使用生物学标准品进行研究的可重复性和协调性：以血小板激动剂胶原相关肽为例

Summary

在这里，我们提出了一种使用光透射聚集法标准化血小板激动剂胶原相关肽交联 （CRP-XL） 的方法。虽然该方案针对的是血小板功能，但实验过程可以应用于大多数生物分子和生物测定，以确保科学的严谨性和可重复性。

Abstract

计量学 - 测量科学 - 是很少有生物科学家在培训中被教导的学科，这对他们不利;将简单的标准化流程应用于日常工作实践，可以提高数据的可信度以及随距离和时间变化的可重复性。

该方法演示了如何标准化止血研究和临床实践中广泛使用的核心实验室实验，特别是通过透光聚集法 （LTA） 测量对血小板胶原受体（糖蛋白 [GP]VI）激动剂胶原相关肽交联 （CRP-XL） 的反应。使用这种方法将确保实验室内的可重复性和实验室间的协调，无论激动剂库存或供应商如何。重要的是，这种方法适用于其他血小板激动剂，实际上也适用于许多其他生物分子和生物测定。

下面概述的过程包括制作“标准品”和“测试品”（您正在检查的材料）的 6-8 点稀释系列，并在选定的测定（在本例中为 LTA）中并排运行它们。CRP-XL 在质量/体积浓度下使用，但并非每种材料在给定浓度下都具有相同的生物活性，因此进行稀释系列以比较标准品和测试材料，并确定提供等效活性所需的浓度。稀释系列必须跨越 0-100% 的聚集。使用非线性回归绘制数据，并确定每个样品（标准品和测试品）的EC₅₀ 值。要分配活性，请将标准品的 EC₅₀ 值除以测试值，以确定其效力或多或少，并相应地调整浓度。这种方法将确保一次又一次地将相同的生物“活性”添加到测定中。

Introduction

我们中的许多人在实验中使用生物激动剂和拮抗剂，最常见的是在生物测定中，该测定量化了它们在特定条件下对细胞功能的影响。这里描述的方法适用于血小板激动剂胶原相关肽交联 （CRP-XL），这是一种激活血小板的糖蛋白 VI 激动剂，其活性可以在各种测定法（光透射聚集法、显微镜、流式细胞术、Ca²⁺ 释放等）中测量，但激动剂标准化方案适用于任何生物激动剂/拮抗剂和/或生物测定法。物理科学精通在日常工作实践中使用标准，在商业领域开发生物治疗药物的公司了解使用参考标准^的价值1，但许多生物科学家，特别是在学术研究界，它们仍然没有得到充分利用，缺乏使用会对科学产出的质量产生负面影响。

CRP-XL 是一种特异性 GPVI 特异性激动剂，自 1995 年被描述以来，血小板领域已经使用了几十年²，帮助社区自 ^3,4 以来将 GPVI 的作用与其他胶原结合血小板蛋白的作用区分开来。这种激动剂可以从各种商业来源采购或内部生产。肽单体可以从供应商处购买，然后在内部进行交联，也可以由供应商支付额外费用。通过降低交付时所需的纯度（例如，70% 对 95%），可以进一步节省成本。关于CRP-XL的储存方式也没有达成共识，有些选择低温储存，有些选择冷藏，有些选择将材料冻干直到使用，有些则将其储存在溶液（水或缓冲液，取决于偏好）中。因此，实验室储备的质量和组成是非标准化或协调的。由于该激动剂以规定的浓度（质量/体积）而不是活性单位使用，因此在一个实验室中，CRP-XL的效力（例如，1μg/mL）将与另一个实验室不同。值得注意的是，该领域使用的其他血小板激动剂已经标准化（例如，凝血酶，其以活性单位而不是质量/体积提供和使用），因此从质量/体积到生物单位的运动对社区来说应该不会太具有挑战性。还应该注意的是，患者对血小板激动剂（包括 CRP-XL）的反应在对激动剂的敏感性以及反应能力（反应^{程度）方面}是可变的5，因此在测定中使用一致量的激动剂活性更为重要。

如果血小板激动剂可以通过在规定的活性而不是重量/体积下使用它们来协调，则可以确保一个实验室的实验与其他实验室的实验直接比较，并且可以放心地准确再现。在现场就如何存储和标准化 CRP-XL 活动达成一致之前，必须对材料进行定期检查，以确保其在使用月/年内的一致性。

生物标准品的活性值分配必须通过协作的多中心研究（例如^6,7）完成，并且需要专业知识。最近，由国际血栓形成和止血学会 （ISTH） 支持的一项多中心合作研究⁸ 强调了建立血小板激动剂生物学标准的必要性;在国际CRP-XL标准可用之前，研究人员可以在当地对自己的材料进行标准化，以确保长期保持一致性，并且商业或内部采购的新材料与以前的制剂以及社区其他部分的制备具有相当的活性。

Protocol

应从同意的健康志愿者处采集血液，并按照当地法规进行处理。该方案通过透光聚集法（LTA）测量激动剂诱导的富血小板血浆（PRP）中的血小板聚集。ISTH 提供标准化方案，包括 2013 年 PRP 制备方法和 LTA⁹。 根据当地伦理委员会的规定，根据ISTH的建议，将全血收集到4%柠檬酸钠中。排除在过去 2 周内服用过任何非甾体抗炎药的供体。

1.检测程序

1. 取等分试样的储备CRP-XL，并在测定（Tyrodes¹⁰）缓冲液（表1）中将其稀释至将导致最大聚集的起始浓度（参见步骤1.3下面的注释）。
   注：在文献中，1 μg/mL 的浓度将诱导最大聚集，但一些实验室需要更高的浓度才能达到相同的效果 - 相应地调整稀释度系列
2. 用标准品进行相应的稀释系列（参见步骤 1.3 和 图 1 下面的注释），使浓度与测试试剂相同。
3. 再次在测定缓冲液中为测试品和标准品生成 6 至 8 点稀释系列，使聚集响应从 100% 降至 0%。 表2显示了8点稀释系列浓度曲线的示例。
   注：一些实验室以总共 10% 的测定体积添加激动剂，例如，将 50 μL 激动剂添加到 450 μL 血小板中，以便它们在测定中将 10 倍浓度稀释至最终 1 倍浓度，而其他实验室则添加更小（更浓缩）体积的激动剂，例如，将 5 μL 激动剂添加到 495 μL 血小板中 - 只需确保稀释系列适合测定，同时牢记体积置换如何影响血小板浓度 - 再次保持一致。在该示例中，将 30 μL 10x 激动剂加入到 270 μL 富血小板血浆 （PRP） 中。
4. 一旦血小板静置并准备好使用，将它们分装到LTA比色皿中，加入搅拌棒，并让它们在保持孔中达到37°C。
5. 达到温度后，将比色皿放入聚集计并开始记录迹线。加入激动剂（搅拌）并记录数据。
6. 对测试和标准品的每种浓度重复步骤1.4，直到收集到绘制曲线所需的数据（示例曲线如图 2所示）。
7. 计算测试试剂相对于标准品的效力;同样，使用任何指标 - 最大聚合或曲线下面积 - 只要存在一致性并且分析模型适当拟合数据即可。

2. 检查浓度曲线

1. 首先，检查浓度响应曲线是否平行。有许多软件包可以做到这一点，但这里描述了 Graphpad Prism 的过程（参见 图 3）。
   1. 输入数据，使log（浓度）位于X轴上，响应（%最大聚集/ AUC）位于Y轴上（图3A）
   2. 转换CRP-XL浓度（图3B）
   3. 从分析函数中选择非线性回归，并使用剂量反应刺激/抑制方程。
   4. 选择对数（激动剂）与响应（可变斜率）- 使用3向或4向拟合，具体取决于哪种拟合最适合数据。
   5. 使用 “比较 ”选项卡确定曲线是否平行（ 如图 3C 所示），然后单击按钮比较数据集，以确保斜率（山坡）和渐近线（曲线 的顶部 和 底部 ）相等。在本例中，测试的 山坡为 2.279，标准坡度为 2.025，比率为 1.125。
   6. 如果斜率是平行的（例如，斜率比在0.8-1.25之间的验收标准）并且渐近线是等效的，则使用步骤2.1.3和2.1.4继续进行效力（EC₅₀）计算。在此处显示的示例中，渐近线已受到约束，因为步骤 2.1.5 中的评估确认渐近线是等效的。
   7. 将标准的 EC₅₀ 值除以测试值以确定相对效力。在此处显示的示例中，test/standard （0.07259/0.1498） = 0.4846，即“test”的效力是标准的一半。
   8. 调整质量/体积浓度以考虑效力差异，即，如果之前以 1 μg/mL 的浓度使用标准品，则新材料的使用浓度为 1/0.4846 = 2.063 μg/mL），以确保在实验中使用相当量的活性材料

Representative Results

图 1 是稀释系列的示意图，旨在强调标准品和测试都需要稀释系列。 图2A 显示了标准的聚合迹线，而测试数据如图 2B所示。在 0.075 μg/mL 时，对标准品有明确的响应，而对于测试，相应的浓度 （0.075 μg/mL） 是平坦的，即没有响应。这些数据用于绘制后续图形，以给出 EC₅₀。在此所示的示例中，使用100%最大聚集来绘制浓度-响应曲线并确定EC₅₀， 如图3所示。

图 1：测试（左）和标准品（右）的两种稀释系列的图形说明。 从最高浓度（建议浓度：10 μg/mL CRP-XL）开始，在 8 个点（>3 个对数单位）上平行进行连续 1/2 稀释。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2：标准品（左）和测试稀释系列（右）的聚集迹线。 随着血小板聚集的进行（x 轴），通过样品并到达传感器的光量增加（y 轴）。（a） 标准。（B） 测试. 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3：数据输入和分析。 （A） 输入数据，（B） 转换，（C，D） 分析并行性（要求软件判断希尔坡度和渐近线是否具有可比性 [C]）。（E） 如果曲线平行，则使用非线性回归曲线拟合确定效力 （EC₅₀）。（F） 绘制的转换数据。有关更多详细信息，请参阅方法。请点击这里查看此图的较大版本.

Tyrodes 缓冲液9
成分	浓度	评论
氯化钠	134 毫米
钠2HPO4	0.34毫米
氯化钾	2.9 毫米
氢氧化钠3	12 毫米
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	20毫米
葡萄糖	5 毫米
氯化镁2	1 毫米	pH 值 7.3

表1：Tyrodes缓冲液的组成。

8点稀释系列
稀释度 1	10微克/毫升
稀释度 2	5微克/毫升
稀释度 3	2.5微克/毫升
稀释度 4	1.25微克/毫升
稀释度 5	0.625微克/毫升
稀释度 6	0.3125微克/毫升
稀释度 7	0.15625微克/毫升
稀释度 8	0.073125微克/毫升

表 2：显示 8 点稀释系列的示例。

Discussion

如图所示，材料标准化的过程非常简单。虽然评估新批次的材料和/或检查当前批次的材料是否稳定且不会随着时间的推移而失去活性，但回报是实验可以一次又一次地重复，并且可以在数年内进行比较，而不仅仅是一批试剂的寿命。这也意味着其他研究人员可以准确地重建检测条件，并且社区在全球范围内得到协调。方案中的关键步骤包括全血采集和PRP制备⁹，以及进行稀释系列时的精确度。在进行 EC₅₀ 比较之前，确保测试曲线和标准曲线平行也很重要。如果线不平行，或者渐近线不等效，则可能表明测试材料和标准材料在某种程度上不同。

每个从事生物科学工作的人都知道，生物检测并不总是始终如一地执行，因此在评估数据时需要注意这一点。在这里显示的示例中，即使我们使用相同的供体来测量两种非常相似（如果不是完全相同）材料的效力，山坡和渐近线也不完全相同。然而，我们接受一定程度的可变性，并得出结论，在这种情况下，曲线是平行的，因此适合比较和调整效力。生物分子大而复杂，制造过程中的翻译后修饰会影响其在生物测定中的效力。生物分子和生物测定的标准化不能仅使用质量或体积来完成，必须通过量化和比较生物测定中的生物 活性 来完成¹¹.必须利用他/她的培训和经验来评估分析环境中的数据。

该技术的局限性在于，虽然数据可能表明试剂存在问题，但它无法告诉您问题是什么。需要进一步的工作来确定为什么这些材料没有可比性。在理想情况下，任何对实验和随后的科学结论至关重要的材料都将通过质谱进行验证，但这并不总是一种选择。但是，如果数据不具有可比性，则仍有必要以某种身份进行进一步调查。这种方法的另一个局限性是这样做所需的时间和资源。理想情况下，应在 3-6 个供体中比较测试和标准品，以提供为材料分配生物活性的一定信心，但我们认为这可以通过支持可重复性和可靠性来证明是合理的。不需要在每次进行实验时都对生物材料进行标准化，但至少应该对每批新的激动剂进行标准化，最好更频繁地进行，具体取决于稳定性和用途。事实上，如果有一个标准可用，国际标准化组织可以对此提供澄清。

虽然这里显示的示例是在测量血小板聚集的背景下针对 CRP-XL，但在生物测定中比较生物分子生物活性的方案在整个行业中广泛适用。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.