ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
यहां हम प्रकाश संचरण एग्ग्रेगोमेट्री का उपयोग करके प्लेटलेट एगोनिस्ट कोलेजन से संबंधित पेप्टाइड क्रॉस-लिंक्ड (सीआरपी-एक्सएल) को मानकीकृत करने की एक विधि प्रस्तुत करते हैं। जबकि प्रोटोकॉल प्लेटलेट फ़ंक्शन पर लक्षित है, प्रयोगात्मक प्रक्रिया को वैज्ञानिक कठोरता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए अधिकांश जैविक अणुओं और बायोएसेस पर लागू किया जा सकता है।
Abstract
मेट्रोलॉजी - माप का विज्ञान - एक ऐसा विषय है जिसके बारे में कुछ जैविक वैज्ञानिकों को उनके प्रशिक्षण में उनके नुकसान के बारे में सिखाया जाता है; रोजमर्रा की कामकाजी प्रथाओं के लिए सरल मानकीकरण प्रक्रियाओं का आवेदन दूरी और समय पर डेटा और प्रजनन क्षमता में विश्वास प्रदान करता है।
यह विधि दर्शाती है कि हेमोस्टेसिस अनुसंधान और नैदानिक अभ्यास में व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले एक कोर प्रयोगशाला प्रयोग को मानकीकृत कैसे किया जाए, विशेष रूप से, प्लेटलेट कोलेजन रिसेप्टर (ग्लाइकोप्रोटीन [जीपी]वीआई) एगोनिस्ट कोलेजन से संबंधित पेप्टाइड, क्रॉस-लिंक्ड (सीआरपी-एक्सएल) की प्रतिक्रियाओं को प्रकाश संचरण एग्रीमेट्री (एलटीए) द्वारा। इस दृष्टिकोण का उपयोग करने से एगोनिस्ट स्टॉक या आपूर्तिकर्ता की परवाह किए बिना इंट्रा-लैब प्रजनन क्षमता और अंतर-प्रयोगशाला सामंजस्य सुनिश्चित होगा। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि अन्य प्लेटलेट एगोनिस्ट और वास्तव में, कई अन्य जैविक अणुओं और बायोएसेस पर लागू होती है।
नीचे उल्लिखित प्रक्रिया में 'मानक' और 'परीक्षण' (जिस सामग्री की आप जांच कर रहे हैं) की 6-8 बिंदु कमजोर पड़ने की श्रृंखला बनाना और उन्हें एक चुने हुए परख (इस मामले में, एलटीए) में साथ-साथ चलाना शामिल है। सीआरपी-एक्सएल का उपयोग द्रव्यमान / मात्रा सांद्रता पर किया जाता है, लेकिन प्रत्येक सामग्री किसी दिए गए एकाग्रता पर समान जैविक गतिविधि नहीं देती है, इसलिए मानक और परीक्षण सामग्री की तुलना करने और यह निर्धारित करने के लिए एक कमजोर पड़ने की श्रृंखला बनाई जाती है कि समकक्ष गतिविधि देने के लिए किस एकाग्रता की आवश्यकता है। कमजोर पड़ने की श्रृंखला 0-100% एकत्रीकरण का विस्तार करना चाहिए। डेटा को गैर-रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके प्लॉट किया जाता है, और प्रत्येक नमूने (मानक और परीक्षण) का ईसी50 मान निर्धारित किया जाता है। गतिविधि असाइन करने के लिए, मानक के ईसी50 मान को परीक्षण से विभाजित करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि यह कितना अधिक या कम शक्तिशाली है और तदनुसार एकाग्रता को समायोजित करें। यह दृष्टिकोण यह सुनिश्चित करेगा कि एक ही जैविक 'गतिविधि' को बार-बार परख में जोड़ा जाए।
Introduction
हम में से कई अपने प्रयोगों में जैविक एगोनिस्ट और विरोधी का उपयोग करते हैं, अक्सर एक जैविक परख में जो विशिष्ट परिस्थितियों में सेल फ़ंक्शन पर उनके प्रभाव को निर्धारित करता है। यहां वर्णित विधि प्लेटलेट एगोनिस्ट कोलेजन से संबंधित पेप्टाइड, क्रॉस-लिंक्ड (सीआरपी-एक्सएल), एक ग्लाइकोप्रोटीन वीआई एगोनिस्ट के लिए है जो प्लेटलेट्स को सक्रिय करता है और जिसकी गतिविधि को विभिन्न प्रकार के परखों (प्रकाश संचरण एग्ग्रेगोमेट्री, माइक्रोस्कोपी, फ्लो साइटोमेट्री, सीए2 + रिलीज, आदि) में मापा जा सकता है, लेकिन एगोनिस्ट मानकीकरण प्रोटोकॉल किसी भी जैविक एगोनिस्ट / विरोधी और / या बायोसेसे पर लागू होता है। भौतिक विज्ञान अपने दिन-प्रतिदिन के कार्य प्रथाओं में मानकों के उपयोग में अच्छी तरह से वाकिफ हैं, और वाणिज्यिक क्षेत्र में बायोथेराप्यूटिक दवाओं को विकसित करने वाली कंपनियां संदर्भ मानकों1 का उपयोग करने के मूल्य को समझती हैं, फिर भी वे कई जैविक वैज्ञानिकों द्वारा अप्रयुक्त रहते हैं, विशेष रूप से अकादमिक अनुसंधान समुदाय में, और उनके उपयोग की कमी वैज्ञानिक उत्पादन की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करती है।
सीआरपी-एक्सएल एक विशिष्ट जीपीवीआई-विशिष्ट एगोनिस्ट है जिसे प्लेटलेट क्षेत्र ने 1995 2 में अपने विवरण के बाद से दशकों तक उपयोग किया है, जिससे समुदाय को 3,4 के बाद से अन्य कोलेजन-बाध्यकारी प्लेटलेट प्रोटीन से जीपीवीआई की भूमिका को चित्रित करने में मदद मिलती है। इस एगोनिस्ट को विभिन्न वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा जा सकता है या इन-हाउस उत्पादित किया जा सकता है। पेप्टाइड मोनोमर को आपूर्तिकर्ता से खरीदा जा सकता है और फिर क्रॉस-लिंक्ड इन-हाउस या यह आपूर्तिकर्ता द्वारा अतिरिक्त शुल्क के लिए किया जा सकता है। डिलीवरी पर आवश्यक शुद्धता को कम करके आगे लागत-बचत की जा सकती है (उदाहरण के लिए 70% बनाम 95%)। इस बात पर भी कोई सहमति नहीं है कि सीआरपी-एक्सएल को कैसे संग्रहीत किया जाना चाहिए, कुछ क्रायोस्टोरेज और अन्य प्रशीतन का विकल्प चुनते हैं, कुछ सामग्री को उपयोग तक लियोफिलाइज रखते हैं, और अन्य इसे समाधान (पानी या बफर, वरीयता के आधार पर) में संग्रहीत करते हैं। इसलिए, प्रयोगशाला स्टॉक की गुणवत्ता और संरचना गैर-मानकीकृत या सामंजस्यपूर्ण है। क्योंकि इस एगोनिस्ट का उपयोग गतिविधि की इकाइयों के बजाय परिभाषित एकाग्रता (द्रव्यमान / मात्रा) पर किया जाता है, एक प्रयोगशाला में सीआरपी-एक्सएल की शक्ति, उदाहरण के लिए, 1 μg / mL पर, दूसरे के समान नहीं होगी। यह ध्यान देने योग्य है कि क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले अन्य प्लेटलेट एगोनिस्ट पहले से ही मानकीकृत हैं (उदाहरण के लिए, थ्रोम्बिन, जिसे द्रव्यमान / मात्रा के बजाय गतिविधि की इकाइयों में आपूर्ति और उपयोग किया जाता है), इसलिए द्रव्यमान / मात्रा से जैविक इकाइयों तक आंदोलन समुदाय के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण नहीं होना चाहिए। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीआरपी-एक्सएल सहित प्लेटलेट एगोनिस्ट के लिए रोगी की प्रतिक्रियाएं, एगोनिस्ट के प्रति उनकी संवेदनशीलता के साथ-साथ प्रतिक्रिया देने की उनकी क्षमता (प्रतिक्रिया की सीमा) के संदर्भ में परिवर्तनशील हैं, इसलिए परख में एगोनिस्ट गतिविधि की लगातार मात्रा का उपयोग करना और भी महत्वपूर्ण है।
यदि प्लेटलेट एगोनिस्ट को वजन / मात्रा के बजाय एक परिभाषित गतिविधि पर उनका उपयोग करके सामंजस्य स्थापित किया जा सकता है, तो यह सुनिश्चित किया जा सकता है कि एक प्रयोगशाला में एक प्रयोग सीधे अन्य प्रयोगशालाओं के साथ तुलनीय है और आत्मविश्वास के साथ सटीक रूप से पुन: पेश किया जा सकता है। जब तक क्षेत्र सीआरपी-एक्सएल गतिविधि को संग्रहीत और मानकीकृत करने के तरीके पर एक समझौते तक नहीं पहुंचता, तब तक सामग्री पर नियमित जांच करना आवश्यक है ताकि उन महीनों / वर्षों में इसकी स्थिरता सुनिश्चित हो सके जिनमें इसका उपयोग किया जा रहा है।
जैविक मानकों के लिए गतिविधि मूल्य असाइनमेंट सहयोगी, बहु-केंद्र अध्ययन (उदाहरण के लिए 6,7) के माध्यम से किया जाना चाहिए और विशेषज्ञ विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। प्लेटलेट एगोनिस्ट के लिए स्थापित जैविक मानकों की आवश्यकता को हाल ही में इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर थ्रोम्बोसिस एंड हेमोस्टेसिस (आईएसटीएच) द्वारा समर्थित एक सहयोगी बहु-केंद्र अध्ययन8 द्वारा उजागर किया गया है; जब तक एक अंतरराष्ट्रीय सीआरपी-एक्सएल मानक उपलब्ध नहीं होता है, तब तक शोधकर्ता समय के साथ स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए स्थानीय रूप से अपनी सामग्री को मानकीकृत कर सकते हैं, और यह कि व्यावसायिक रूप से या इन-हाउस सोर्स की गई नई सामग्री पिछली तैयारियों के साथ-साथ बाकी समुदाय की तुलना में तुलनीय गतिविधि है।
Protocol
सहमति देने वाले स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त एकत्र किया जाना चाहिए और स्थानीय नियमों के अनुसार संसाधित किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल प्रकाश संचरण एग्रीमेट्री (एलटीए) द्वारा प्लेटलेट-समृद्ध प्लाज्मा (पीआरपी) में एगोनिस्ट-प्रेरित प्लेटलेट एकत्रीकरण को मापता है। ISTH मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जिसमें PRP तैयारी और LTA9 के लिए 2013 विधि शामिल है। स्थानीय आचार समिति के नियमों के अनुसार आईएसटीएच सिफारिशों के अनुसार पूरे रक्त को 4% सोडियम साइट्रेट में एकत्र करें। उन दाताओं को बाहर करें जिन्होंने पिछले 2 सप्ताह के भीतर कोई एनएसएआईडी लिया है।
1. परख प्रक्रिया
- स्टॉक सीआरपी-एक्सएल का एक एलिकोट लें और इसे परख (टायरोडेस10) बफर (तालिका 1) में एक प्रारंभिक एकाग्रता में पतला करें जो अधिकतम एकत्रीकरण का कारण होगा (चरण 1.3 के नीचे नोट देखें)।
नोट: साहित्य में, 1 μg / mL की एकाग्रता अधिकतम एकत्रीकरण को प्रेरित करेगी, लेकिन कुछ प्रयोगशालाओं को एक ही प्रभाव तक पहुंचने के लिए उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है - तदनुसार कमजोर पड़ने की श्रृंखला को समायोजित करें। - मानक के साथ एक संबंधित कमजोर पड़ने की श्रृंखला बनाएं (चरण 1.3 और चित्रा 1 के नीचे नोट देखें) ताकि सांद्रता परीक्षण अभिकर्मक के समान हो।
- परीक्षण और मानक के लिए 6- से 8-बिंदु कमजोर पड़ने की श्रृंखला का उत्पादन करें, फिर से परख बफर में, जो एकत्रीकरण प्रतिक्रिया को 100% से 0% एकत्रीकरण तक ले जाता है। 8-बिंदु तनुकरण श्रृंखला एकाग्रता वक्र दिखाने वाला एक उदाहरण तालिका 2 में दिखाया गया है।
नोट: कुछ प्रयोगशालाएं कुल 10% परख मात्रा में एगोनिस्ट जोड़ती हैं, उदाहरण के लिए, 50 μL एगोनिस्ट से 450 μL प्लेटलेट्स, जैसे कि वे परख में अंतिम 1x एकाग्रता में 10x एकाग्रता को पतला करते हैं, जबकि अन्य एगोनिस्ट के छोटे (अधिक केंद्रित) वॉल्यूम जोड़ते हैं, उदाहरण के लिए, 5 μL एगोनिस्ट से 495 μL प्लेटलेट्स - बस सुनिश्चित करें कि वॉल्यूम विस्थापन को ध्यान में रखते हुए परख के लिए कमजोर पड़ने की श्रृंखला उपयुक्त है। प्लेटलेट एकाग्रता को प्रभावित करता है - फिर से, सुसंगत रहें। उदाहरण में, 10x एगोनिस्ट के 30 μL को प्लेटलेट रिच प्लाज्मा (PRP) के 270 μL में जोड़ा जाता है। - एक बार प्लेटलेट्स आराम करने और उपयोग करने के लिए तैयार होने के बाद, उन्हें एलटीए क्यूवेट में एलिकोट करें, एक हलचल बार जोड़ें, और उन्हें होल्डिंग कुओं में 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने दें।
- एक बार तापमान पर, क्यूवेट (ओं) को एग्रेगोमीटर में रखें और ट्रेस (ओं) को रिकॉर्ड करना शुरू करें। एगोनिस्ट (सरगर्मी के साथ) जोड़ें और डेटा रिकॉर्ड करें।
- परीक्षण और मानक की प्रत्येक एकाग्रता के लिए चरण 1.4 को दोहराएं जब तक कि वक्रों को प्लॉट करने के लिए आवश्यक डेटा एकत्र नहीं किया जाता है (उदाहरण के लिए चित्र 2 में दिखाए गए वक्र)।
- मानक के सापेक्ष परीक्षण अभिकर्मक की शक्ति की गणना करें; फिर, किसी भी मीट्रिक का उपयोग करें - वक्र के नीचे अधिकतम एकत्रीकरण या क्षेत्र - जब तक स्थिरता है और विश्लेषण मॉडल उचित रूप से डेटा फिट बैठता है।
2. एकाग्रता वक्रों की जांच करना
- सबसे पहले, जांचें कि एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र समानांतर हैं। कई सॉफ्टवेयर पैकेज हैं जो ऐसा करते हैं, लेकिन यहां प्रक्रिया ग्राफपैड प्रिज्म के लिए वर्णित है ( चित्रा 3 देखें)।
- डेटा दर्ज करें ताकि लॉग (एकाग्रता) X अक्ष पर हो और प्रतिक्रिया (% अधिकतम एकत्रीकरण / AUC) Y अक्ष पर हो (चित्रा 3A)।
- सीआरपी-एक्सएल सांद्रता को बदलें (चित्रा 3 बी)।
- विश्लेषण कार्यों से गैर-रैखिक प्रतिगमन का चयन करें और खुराक-प्रतिक्रिया उत्तेजना / निषेध के लिए समीकरण का उपयोग करें।
- लॉग (एगोनिस्ट) बनाम प्रतिक्रिया (चर ढलान) का चयन करें - डेटा के लिए सबसे अच्छा होने के आधार पर 3- या 4-तरफा फिट का उपयोग करें।
- तुलना टैब (जैसा कि चित्र 3सी में दिखाया गया है) का उपयोग करके निर्धारित करें कि वक्र समानांतर हैं या नहीं और यह सुनिश्चित करने के लिए डेटासेट की तुलना करने के लिए बटन पर क्लिक करें कि ढलान (पहाड़ी ढलान) और एसिम्प्टोट्स (वक्रों के ऊपर और नीचे) बराबर हैं। इस उदाहरण में, परीक्षण के लिए हिल ढलान 2.279 है, और मानक का 2.025 है जो 1.125 का अनुपात देता है।
- यदि ढलान समानांतर हैं (उदाहरण के लिए, 0.8-1.25 के बीच ढलान अनुपात का एक स्वीकृति मानदंड) और एसिम्प्टोट्स समकक्ष हैं, तो चरण 2.1.3 और 2.1.4 का उपयोग करके शक्ति (ईसी50) गणना के साथ आगे बढ़ें। यहां दिखाए गए उदाहरण में, एसिम्प्टोट्स को विवश किया गया है क्योंकि चरण 2.1.5 में मूल्यांकन ने पुष्टि की है कि एसिम्प्टोट्स समकक्ष हैं।
- सापेक्ष शक्ति निर्धारित करने के लिए मानक के ईसी50 मान को परीक्षण से विभाजित करें। यहां दिखाए गए उदाहरण में, परीक्षण/मानक (0.07259/0.1498) = 0.4846, अर्थात, 'परीक्षण' मानक की तुलना में आधा शक्तिशाली है।
- शक्ति में अंतर के लिए द्रव्यमान/आयतन सांद्रता को समायोजित करें, अर्थात, यदि मानक का उपयोग पहले 1 μg/mL पर किया गया था, तो नई सामग्री का उपयोग 1/0.4846 = 2.063 μg/mL) पर किया जाएगा ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रयोगों में सक्रिय सामग्री की तुलनीय मात्रा का उपयोग किया जा रहा है।
Representative Results
चित्रा 1 एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला का एक आरेखीय प्रतिनिधित्व है और इसका मतलब यह उजागर करना है कि मानक और परीक्षण दोनों के लिए एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला की आवश्यकता है। चित्रा 2 ए मानक के लिए एकत्रीकरण निशान दिखाता है, जबकि परीक्षण डेटा चित्रा 2 बी में दिखाया गया है। 0.075 μg / mL पर, मानक के लिए एक स्पष्ट प्रतिक्रिया है, जबकि परीक्षण के लिए, संबंधित एकाग्रता (0.075 μg / mL) सपाट है, यानी, कोई प्रतिक्रिया नहीं। इन आंकड़ों का उपयोग ईसी50 देने के लिए बाद के ग्राफ़ को प्लॉट करने के लिए किया जाता है। यहां दिखाए गए उदाहरण में, एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र को प्लॉट करने और ईसी50 निर्धारित करने के लिए 100% अधिकतम एकत्रीकरण का उपयोग किया गया था, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।
चित्रा 1: परीक्षण (बाएं) और मानक (दाएं) की दो कमजोर पड़ने की श्रृंखला का ग्राफिकल विवरण। शीर्ष एकाग्रता (सुझाई गई एकाग्रता: 10 μg / mL CRP-XL) से शुरू होकर, अनुक्रमिक 1 में 2 कमजोर पड़ने को 8 बिंदुओं (>3 लॉग इकाइयों) से समानांतर में बनाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: मानक (बाएं) और परीक्षण कमजोर पड़ने की श्रृंखला (दाएं) के लिए एकत्रीकरण निशान। जैसे-जैसे प्लेटलेट एकत्रीकरण आगे बढ़ता है (एक्स-अक्ष), नमूने से गुजरने और सेंसर तक पहुंचने वाले प्रकाश की मात्रा बढ़ जाती है (वाई-अक्ष)। (ए) मानक। (बी) टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: डेटा प्रविष्टि और विश्लेषण। (ए) डेटा दर्ज किया जाता है, (बी) रूपांतरित किया जाता है, और (सी, डी) समांतरता के लिए विश्लेषण किया जाता है (सॉफ्टवेयर को यह बताने के लिए कहें कि क्या हिल स्लोप्स और एसिम्प्टोट्स तुलनीय हैं [सी])। (ई) यदि वक्र समानांतर हैं, तो गैर-रैखिक प्रतिगमन वक्र फिटिंग का उपयोग करके शक्ति (ईसी50) निर्धारित करें। (एफ) प्लॉट किए गए रूपांतरित डेटा। कृपया अधिक विवरण के लिए विधि देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| टायरोड्स बफर9 | ||
| घटक | एकाग्रता | टिप्पणियाँ |
| NaCl | 134 mM | |
| Na2HPO4 | 0.34 mM | |
| KCl | 2.9 mM | |
| NaHCO3 | 12 mM | |
| 4-(2- हाइड्रॉक्सीथाइल)-1-पाइपराज़िनेथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस) | 20 mM | |
| ग्लूकोज़ | 5 mM | |
| MgCl2 | 1 mM | pH 7.3 |
तालिका 1: टायरोड्स बफर की संरचना।
| 8 अंक कमजोर पड़ने की श्रृंखला | |
| कमजोर पड़ने की स्थिति 1 | 10 μg/mL |
| कमजोर पड़ने की स्थिति 2 | 5 μg/mL |
| कमजोर पड़ने की संख्या 3 | 2.5 μg/mL |
| कमजोर पड़ने की संख्या 4 | 1.25 μg/mL |
| कमजोर पड़ने की दर 5 | 0.625 μg/mL |
| कमजोर पड़ने की दर 6 | 0.3125 μg/mL |
| कमजोर पड़ने की दर 7 | 0.15625 μg/mL |
| कमजोर पड़ने 8 | 0.073125 μg/mL |
तालिका 2: एक उदाहरण 8-बिंदु कमजोर पड़ने की श्रृंखला दिखा रहा है।
Discussion
जैसा कि यहां दिखाया गया है, सामग्री को मानकीकृत करने की प्रक्रिया बहुत सीधी है। यद्यपि सामग्री के नए बैचों का मूल्यांकन करने और / या यह जांचने के लिए थोड़ा समय चाहिए कि वर्तमान बैच स्थिर है और समय के साथ गतिविधि नहीं खो रहा है, इनाम यह है कि प्रयोग बार-बार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और अभिकर्मक के बैच के जीवनकाल के बजाय वर्षों में तुलनीय हैं। इसका मतलब यह भी है कि अन्य शोधकर्ता परख स्थितियों को सटीक रूप से फिर से बना सकते हैं और समुदाय वैश्विक स्तर पर सामंजस्यपूर्ण है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में पूरे रक्त संग्रह और पीआरपी तैयारी9 शामिल हैं, साथ ही कमजोर पड़ने की श्रृंखला बनाते समय सटीकता भी शामिल है। ईसी50 तुलना के साथ आगे बढ़ने से पहले यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि परीक्षण और मानक वक्र समानांतर हैं। यदि रेखाएं समानांतर नहीं हैं, या एसिम्प्टोट्स समकक्ष नहीं हैं, तो यह संकेत दे सकता है कि परीक्षण और मानक सामग्री कुछ हद तक भिन्न हैं।
जैविक विज्ञान में काम करने वाला हर कोई जानता है कि जैविक परख हमेशा लगातार प्रदर्शन नहीं करते हैं, इसलिए डेटा का मूल्यांकन करते समय किसी को इस बात का ध्यान रखना चाहिए। यहां दिखाए गए उदाहरण में, भले ही हम दो बहुत समान सामग्रियों की शक्ति को मापने के लिए एक ही दाताओं का उपयोग कर रहे हैं, यदि समान नहीं हैं, तो पहाड़ी ढलान और उपगामी समान नहीं हैं। फिर भी हम परिवर्तनशीलता की एक डिग्री स्वीकार करते हैं और निष्कर्ष निकालते हैं कि वक्र, इस मामले में, समानांतर हैं, और इसलिए शक्ति की तुलना और समायोजन के लिए उपयुक्त हैं। जैविक अणु बड़े और जटिल होते हैं, और निर्माण के दौरान पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन बायोएसेस में उनकी शक्ति को प्रभावित कर सकते हैं। बायोमोलेक्यूल्स और बायोएसेस का मानकीकरण केवल द्रव्यमान या मात्रा का उपयोग करके नहीं किया जा सकता है और बायोसे11 में जैविक गतिविधि की मात्रा और तुलना करके किया जानाचाहिए। परख के संदर्भ में डेटा का मूल्यांकन करने के लिए किसी को अपने प्रशिक्षण और अनुभव का उपयोग करना चाहिए।
तकनीक की सीमाएं यह हैं कि जबकि डेटा अभिकर्मक (ओं) के साथ एक समस्या का संकेत दे सकता है, यह आपको नहीं बता सकता है कि समस्या क्या है। सामग्री तुलनीय क्यों नहीं है, यह निर्धारित करने के लिए आगे के काम की आवश्यकता होगी। एक आदर्श दुनिया में, प्रयोग (ओं) और बाद के वैज्ञानिक निष्कर्षों के लिए महत्वपूर्ण किसी भी सामग्री को मास स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया जाएगा, लेकिन यह हमेशा एक विकल्प नहीं है। हालांकि, यदि डेटा तुलनीय नहीं हैं, तो कुछ क्षमता में आगे की जांच अभी भी आवश्यक है। इस दृष्टिकोण की एक और सीमा इसे करने के लिए आवश्यक समय और संसाधन है। आदर्श रूप से, सामग्री को जैविक गतिविधि सौंपने में कुछ आत्मविश्वास प्रदान करने के लिए 3-6 दाताओं में परीक्षण और मानक की तुलना की जानी चाहिए, लेकिन हमें लगता है कि यह प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता का समर्थन करके उचित है। हर बार प्रयोग चलाए जाने पर जैविक सामग्री के मानकीकरण की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन कम से कम, यह एगोनिस्ट के हर नए बैच के लिए किया जाना चाहिए, अधिमानतः स्थिरता और उपयोग के आधार पर। दरअसल, एक मानक उपलब्ध कराया जाना चाहिए, यह कुछ ऐसा है जिस पर अंतर्राष्ट्रीय मानकीकरण संगठन स्पष्टता प्रदान कर सकते हैं।
जबकि यहां दिखाया गया उदाहरण प्लेटलेट एकत्रीकरण को मापने के संदर्भ में सीआरपी-एक्सएल के लिए है, बायोएसेस में बायोमोलेक्यूल्स की जैविक गतिविधि की तुलना करने का प्रोटोकॉल पूरे क्षेत्र में व्यापक रूप से लागू है।
Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
कोई नहीं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
| 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
| Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis software package | |
| Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |
References
- Faya, P., et al. Potency assignment of biotherapeutic reference standards. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577 (2020).
- Morton, L. F., et al. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity. The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).
- Pugh, N., et al. Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood. Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).
- Farndale, R. W., et al. Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).
- Dunster, J. L., et al. Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts. Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).
- Hubbard, A. R., et al. Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).
- Sergaki, C., et al. Developing whole cell standards for the microbiome field. Microbiome. 10 (1), 123 (2022).
- Alessi, M. C., et al. Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).
- Taylor, L., et al. Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing. PLoS One. 9 (6), e101209 (2014).
- Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. Applying the science of measurement to biology: Why bother. PLoS Biology. 17 (6), e3000338 (2019).
Tags
चिकित्सा अंक 198 अनुसंधान जैविक मानक प्लेटलेट एगोनिस्ट कोलेजन से संबंधित पेप्टाइड मेट्रोलॉजी मानकीकरण प्रक्रियाएं डेटा आत्मविश्वास दूरी और समय कोर प्रयोगशाला प्रयोग हेमोस्टेसिस अनुसंधान नैदानिक अभ्यास प्रकाश संचरण एग्रीगोमेट्री इंट्रा-लैब प्रजनन क्षमता इंटर-लैब हार्मोनाइजेशन एगोनिस्ट स्टॉक आपूर्तिकर्ता प्लेटलेट एगोनिस्ट जैविक अणु बायोएसिस कमजोर पड़ने की श्रृंखलाErratum
Formal Correction: Erratum: Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide
Posted by JoVE Editors on 12/08/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide. The Authors section was updated from:
Carmen H. Coxon1
Peter Rigsby1
1National Institute for Biological Standards and Control
to:
Carmen H. Coxon1
Peter Rigsby1
1Medicines and Healthcare products Regulatory Agency
