Reproduserbarhet og harmonisering i forskning ved hjelp av biologiske standarder: eksemplet på blodplateagonist kollagenrelatert peptid

Summary

Her presenterer vi en metode for å standardisere blodplateagonisten kollagenrelatert peptid tverrbundet (CRP-XL) ved hjelp av lystransmisjonsaggregometri. Mens protokollen er rettet mot blodplatefunksjon, kan den eksperimentelle prosessen brukes på de fleste biologiske molekyler og bioassays for å sikre vitenskapelig strenghet og reproduserbarhet.

Abstract

Justervesenet - vitenskapen om mål - er et emne få biologiske forskere blir undervist om i sin utdanning til skade for dem; Anvendelsen av enkle standardiseringsprosesser i daglig arbeidspraksis gir tillit til data og reproduserbarhet over avstand og tid.

Denne metoden demonstrerer hvordan man standardiserer et kjernelaboratorieeksperiment som brukes mye i hemostaseforskning og klinisk praksis, spesielt måling av respons på blodplatekollagenreseptor (glykoprotein [GP] VI) agonist kollagenrelatert peptid, tverrbundet (CRP-XL) ved lystransmisjonsaggregometri (LTA). Bruk av denne tilnærmingen vil sikre reproduserbarhet i laboratoriet og harmonisering mellom laboratorier, uavhengig av agonistlager eller leverandør. Det er viktig at denne metoden gjelder for andre blodplateagonister og faktisk mange andre biologiske molekyler og bioassay.

Prosessen som er skissert nedenfor innebærer å lage en 6-8-punkts fortynningsserie av 'standard' og 'testen' (materialet du sjekker) og kjøre dem side om side i en valgt analyse (i dette tilfellet LTA). CRP-XL brukes ved masse/volumkonsentrasjoner, men ikke alle materialer gir samme biologiske aktivitet ved en gitt konsentrasjon, så en fortynningsserie er laget for å sammenligne standard- og testmaterialet og bestemme hvilken konsentrasjon som er nødvendig for å gi tilsvarende aktivitet. Fortynningsserien må spenne over 0-100% aggregering. Data plottes ved hjelp av ikke-lineær regresjon, og EF_50-verdien for hver prøve (standard og test) bestemmes. For å tildele aktivitet, del EC_50-verdien av standarden med testen for å bestemme hvor mye mer eller mindre potent den er og juster konsentrasjonen tilsvarende. Denne tilnærmingen vil sikre at den samme biologiske "aktiviteten" blir lagt til analysen gang på gang.

Introduction

Mange av oss bruker biologiske agonister og antagonister i våre eksperimenter, oftest i en biologisk analyse som kvantifiserer deres effekt på cellefunksjon under spesifikke forhold. Metoden beskrevet her er for blodplateagonistens kollagenrelaterte peptid, kryssbundet (CRP-XL), en glykoprotein VI-agonist som aktiverer blodplater og hvis aktivitet kan måles i en rekke analyser (lystransmisjonsaggregometri, mikroskopi, flowcytometri, Ca²⁺ frigjøring, etc.), men agoniststandardiseringsprotokollen gjelder for enhver biologisk agonist / antagonist og / eller bioassay. Naturvitenskapene er velbevandret i bruk av standarder i deres daglige arbeidspraksis, og selskaper som utvikler bioterapeutiske medisiner i kommersiell sektor forstår verdien av å bruke referansestandarder¹, men de forblir underutnyttet av mange biologiske forskere, spesielt i det akademiske forskningsmiljøet, og deres mangel på bruk påvirker kvaliteten på vitenskapelig produksjon negativt.

CRP-XL er en spesifikk GPVI-spesifikk agonist som blodplatefeltet har brukt i flere tiår siden beskrivelsen i 1995², og hjelper samfunnet til å avgrense rollen til GPVI fra andre kollagenbindende blodplateproteiner helt siden ^3,4. Denne agonisten kan anskaffes fra en rekke kommersielle kilder eller produseres internt. Peptidmonomeren kan kjøpes fra en leverandør og deretter kryssbindes internt, eller dette kan gjøres av leverandøren mot en ekstra avgift. Ytterligere kostnadsbesparelser kan oppnås ved å redusere den nødvendige renheten ved levering (for eksempel 70% mot 95%). Det er heller ingen konsensus om hvordan CRP-XL skal lagres, med noen som velger kryolagring og andre kjøling, noen holder materialet lyofilisert til bruk, og andre lagrer det i oppløsning (vann eller buffer, avhengig av preferanse). Derfor er kvaliteten og sammensetningen av laboratoriebestandene ikke-standardisert eller harmonisert. Fordi denne agonisten brukes i en definert konsentrasjon (masse/volum) i stedet for aktivitetsenheter, vil styrken av CRP-XL i ett laboratorium, f.eks. ved 1 μg/ml, ikke være den samme som i et annet. Det er verdt å merke seg at andre blodplateagonister som brukes i felt allerede er standardiserte (f.eks. trombin, som leveres og brukes i aktivitetsenheter i stedet for masse / volum), så bevegelsen bort fra masse / volum til enheter av biologisk bør ikke være for utfordrende for samfunnet. Det bør også bemerkes at pasientrespons på blodplateagonister, inkludert CRP-XL, er variabel med hensyn til følsomhet overfor agonister samt deres evne til å respondere (grad av respons)⁵, så det er enda viktigere å bruke konsistente mengder agonistaktivitet i analysene.

Hvis blodplateagonister kan harmoniseres ved å bruke dem ved en definert aktivitet i stedet for vekt / volum, kan det sikres at et eksperiment i ett laboratorium er direkte sammenlignbart med det i andre laboratorier og kan reproduseres nøyaktig med tillit. Inntil feltet kommer til enighet om hvordan CRP-XL-aktivitet skal lagres og standardiseres, er det viktig å utføre regelmessige kontroller av materialet for å sikre konsistens i løpet av månedene/årene det brukes.

Aktivitetsverditildeling for biologiske standarder må gjøres gjennom samarbeidende, multisenterstudier (for eksempel ^6,7) og krever spesialkompetanse. Behovet for etablerte biologiske standarder for blodplateagonister har nylig blitt fremhevet av en samarbeidende multisenterstudie⁸ støttet av International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH); inntil en internasjonal CRP-XL-standard er tilgjengelig, kan forskere standardisere sitt eget materiale lokalt for å sikre konsistens over tid, og at nytt materiale hentet kommersielt eller internt er av sammenlignbar aktivitet med tidligere forberedelser, så vel som resten av samfunnet.

Protocol

Blod skal samles inn fra samtykkende friske frivillige og behandles i samsvar med lokale regler. Denne protokollen måler agonistindusert blodplateaggregering i blodplaterikt plasma (PRP) ved lystransmisjonsaggregometri (LTA). ISTH gir standardiserte protokoller, inkludert en 2013-metode for PRP-forberedelse og LTA⁹.  Samle fullblod i 4% natriumsitrat i henhold til ISTHs anbefalinger i samsvar med lokale etiske komitéregler. Ekskluder givere som har tatt NSAID i løpet av de siste 2 ukene.

1. Prosedyre for analyse

1. Ta en aliquot av lager CRP-XL og fortynn den i analysebuffer (Tyrodes¹⁰) (tabell 1) til en startkonsentrasjon som vil forårsake maksimal aggregering (se NOTE nedenfor trinn 1.3).
   MERK: I litteraturen vil en konsentrasjon på 1 μg/ml indusere maksimal aggregering, men noen laboratorier trenger høyere konsentrasjoner for å oppnå samme effekt - juster fortynningsserien tilsvarende
2. Lag en tilsvarende fortynningsserie med standarden (se NOTE nedenfor trinn 1.3 og figur 1) slik at konsentrasjonene er de samme som testreagenset.
3. Produser en 6- til 8-punkts fortynningsserie for testen og standarden, igjen i analysebufferen, som tar aggregeringsresponsen fra 100 % til 0 % aggregering. Et eksempel som viser en 8-punkts konsentrasjonskurve for fortynningsserier er vist i tabell 2.
   MERK: Noen laboratorier legger til agonist ved totalt 10% analysevolum, for eksempel 50 μL agonist til 450 μL blodplater, slik at de fortynner en 10x konsentrasjon til en endelig 1x konsentrasjon i analysen, mens andre legger til mindre (mer konsentrerte) volumer av agonist, for eksempel 5 μL agonist til 495 μL blodplater - bare sørg for at fortynningsserien passer for analysen med tanke på hvordan volumforskyvningen påvirker blodplatekonsentrasjonen - igjen, vær konsekvent. I eksemplet tilsettes 30 μL 10x agonist til 270 μL blodplaterikt plasma (PRP).
4. Når blodplatene er uthvilte og klare til bruk, allikoter de i LTA-kyvetter, tilsett en rørestang og la dem nå 37 °C i holdebrønnene.
5. Når du har fått temperatur, plasserer du kuvetten(e) i aggregometeret og begynner å registrere sporet/sporene. Legg agonisten (under omrøring) og registrer dataene.
6. Gjenta trinn 1.4 for hver konsentrasjon av testen og standarden til dataene som trengs for å plotte kurvene er samlet inn (eksempelkurver vist i figur 2).
7. Beregn styrken til testreagenset i forhold til standarden; Igjen, bruk hvilken som helst beregning - maksimal aggregering eller område under kurven - så lenge det er konsistens og analysemodellen passer til dataene på riktig måte.

2. Kontrollere konsentrasjonskurvene

1. Sjekk først at konsentrasjonsresponskurvene er parallelle. Det er mange programvarepakker som gjør dette, men her er prosessen beskrevet for Graphpad Prism (se figur 3).
   1. Skriv inn dataene slik at log(konsentrasjon) er på X-aksen og respons (% maksimal aggregering/AUC) er på Y-aksen (figur 3A)
   2. Transformere CRP-XL-konsentrasjoner (figur 3B)
   3. Velg Ikke-lineær regresjon fra Analyse-funksjonene , og bruk ligningen for dose-respons-stimulering/-hemming.
   4. Velg logg (agonist) vs. respons (variabel stigningstall) - bruk 3- eller 4-veis tilpasning avhengig av hvilken som er best for dataene.
   5. Finn ut om kurvene er parallelle ved å bruke kategorien Sammenlign (som vist i figur 3C), og klikk knappen for å sammenligne datasettene for å sikre at stigningstallet (bakkehellingen) og asymptotene ( toppen og bunnen av kurvene) er likeverdige. I dette eksemplet er bakkehellingen for testen 2.279, og standarden er 2.025 som gir et forhold på 1.125.
   6. Hvis skråningene er parallelle (for eksempel et akseptkriterium for stigningsforhold mellom 0,8-1,25) og asymptotene er ekvivalente, fortsett med beregning av styrke (EC₅₀) ved hjelp av trinn 2.1.3 og 2.1.4. I eksemplet vist her har asymptotene blitt begrenset da evalueringen i trinn 2.1.5 bekreftet at asymptotene er ekvivalente.
   7. Del EC_50-verdien av standarden med testen for å bestemme den relative styrken. I eksemplet vist her er test/standard (0,07259/0,1498) = 0,4846, det vil si at 'testen' er halvparten så potent som standarden.
   8. Juster masse / volumkonsentrasjoner for å ta hensyn til forskjellen i potens, dvs. hvis standarden ble brukt tidligere ved 1 μg / ml, vil det nye materialet bli brukt ved 1 / 0,4846 = 2,063 μg / ml) for å sikre at sammenlignbare mengder aktivt materiale blir brukt i eksperimenter

Representative Results

Figur 1 er en diagrammatisk fremstilling av en fortynningsserie og ment å markere at en fortynningsserie er nødvendig for både standarden og testen. Figur 2A viser aggregeringsspor for standarden, mens testdataene er vist i figur 2B. Ved 0,075 μg/ml er det en klar respons på standarden, mens for testen er den tilsvarende konsentrasjonen (0,075 μg/ml) flat, dvs. ingen respons. Disse dataene brukes til å plotte de påfølgende grafene for å gi EF₅₀. I eksemplet vist her ble 100 % maksimal aggregering brukt til å plotte konsentrasjon-responskurven og bestemme EC₅₀, som vist i figur 3.

Figur 1: Grafisk beskrivelse av testens to fortynningsserier (venstre) og standard (høyre). Fra og med den øverste konsentrasjonen (foreslått konsentrasjon: 10 μg / ml crp-xl), gjøres sekvensielle 1 av 2 fortynninger parallelt over 8 punkter (>3 loggenheter). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Aggregeringsspor for standardserien (venstre) og testfortynningsserien (høyre). Når blodplateaggregeringen fortsetter (x-aksen), øker mengden lys som passerer gjennom prøven og når sensoren (y-aksen). (A) Standard. (B) Test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Dataregistrering og analyse. (A) Data legges inn, (B) transformeres og (C,D) analyseres for parallellitet (be programvaren fortelle om bakkeskråningene og asymptotene er sammenlignbare [C]). (E) Hvis kurvene er parallelle, bestem styrken (EC₅₀) ved hjelp av ikke-lineær regresjonskurvetilpasning. (F) Plottede transformerte data. Se metoden for mer informasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tyrodes buffer9
Bestanddeler	Konsentrasjon	Kommentarer
NaCl	134 mM
Na2HPO4	0,34 mM
KCl	2,9 mM
NaHCO3	12 mM
4-(2- hydroksyetyl)-1-piperazineetansulfonsyre (HEPES)	20 mM
Glukose	5 mM
MgCl2	1 mM	pH 7,3

Tabell 1: Sammensetning av Tyrodes buffer.

8-punkts fortynningsserie
Fortynning 1	10 mikrogram/ml
Fortynning 2	5 mikrogram/ml
Fortynning 3	2,5 μg/ml
Fortynning 4	1,25 μg/ml
Fortynning 5	0,625 μg/ml
Fortynning 6	0,3125 mikrog/ml
Fortynning 7	0,15625 mikrog/ml
Fortynning 8	0,073125 mikrog/ml

Tabell 2: Et eksempel som viser en 8-punkts fortynningsserie.

Discussion

Som vist her, er prosessen med å standardisere materialene veldig grei. Selv om det krever litt tid å evaluere nye partier av materiale og / eller for å kontrollere at den nåværende batchen er stabil og ikke mister aktivitet over tid, er belønningen at eksperimenter er reproduserbare gang på gang og sammenlignbare over år i stedet for bare levetiden til en batch av reagens. Det betyr også at andre forskere nøyaktig kan gjenskape analyseforhold og at samfunnet er harmonisert på globalt nivå. Kritiske trinn i protokollen inkluderer fullblodsinnsamling og PRP-klargjøring⁹, samt presisjon ved utarbeidelse av fortynningsserien. Det er også viktig å sikre at test- og standardkurvene er parallelle før du fortsetter med EF_{50-sammenligningen} . Hvis linjene ikke er parallelle, eller asymptotene ikke er ekvivalente, kan det indikere at testen og standardmaterialet er forskjellige til en viss grad.

Alle som jobber i biologiske vet at biologiske analyser ikke alltid utfører konsekvent, så man må være oppmerksom på dette når man vurderer dataene. I eksemplet vist her, selv om vi bruker de samme giverne til å måle styrken til to svært like, om ikke identiske, materialer, er bakkeskråningene og asymptotene ikke identiske. Likevel aksepterer vi en viss variasjon og konkluderer med at kurvene i dette tilfellet er parallelle, og derfor egnet til å sammenligne og justere potens. Biologiske molekyler er store og komplekse, og posttranslasjonelle modifikasjoner under produksjonen kan påvirke deres styrke i bioassay. Standardisering av biomolekyler og bioassays kan ikke gjøres ved bruk av bare masse eller volum og må gjøres ved å kvantifisere og sammenligne biologisk aktivitet i et bioassay¹¹. Man må bruke sin opplæring og erfaring til å evaluere dataene i sammenheng med analysen.

Begrensninger av teknikken er at selv om dataene kan indikere et problem med reagensen (e), kan den ikke fortelle deg hva problemet er. Videre arbeid vil være nødvendig for å finne ut hvorfor materialene ikke er sammenlignbare. I en ideell verden ville ethvert materiale som er kritisk for eksperiment(er) og påfølgende vitenskapelige konklusjoner bli verifisert ved massespektroskopi, men dette er ikke alltid et alternativ. Men hvis dataene ikke er sammenlignbare, er ytterligere undersøkelser fortsatt berettiget i noen kapasitet. En annen begrensning av denne tilnærmingen er tiden og ressursene som trengs for å gjøre det. Ideelt sett bør testen og standarden sammenlignes hos 3-6 donorer for å gi en viss tillit til å tildele biologisk aktivitet til materialet, men vi føler at dette er berettiget ved å støtte reproduserbarhet og pålitelighet. Standardisering av biologisk materiale er ikke nødvendig hver gang eksperimenter kjøres, men som et minimum bør det gjøres for hvert nytt parti agonister, helst oftere, avhengig av stabilitet og bruk. Faktisk, hvis en standard blir gjort tilgjengelig, er dette noe som internasjonale standardiseringsorganisasjoner kan gi klarhet om.

Mens eksemplet vist her er for CRP-XL i sammenheng med måling av blodplateaggregering, er protokollen for å sammenligne den biologiske aktiviteten til biomolekyler i bioassays allment anvendelig over hele sektoren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.