التكاثر والمواءمة في البحث باستخدام المعايير البيولوجية: مثال على الببتيد المرتبط بالكولاجين ناهض الصفائح الدموية

Summary

نقدم هنا طريقة لتوحيد الببتيد المرتبط بالكولاجين المرتبط بالصفائح الدموية (CRP-XL) باستخدام قياس تراكم انتقال الضوء. بينما يستهدف البروتوكول وظيفة الصفائح الدموية ، يمكن تطبيق العملية التجريبية على معظم الجزيئات البيولوجية والمقايسات الحيوية لضمان الدقة العلمية وقابلية التكاثر.

Abstract

علم القياس - علم القياس - هو موضوع لا يتم تدريسه إلا لعدد قليل من علماء الأحياء في تدريبهم على حسابهم. يوفر تطبيق عمليات التقييس البسيطة على ممارسات العمل اليومية الثقة في البيانات وقابلية التكرار عبر المسافة والوقت.

توضح هذه الطريقة كيفية توحيد تجربة معملية أساسية تستخدم على نطاق واسع في أبحاث الإرقاء والممارسة السريرية ، وتحديدا قياس الاستجابات لمستقبلات الكولاجين في الصفائح الدموية (البروتين السكري [GP] VI) الببتيد المرتبط بالكولاجين ، المتصالب (CRP-XL) عن طريق قياس تجميع انتقال الضوء (LTA). سيضمن استخدام هذا النهج قابلية التكاثر داخل المختبر والتنسيق بين المختبرات ، بغض النظر عن مخزون أو مورد الناهض. الأهم من ذلك ، أن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على ناهضات الصفائح الدموية الأخرى ، وفي الواقع ، العديد من الجزيئات البيولوجية والمقايسات الحيوية الأخرى.

تتضمن العملية الموضحة أدناه إجراء سلسلة تخفيف من 6 إلى 8 نقاط من "المعيار" و "الاختبار" (المادة التي تقوم بفحصها) وتشغيلها جنبا إلى جنب في اختبار مختار (في هذه الحالة ، LTA). يستخدم CRP-XL بتركيزات الكتلة / الحجم ، ولكن ليس كل مادة تعطي نفس النشاط البيولوجي عند تركيز معين ، لذلك يتم إجراء سلسلة تخفيف لمقارنة المعيار واختبار المواد وتحديد التركيز المطلوب لإعطاء نشاط مكافئ. يجب أن تمتد سلسلة التخفيف إلى تجميع 0-100٪. يتم رسم البيانات باستخدام الانحدار غير الخطي ، ويتم تحديد قيمة EC₅₀ لكل عينة (قياسي واختبار). لتعيين النشاط ، قسم قيمة EC₅₀ للمعيار على قيمة الاختبار لتحديد مدى قوته أو أقل قوة وضبط التركيز وفقا لذلك. سيضمن هذا النهج إضافة نفس "النشاط" البيولوجي إلى الفحص مرارا وتكرارا.

Introduction

يستخدم الكثير منا الناهضات والخصوم البيولوجية في تجاربنا ، وغالبا في الفحص البيولوجي الذي يحدد تأثيرها على وظيفة الخلية في ظل ظروف محددة. الطريقة الموصوفة هنا هي للببتيد المرتبط بالكولاجين ناهض الصفائح الدموية ، المتصالب (CRP-XL) ، وهو ناهض بروتين سكري VI ينشط الصفائح الدموية ويمكن قياس نشاطه في مجموعة متنوعة من المقايسات (قياس تجميع انتقال الضوء ، الفحص المجهري ، قياس التدفق الخلوي ، إطلاق Ca²⁺ ، إلخ) ، ولكن بروتوكول توحيد الناهض ينطبق على أي ناهض / مضاد بيولوجي و / أو مقايسة حيوية. العلوم الفيزيائية على دراية جيدة باستخدام المعايير في ممارسات العمل اليومية ، والشركات التي تطور أدوية العلاج الحيوي في القطاع التجاري تدرك قيمة استخدام المعايير المرجعية¹ ، ومع ذلك لا تزال غير مستغلة بشكل كاف من قبل العديد من علماء الأحياء ، وخاصة في مجتمع البحث الأكاديمي ، ويؤثر عدم استخدامها سلبا على جودة الإنتاج العلمي.

CRP-XL هو ناهض محدد خاص ب GPVI استخدمه حقل الصفائح الدموية لعقود منذ وصفه في عام 1995² ، مما يساعد المجتمع على تحديد دور GPVI من دور بروتينات الصفائح الدموية الأخرى المرتبطة بالكولاجين منذ ^3,4. يمكن شراء هذا الناهض من مجموعة متنوعة من المصادر التجارية أو إنتاجه داخليا. يمكن شراء مونومر الببتيد من مورد ثم ربطه داخليا أو يمكن للمورد القيام بذلك مقابل رسوم إضافية. يمكن تحقيق مزيد من التوفير في التكاليف عن طريق تقليل النقاء المطلوب عند التسليم (70٪ مقابل 95٪ ، على سبيل المثال). لا يوجد أيضا توافق في الآراء حول كيفية تخزين CRP-XL ، حيث يختار البعض التخزين بالتبريد والبعض الآخر التبريد ، والبعض الآخر يحتفظ بالمواد المجففة بالتجميد حتى الاستخدام ، والبعض الآخر يخزنها في محلول (ماء أو مخزن مؤقت ، حسب التفضيل). ولذلك، فإن نوعية وتكوين المخزونات المختبرية غير موحدة أو منسقة. نظرا لأن هذا الناهض يستخدم بتركيز محدد (كتلة / حجم) بدلا من وحدات النشاط ، فإن قوة CRP-XL في مختبر واحد ، على سبيل المثال ، عند 1 ميكروغرام / مل ، لن تكون هي نفسها الأخرى. تجدر الإشارة إلى أن ناهضات الصفائح الدموية الأخرى المستخدمة في هذا المجال موحدة بالفعل (على سبيل المثال ، الثرومبين ، الذي يتم توفيره واستخدامه في وحدات النشاط بدلا من الكتلة / الحجم) ، لذلك لا ينبغي أن يكون الانتقال من الكتلة / الحجم إلى الوحدات البيولوجية تحديا كبيرا للمجتمع. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن استجابات المرضى لمنبهات الصفائح الدموية ، بما في ذلك CRP-XL ، متغيرة من حيث حساسيتها للناهضات وكذلك قدرتها على الاستجابة (مدى الاستجابة)⁵ ، لذلك من المهم استخدام كميات ثابتة من نشاط الناهض في المقايسات.

إذا كان من الممكن تنسيق ناهضات الصفائح الدموية باستخدامها في نشاط محدد بدلا من الوزن / الحجم ، فيمكن التأكد من أن التجربة في أحد المختبرات قابلة للمقارنة مباشرة مع تلك الموجودة في المختبرات الأخرى ويمكن استنساخها بدقة وثقة. وإلى أن يحين الوقت الذي يتوصل فيه الحقل إلى اتفاق بشأن كيفية تخزين نشاط CRP-XL وتوحيده، من الضروري إجراء فحوصات منتظمة على المادة لضمان اتساقها على مدى الأشهر / السنوات التي تستخدم فيها.

يجب أن يتم تعيين قيمة النشاط للمعايير البيولوجية من خلال دراسات تعاونية متعددة المراكز (على سبيل المثال ^6,7) وتتطلب خبرة متخصصة. وقد أبرزت مؤخرا الحاجة إلى معايير بيولوجية راسخة لمنبهات الصفائح الدموية من خلال دراسة تعاونية متعددة المراكز⁸ تدعمها الجمعية الدولية للتخثر والإرقاء (ISTH)؛ وإلى أن يتوفر معيار CRP-XL دولي، يمكن للباحثين توحيد المواد الخاصة بهم محليا لضمان الاتساق بمرور الوقت، وأن المواد الجديدة التي يتم الحصول عليها تجاريا أو داخليا ذات نشاط مماثل للاستعدادات السابقة، وكذلك تلك الخاصة ببقية المجتمع.

Protocol

يجب جمع الدم من المتطوعين الأصحاء الموافقين ومعالجته وفقا للقواعد المحلية. يقيس هذا البروتوكول تراكم الصفائح الدموية الناجم عن الناهض في البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) عن طريق قياس تراكم انتقال الضوء (LTA). يوفر ISTH بروتوكولات موحدة ، بما في ذلك طريقة 2013 لإعداد PRP و LTA⁹.  اجمع الدم الكامل في 4٪ سترات الصوديوم وفقا لتوصيات ISTH وفقا لقواعد لجنة الأخلاقيات المحلية. استبعاد المتبرعين الذين تناولوا أي مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية خلال الأسابيع الماضية 2.

1. إجراء الفحص

1. خذ حصة من المخزون CRP-XL وقم بتخفيفه في المخزن المؤقت (Tyrodes¹⁰) (الجدول 1) إلى تركيز البدء الذي سيؤدي إلى أقصى تجميع (انظر الملاحظة أدناه الخطوة 1.3).
   ملاحظة: في الأدبيات ، سيؤدي تركيز 1 ميكروغرام / مل إلى أقصى تجميع ، لكن بعض المختبرات تحتاج إلى تركيزات أعلى للوصول إلى نفس التأثير - اضبط سلسلة التخفيف وفقا لذلك
2. قم بعمل سلسلة تخفيف مقابلة مع المعيار (انظر الملاحظة أدناه الخطوة 1.3 والشكل 1) بحيث تكون التركيزات هي نفسها كاشف الاختبار.
3. قم بإنتاج سلسلة تخفيف من 6 إلى 8 نقاط للاختبار والمعيار ، مرة أخرى في مخزن مؤقت للفحص ، والذي يأخذ استجابة التجميع من تجميع 100٪ إلى 0٪. يوضح الجدول 2 مثالا يوضح منحنى تركيز سلسلة التخفيف المكون من 8 نقاط.
   ملاحظة: تضيف بعض المختبرات ناهضا بإجمالي 10٪ من حجم الفحص ، على سبيل المثال ، 50 ميكرولتر من الناهض إلى 450 ميكرولتر من الصفائح الدموية ، بحيث تخفف تركيز 10x إلى تركيز 1x نهائي في الفحص ، بينما يضيف البعض الآخر كميات أصغر (أكثر تركيزا) من الناهض ، على سبيل المثال ، 5 ميكرولتر من ناهض إلى 495 ميكرولتر من الصفائح الدموية - فقط تأكد من أن سلسلة التخفيف مناسبة للفحص مع الأخذ في الاعتبار كيفية إزاحة الحجم يؤثر على تركيز الصفائح الدموية - مرة أخرى ، كن متسقا. في المثال ، يضاف 30 ميكرولتر من ناهض 10x إلى 270 ميكرولتر من البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP).
4. بمجرد أن تستريح الصفائح الدموية وتصبح جاهزة للاستخدام ، قم بقسمها في مكعبات LTA ، وأضف قضيب تقليب ، واتركها تصل إلى 37 درجة مئوية في الآبار القابضة.
5. بمجرد الوصول إلى درجة الحرارة ، ضع كوفيت (ق) في مقياس التجميع وابدأ في تسجيل الأثر (الآثار). أضف الناهض (مع التحريك) وسجل البيانات.
6. كرر الخطوة 1.4 لكل تركيز للاختبار والمعيار حتى يتم جمع البيانات اللازمة لرسم المنحنيات (مثال على المنحنيات الموضحة في الشكل 2).
7. حساب قوة كاشف الاختبار بالنسبة إلى قوة المعيار ؛ مرة أخرى ، استخدم أي مقياس - الحد الأقصى للتجميع أو المساحة أسفل المنحنى - طالما أن هناك اتساقا وأن نموذج التحليل يناسب البيانات بشكل مناسب.

2. التحقق من منحنيات التركيز

1. أولا، تحقق من أن منحنيات استجابة التركيز متوازية. هناك العديد من حزم البرامج التي تقوم بذلك ، ولكن هنا يتم وصف العملية ل Graphpad Prism (انظر الشكل 3).
   1. أدخل البيانات بحيث يكون log (التركيز) على المحور X والاستجابة (٪ الحد الأقصى للتجميع / AUC) على المحور Y (الشكل 3A)
   2. تحويل تركيزات CRP-XL (الشكل 3 ب)
   3. حدد الانحدار غير الخطي من وظائف التحليل واستخدم معادلة تحفيز / تثبيط الاستجابة للجرعة.
   4. حدد السجل (ناهض) مقابل الاستجابة (المنحدر المتغير) - استخدم 3 أو 4 اتجاهات مناسبة اعتمادا على الأفضل للبيانات.
   5. حدد ما إذا كانت المنحنيات متوازية باستخدام علامة التبويب مقارنة (كما هو موضح في الشكل 3C) وانقر فوق الزر لمقارنة مجموعات البيانات للتأكد من أن المنحدر (منحدر التل) والتقارب (أعلى وأسفل المنحنيات) متكافئان. في هذا المثال ، ميل هيل للاختبار هو 2.279 ، وميل المعيار هو 2.025 مما يعطي نسبة 1.125.
   6. إذا كانت المنحدرات متوازية (على سبيل المثال ، معيار قبول نسبة الميل بين 0.8-1.25) وكانت خطوط التقارب متكافئة ، فتابع حساب الفاعلية (EC₅₀) باستخدام الخطوتين 2.1.3 و 2.1.4. في المثال الموضح هنا ، تم تقييد خطوط التقارب حيث أكد التقييم في الخطوة 2.1.5 أن خطوط التقارب متكافئة.
   7. اقسم قيمة EC₅₀ للمعيار على قيمة الاختبار لتحديد الفاعلية النسبية. في المثال الموضح هنا ، الاختبار / المعيار (0.07259 / 0.1498) = 0.4846 ، أي أن "الاختبار" هو نصف قوة المعيار.
   8. اضبط تركيزات الكتلة / الحجم لمراعاة الاختلاف في الفاعلية ، أي إذا تم استخدام المعيار سابقا عند 1 ميكروغرام / مل ، استخدام المادة الجديدة عند 1 / 0.4846 = 2.063 ميكروغرام / مل) لضمان استخدام كميات مماثلة من المواد الفعالة في التجارب

Representative Results

الشكل 1 هو تمثيل تخطيطي لسلسلة التخفيف ويهدف إلى تسليط الضوء على أن سلسلة التخفيف مطلوبة لكل من المعيار والاختبار. يوضح الشكل 2 أ آثار التجميع للمعيار ، بينما تظهر بيانات الاختبار في الشكل 2 ب. عند 0.075 ميكروغرام / مل ، هناك استجابة واضحة للمعيار ، بينما بالنسبة للاختبار ، يكون التركيز المقابل (0.075 ميكروغرام / مل) مسطحا ، أي لا توجد استجابة. تستخدم هذه البيانات لرسم الرسوم البيانية اللاحقة لإعطاء EC₅₀. في المثال الموضح هنا ، تم استخدام التجميع الأقصى بنسبة 100٪ لرسم منحنى التركيز والاستجابة وتحديد EC₅₀ ، كما هو موضح في الشكل 3.

الشكل 1: وصف بياني لسلسلتي التخفيفات للاختبار (يسار) والمعيار (يمين). بدءا من التركيز الأعلى (التركيز المقترح: 10 ميكروغرام / مل CRP-XL) ، يتم إجراء تخفيفات متسلسلة 1 في 2 بالتوازي على 8 نقاط (>3 وحدات لوغاريتم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: آثار التجميع للمعيار (يسار) وسلسلة تخفيف الاختبار (يمين). مع استمرار تراكم الصفائح الدموية (المحور السيني) ، تزداد كمية الضوء التي تمر عبر العينة وتصل إلى المستشعر (المحور ص). (أ) المعيار. (ب) الاختبار. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: إدخال البيانات وتحليلها. (أ) يتم إدخال البيانات ، (ب) تحويلها ، و (ج) حلل التوازي (اطلب من البرنامج معرفة ما إذا كانت منحدرات هيل وخطوط التقارب قابلة للمقارنة [C]). (ه) إذا كانت المنحنيات متوازية ، فحدد الفاعلية (EC₅₀) باستخدام تركيب منحنى الانحدار غير الخطي. (و) البيانات المحولة المرسومة. يرجى الرجوع إلى الطريقة لمزيد من التفاصيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تيرودس عازلة9
المكونات	تركيز	التعليقات
كلوريد الصوديوم	134 مللي متر
Na2HPO4	0.34 مللي متر
ككل	2.9 مللي متر
ناهكو3	12 مللي متر
4- (2- هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES)	20 مللي متر
الجلوكوز	5 مللي متر
مغ سي سي ال2	1 مللي متر	درجة الحموضة 7.3

الجدول 1: تكوين العازلة Tyrodes.

سلسلة تخفيف 8 نقاط
التخفيف 1	10 ميكروغرام / مل
التخفيف 2	5 ميكروغرام / مل
التخفيف 3	2.5 ميكروغرام / مل
التخفيف 4	1.25 ميكروغرام / مل
التخفيف 5	0.625 ميكروغرام / مل
التخفيف 6	0.3125 ميكروغرام / مل
التخفيف 7	0.15625 ميكروغرام / مل
التخفيف 8	0.073125 ميكروغرام / مل

الجدول 2: مثال يوضح سلسلة تخفيف مكونة من 8 نقاط.

Discussion

كما هو موضح هنا ، فإن عملية توحيد المواد واضحة للغاية. على الرغم من أن الأمر يتطلب القليل من الوقت لتقييم دفعات جديدة من المواد و / أو للتحقق من أن الدفعة الحالية مستقرة ولا تفقد النشاط بمرور الوقت ، فإن المكافأة هي أن التجارب قابلة للتكرار مرارا وتكرارا ويمكن مقارنتها على مدار سنوات بدلا من مجرد عمر مجموعة من الكاشف. وهذا يعني أيضا أنه يمكن للباحثين الآخرين إعادة إنشاء ظروف الفحص بدقة وأن المجتمع متناسق على المستوى العالمي. تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول جمع الدم الكامل وإعداد PRP⁹ ، بالإضافة إلى الدقة عند إجراء سلسلة التخفيف. من المهم أيضا التأكد من أن منحنيات الاختبار والمعايير متوازية قبل متابعة مقارنة EC₅₀ . إذا لم تكن الخطوط متوازية ، أو لم تكن خطوط التقارب متكافئة ، فقد يشير ذلك إلى أن الاختبار والمواد القياسية مختلفان إلى حد ما.

يعرف كل من يعمل في العلوم البيولوجية أن المقايسات البيولوجية لا تعمل دائما بشكل متسق ، لذلك يحتاج المرء إلى أن يضع في اعتباره ذلك عند تقييم البيانات. في المثال الموضح هنا، على الرغم من أننا نستخدم نفس المتبرعين لقياس فعالية مادتين متشابهتين للغاية، إن لم تكن متطابقتين، فإن منحدرات التلال وخطوط التقارب ليست متطابقة. ومع ذلك ، فإننا نقبل درجة من التباين ونستنتج أن المنحنيات ، في هذه الحالة ، متوازية ، وبالتالي فهي مناسبة لمقارنة وضبط الفاعلية. الجزيئات البيولوجية كبيرة ومعقدة ، ويمكن أن تؤثر التعديلات اللاحقة للترجمة أثناء التصنيع على فعاليتها في المقايسات الحيوية. لا يمكن توحيد الجزيئات الحيوية والمقايسات الحيوية باستخدام الكتلة أو الحجم فقط ويجب أن يتم ذلك عن طريق تحديد النشاط البيولوجي ومقارنته في المقايسة الحيوية¹¹. يجب على المرء استخدام تدريبه وخبرته لتقييم البيانات في سياق الفحص.

تتمثل قيود التقنية في أنه على الرغم من أن البيانات قد تشير إلى وجود مشكلة في الكاشف (الكواشف) ، إلا أنها لا تستطيع إخبارك بالمشكلة. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتحديد سبب عدم قابلية المواد للمقارنة. في عالم مثالي ، سيتم التحقق من أي مادة حاسمة للتجربة (التجارب) والاستنتاجات العلمية اللاحقة عن طريق التحليل الطيفي الكتلي ، ولكن هذا ليس دائما خيارا. ومع ذلك ، إذا كانت البيانات غير قابلة للمقارنة ، فلا يزال هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحقيقات في بعض الصفات. ومن القيود الأخرى لهذا النهج الوقت والموارد اللازمة للقيام بذلك. من الناحية المثالية ، يجب مقارنة الاختبار والمعيار في 3-6 مانحين لتوفير بعض الثقة في تعيين النشاط البيولوجي للمادة ، لكننا نشعر أن هذا له ما يبرره من خلال دعم التكاثر والموثوقية. ليست هناك حاجة إلى توحيد المواد البيولوجية في كل مرة يتم فيها إجراء التجارب ، ولكن على الأقل ، يجب أن يتم ذلك لكل دفعة جديدة من المنبهات ، ويفضل أن يكون ذلك بشكل متكرر ، اعتمادا على الاستقرار والاستخدام. في الواقع ، إذا تم توفير معيار ، فهذا شيء يمكن لمنظمات التقييس الدولية أن توفر وضوحا بشأنه.

في حين أن المثال الموضح هنا هو CRP-XL في سياق قياس تراكم الصفائح الدموية ، فإن بروتوكول مقارنة النشاط البيولوجي للجزيئات الحيوية في المقايسات الحيوية قابل للتطبيق على نطاق واسع عبر القطاع.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.