujo deO2 por volumen correlacionado. (B) La tasa de respiración de las mitocondrias significa ± error estándar, n = 4. La flecha roja representa la concentración óptima. Abreviatura: dig = digitonina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Trazas respiratorias representativas de la tasa de consumo de oxígeno obtenida con el instrumento Oroboros. Las tasas de respiración se midieron a 37 °C en células (A,B) intactas y (C,D) permeabilizadas. La línea azul es la concentración de O2 y la línea roja representa el flujo deO2 por volumen correlacionado. Las tasas en A, C y D se midieron con más de 30 x 10 6 espermatozoides, mientras que la tasa en B se midió con 14 x 106 espermatozoides. Abreviaturas: Oligo = oligomicina; FCCP = cianuro de carbonilo -p- trifluorometoxifenilhidrazona; Glu/Mal = glutamato/malato; ADP = difosfato de adenosina; AA = antimicina A; Podredumbre = rotenona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición de los medios BWW y MRM para experimentos con células intactas o permeabilizadas, respectivamente. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Ejemplos representativos de índices HRR. Los datos se obtuvieron a partir de las trazas que se muestran en la Figura 4. Los índices se calcularon de acuerdo con la Figura 2 y la sección 3 del protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

La HRR depende críticamente de varios pasos: (a) el mantenimiento del equipo, (b) la calibración precisa de los sensores de oxígeno, (c) la valoración del desacoplador26 y, finalmente, (d) el uso adecuado de índices representativos de la función mitocondrial. El mantenimiento del equipo es crucial. Se recomienda reemplazar las membranas del sensor polarográfico de oxígeno con regularidad y corregir el fondo instrumental. El lavado exhaustivo después de la recolección de espermatozoides de las cámaras es esencial para obtener buenas réplicas, especialmente en laboratorios en los que los instrumentos se utilizan con frecuencia para analizar diversos tejidos o células. Los espermatozoides son sensibles incluso a pequeñas cantidades de rotenona, AA, oligomicina y FCCP, por lo que el paso de lavado debe realizarse con cuidado (al menos tres veces con etanol y otras tres veces con agua destilada). La calibración es un paso crucial; Debe realizarse todos los días y para cada uno de los medios utilizados (ver Protocolo Paso 2.2). Las valoraciones de los desacopladores deben realizarse con cuidado, ya que se deben utilizar las concentraciones óptimas de los desacopladores para lograr la máxima estimulación del flujo y evitar la sobrevaloración, que paradójicamente inhibe la respiración27. La concentración óptima del desacoplador depende del tipo de célula, la concentración celular y el medio, y es diferente para las células permeabilizadas en comparación con las células intactas14. Así, en el caso de las muestras de semen, en las que los espermatozoides pueden ser heterogéneos, el desacoplador debe adaptarse a cada muestra28,29,30. Después de la respirometría, se obtienen varios parámetros que deben corregirse por el número de células antes del análisis. Se calculan tres índices que permiten la interpretación de la función mitocondrial, y estos tienen la ventaja de ser independientes del número de mitocondrias y células. Destacamos el uso del índice de control respiratorio (RCR), que indica la eficiencia del acoplamiento mitocondrial y es sensible a múltiples sitios potenciales de disfunción7. Sin embargo, se pueden utilizar otros parámetros e índices dependiendo del experimento31.

Las limitaciones de HRR son las siguientes: (a) el dispositivo no está automatizado, por lo que requiere la presencia constante de un operador y requiere mucho tiempo; b) el dispositivo HRR sólo tiene dos cámaras y sólo pueden realizarse dos ensayos simultáneamente; c) las cámaras no son de un solo uso y pueden estar contaminadas con inhibidores u otro tipo de tejido; (d) aunque la sensibilidad del instrumento es muy alta, nuestro equipo encontró que se requieren al menos 12 millones/mL de espermatozoides para detectar variaciones en el consumo de oxígeno, por lo que no pudimos medir espermatozoides de varones oligozoospérmicos; y e) el operador debe ser consciente de que las mediciones se refieren a todas las células presentes en las muestras. Las muestras de semen son heterogéneas y contienen otros tipos de células (por ejemplo, leucocitos). Para evitar la contaminación, es necesario utilizar muestras con bajas concentraciones de leucocitos7. Alternativamente, se puede realizar un paso adicional de purificación de espermatozoides antes de los experimentos con el oxímetro (p. ej., nadar hacia arriba o hacia abajo)24.

Una alternativa a la HRR es el uso del analizador de flujo extracelular. Las ventajas del analizador de flujo extracelular sobre el oxígrafo de alta resolución para medir el metabolismo de los espermatozoides son las siguientes: a) el analizador de flujo extracelular es un instrumento en gran medida automatizado; b) puede medir el consumo de oxígeno en placas de 24 y 96 pocillos para un cribado de alto rendimiento, lo que significa que requiere cantidades más pequeñas de muestras biológicas; y (c) permite la medición adicional del flujo glucolítico de los espermatozoides. Algunas ventajas de la HRR sobre el analizador de flujo extracelular son las siguientes: (a) con la HRR, el costo del instrumento y los consumibles es menor; (b) con HRR, no se requieren tres o cuatro réplicas de cada medición como en el analizador de flujo extracelular, para el cual estas réplicas son necesarias para abordar la alta variabilidad de fluorescencia; (c) la viabilidad de los protocolos de valoración del inhibidor del desacoplador de sustrato con HRR es alta; y (c) las células se monitorean en movimiento y no están conectadas. La oximetría puede analizar el consumo de oxígeno de espermatozoides móviles (vivos) e intactos (no permeabilizados) 7,31,32. Esto es una ventaja en el caso de los espermatozoides, ya que la adhesión de los espermatozoides a la superficie plástica puede alterar potencialmente sus patrones de movimiento y función.

La HRR es más sensible que la respirometría convencional y es adecuada para uso médico en espermatozoides humanos, para los que no se puede aumentar el número de células de cada muestra de semen (como las células cultivadas). Esta técnica se puede utilizar para controlar la respiración de los espermatozoides de la mayoría de las muestras de semen, tanto de hombres normales como infértiles. El RCR puede ser utilizado como un buen indicador del estado funcional de los espermatozoides humanos, y un valor de corte de 3,15 (sensibilidad y especificidad del 73% y 61%, respectivamente) distingue entre muestras de semen con análisis de semen convencional normal y anormal32. La HRR podría utilizarse para comprender el metabolismo mitocondrial de los espermatozoides, que puede ser responsable de la infertilidad masculina, y ser un complemento del análisis de semen estándar.

La última generación de instrumentos Oroboro permite analizar el consumo de oxígeno junto con otras funciones de los espermatozoides, como la producción deH2O2, y podría ayudar a comprender la función de los espermatozoides.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Queremos agradecer a la clínica de Andrología Fertilab, especialmente a José María Montes y Andrea Torrents, por permitirnos el acceso a los donantes. Financiamiento: A.C. cuenta con el apoyo de becas de la Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Se obtuvo financiamiento adicional del Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. y R.S. cuentan con el apoyo de la Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 y FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. cuenta con el apoyo de POS_FMV_2018_1_1007814 y CAP-UDELAR 2020. Las figuras se ilustraron con Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

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References

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Tags

Respirometría de Alta Resolución Función Mitocondrial Espermatozoides Humanos Calidad del Semen Análisis de Espermatozoides Infertilidad Masculina Actividad Mitocondrial de los Espermatozoides Consumo de Oxígeno Sistema de Cámara Cerrada Calidad de los Espermatozoides Mitocondrias de los Espermatozoides Espermatozoides Intactos Espermatozoides Permeabilizados Complejos de Cadenas Respiratorias Instrumento de Oxígrafo de Alta Resolución Concentración de Oxígeno Tasas de Consumo de Oxígeno Índices Respiratorios

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos
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Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina,… More

Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

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