Reproductibilité et harmonisation dans la recherche à l’aide d’étalons biologiques : l’exemple du peptide associé au collagène agoniste plaquettaire

Summary

Nous présentons ici une méthode pour standardiser le peptide réticulé lié au collagène agoniste plaquettaire (CRP-XL) à l’aide de l’agrégation par transmission de la lumière. Bien que le protocole soit axé sur la fonction plaquettaire, le processus expérimental peut être appliqué à la plupart des molécules biologiques et des essais biologiques afin d’assurer la rigueur scientifique et la reproductibilité.

Abstract

La métrologie - la science de la mesure - est un sujet que peu de biologistes apprennent dans leur formation à leur détriment ; L’application de processus de standardisation simples aux pratiques de travail quotidiennes permet d’avoir confiance dans les données et d’assurer la reproductibilité à distance et dans le temps.

Cette méthode montre comment normaliser une expérience de laboratoire de base largement utilisée dans la recherche sur l’hémostase et la pratique clinique, en particulier, en mesurant les réponses au peptide lié au collagène agoniste du récepteur du collagène plaquettaire (glycoprotéine [GP]VI), réticulé (CRP-XL) par agrégation de transmission de la lumière (LTA). L’utilisation de cette approche assurera la reproductibilité intra-laboratoire et l’harmonisation inter-laboratoire, quel que soit le stock d’agonistes ou le fournisseur. Il est important de noter que cette méthode est applicable à d’autres agonistes plaquettaires et, en fait, à de nombreuses autres molécules biologiques et essais biologiques.

Le processus décrit ci-dessous consiste à faire une série de dilution de 6 à 8 points de la « norme » et du « test » (le matériau que vous vérifiez) et à les exécuter côte à côte dans un test choisi (dans ce cas, LTA). Le CRP-XL est utilisé à des concentrations massiques/volumiques, mais tous les matériaux ne donnent pas la même activité biologique à une concentration donnée, de sorte qu’une série de dilution est effectuée pour comparer l’étalon et le matériau d’essai et déterminer quelle concentration est nécessaire pour donner une activité équivalente. La série de dilution doit couvrir une agrégation de 0 à 100 %. Les données sont tracées à l’aide d’une régression non linéaire et la valeur EC₅₀ de chaque échantillon (étalon et test) est déterminée. Pour attribuer l’activité, divisez la valeur EC₅₀ de l’étalon par celle de l’essai pour déterminer sa puissance plus ou moins élevée et ajustez la concentration en conséquence. Cette approche garantira que la même « activité » biologique est ajoutée à l’essai encore et encore.

Introduction

Beaucoup d’entre nous utilisent des agonistes et des antagonistes biologiques dans nos expériences, le plus souvent dans un test biologique qui quantifie leur effet sur la fonction cellulaire dans des conditions spécifiques. La méthode décrite ici concerne le peptide réticulé (CRP-XL), un agoniste de la glycoprotéine VI qui active les plaquettes et dont l’activité peut être mesurée dans une variété de tests (agrégation par transmission de lumière, microscopie, cytométrie en flux, libération de Ca²⁺ , etc.), mais le protocole de standardisation des agonistes est applicable à tout agoniste/antagoniste biologique et/ou essai biologique. Les sciences physiques connaissent bien l’utilisation des normes dans leurs pratiques de travail quotidiennes, et les entreprises qui développent des médicaments biothérapeutiques dans le secteur commercial comprennent la valeur de l’utilisation d’étalons de référence¹, mais elles restent sous-utilisées par de nombreux scientifiques en biologie, en particulier dans la communauté de la recherche universitaire, et leur manque d’utilisation a un impact négatif sur la qualité de la production scientifique.

CRP-XL est un agoniste spécifique du GPVI que le domaine plaquettaire utilise depuis des décennies depuis sa description en 1995², aidant la communauté à délimiter le rôle du GPVI de celui des autres protéines plaquettaires de liaison au collagène depuis ^3,4. Cet agoniste peut être obtenu auprès de diverses sources commerciales ou produit en interne. Le monomère peptidique peut être acheté auprès d’un fournisseur, puis réticulé en interne, ou cela peut être fait par le fournisseur moyennant des frais supplémentaires. Des économies supplémentaires peuvent être réalisées en réduisant la pureté requise à la livraison (70 % contre 95 %, par exemple). Il n’y a pas non plus de consensus sur la façon dont le CRP-XL devrait être stocké, certains optant pour le stockage cryogénique et d’autres la réfrigération, certains gardant le matériau lyophilisé jusqu’à son utilisation, et d’autres le stockant en solution (eau ou tampon, selon les préférences). Par conséquent, la qualité et la composition des stocks de laboratoire ne sont ni normalisées ni harmonisées. Étant donné que cet agoniste est utilisé à une concentration définie (masse/volume) plutôt qu’à des unités d’activité, la puissance de la CRP-XL dans un laboratoire, par exemple à 1 μg/mL, ne sera pas la même qu’un autre. Il convient de noter que d’autres agonistes plaquettaires utilisés dans le domaine sont déjà normalisés (par exemple, la thrombine, qui est fournie et utilisée en unités d’activité plutôt qu’en masse/volume), de sorte que le passage de la masse/volume aux unités biologiques ne devrait pas être trop difficile pour la communauté. Il convient également de noter que les réponses des patients aux agonistes plaquettaires, y compris la CRP-XL, sont variables en termes de sensibilité aux agonistes ainsi que de capacité de réponse (étendue de la réponse)⁵, il est donc encore plus important d’utiliser des quantités constantes d’activité agoniste dans les tests.

Si les agonistes plaquettaires peuvent être harmonisés en les utilisant à une activité définie plutôt qu’à un poids/volume, on peut s’assurer qu’une expérience dans un laboratoire est directement comparable à celle d’autres laboratoires et peut être reproduite avec précision et confiance. Jusqu’à ce que le terrain parvienne à un accord sur la façon de stocker et de normaliser l’activité du CRP-XL, il est essentiel d’effectuer des contrôles réguliers sur le matériau pour s’assurer de sa cohérence au cours des mois/années au cours desquels il est utilisé.

L’attribution de la valeur de l’activité pour les étalons biologiques doit être effectuée par le biais d’études collaboratives et multicentriques (par exemple ^6,7) et nécessite une expertise spécialisée. La nécessité d’établir des normes biologiques pour les agonistes plaquettaires a récemment été mise en évidence par une étude multicentrique collaborative⁸ soutenue par la Société internationale de thrombose et d’hémostase (ISTH) ; Jusqu’à ce qu’une norme internationale CRP-XL soit disponible, les chercheurs peuvent normaliser leur propre matériel localement pour assurer la cohérence dans le temps, et que le nouveau matériel provenant du commerce ou de l’interne a une activité comparable à celle des préparations précédentes, ainsi qu’à celle du reste de la communauté.

Protocol

Le sang doit être prélevé sur des volontaires sains consentants et traité conformément aux règles locales. Ce protocole mesure l’agrégation plaquettaire induite par les agonistes dans le plasma riche en plaquettes (PRP) par agrégation par transmission de lumière (LTA). L’ISTH fournit des protocoles normalisés, y compris une méthode de 2013 pour la préparation du PRP et LTA⁹.  Prélever le sang total dans du citrate de sodium à 4 % conformément aux recommandations de l’ISTH, conformément aux règles du comité d’éthique local. Exclure les donneurs qui ont pris des AINS au cours des 2 dernières semaines.

1. Procédure d’analyse

1. Prélever une aliquote de CRP-XL et la diluer dans un tampon d’essai (Tyrodes¹⁰) (tableau 1) jusqu’à une concentration initiale qui provoquera une agrégation maximale (voir la NOTE ci-dessous l’étape 1.3).
   REMARQUE : Dans la littérature, une concentration de 1 μg/mL induira une agrégation maximale, mais certains laboratoires ont besoin de concentrations plus élevées pour obtenir le même effet - ajustez la série de dilution en conséquence
2. Faire une série de dilution correspondante avec l’étalon (voir la REMARQUE ci-dessous l’étape 1.3 et la figure 1) de manière à ce que les concentrations soient les mêmes que celles du réactif d’essai.
3. Produire une série de dilution de 6 à 8 points pour l’essai et l’étalon, toujours dans un tampon d’essai, qui fait passer la réponse d’agrégation de 100 % à 0 % d’agrégation. Le tableau 2 montre un exemple de courbe de concentration d’une série de dilution à 8 points.
   REMARQUE : Certains laboratoires ajoutent un agoniste à un volume total de 10 % du dosage, par exemple, 50 μL d’agoniste à 450 μL de plaquettes, de sorte qu’ils diluent une concentration de 10x à une concentration finale de 1x dans le test, tandis que d’autres ajoutent des volumes plus petits (plus concentrés) d’agoniste, par exemple, 5 μL d’agoniste pour 495 μL de plaquettes - assurez-vous simplement que la série de dilution est appropriée pour le test en tenant compte du déplacement du volume affecte la concentration plaquettaire - encore une fois, soyez cohérent. Dans l’exemple, 30 μL d’agoniste 10x sont ajoutés à 270 μL de plasma riche en plaquettes (PRP).
4. Une fois que les plaquettes sont reposées et prêtes à l’emploi, aliquotez-les dans des cuvettes LTA, ajoutez une barre d’agitation et laissez-les atteindre 37 °C dans les puits de rétention.
5. Une fois à température, placez la ou les cuvettes dans l’agrégateur et commencez à enregistrer la ou les traces. Ajouter l’agoniste (en agitant) et enregistrer les données.
6. Répétez l’étape 1.4 pour chaque concentration de l’essai et de l’étalon jusqu’à ce que les données nécessaires au tracé des courbes aient été recueillies (exemples de courbes illustrés à la figure 2).
7. Calculer la puissance du réactif d’essai par rapport à celle de l’étalon ; Encore une fois, utilisez n’importe quelle métrique (agrégation maximale ou aire sous la courbe) tant qu’il y a cohérence et que le modèle d’analyse s’adapte de manière appropriée aux données.

2. Vérification des courbes de concentration

1. Tout d’abord, vérifiez que les courbes de réponse à la concentration sont parallèles. Il existe de nombreux logiciels qui font cela, mais ici le processus est décrit pour Graphpad Prism (voir Figure 3).
   1. Entrez les données de manière à ce que log(concentration) soit sur l’axe X et que la réponse (% d’agrégation maximale/ASC) soit sur l’axe Y (Figure 3A)
   2. Transformer les concentrations de CRP-XL (Figure 3B)
   3. Sélectionnez Régression non linéaire dans les fonctions d’analyse et utilisez l’équation pour la stimulation/inhibition dose-réponse.
   4. Sélectionnez le journal (agoniste) par rapport à la réponse (pente variable) - utilisez un ajustement à 3 ou 4 voies selon ce qui convient le mieux aux données.
   5. Déterminez si les courbes sont parallèles à l’aide de l’onglet Comparer (comme illustré à la figure 3C) et cliquez sur le bouton pour comparer les jeux de données afin de vous assurer que la pente (pente de colline) et les asymptotes ( le haut et le bas des courbes) sont équivalentes. Dans cet exemple, la pente de Hill pour l’essai est de 2,279 et celle de la norme est de 2,025, ce qui donne un rapport de 1,125.
   6. Si les pentes sont parallèles (par exemple, un critère d’acceptation du rapport de pente entre 0,8 et 1,25) et que les asymptotes sont équivalentes, procédez au calcul de la puissance (EC₅₀) en utilisant les étapes 2.1.3 et 2.1.4. Dans l’exemple présenté ici, les asymptotes ont été contraintes car l’évaluation de l’étape 2.1.5 a confirmé que les asymptotes sont équivalentes.
   7. Divisez la valeur EC₅₀ de l’étalon par celle de l’essai pour déterminer la puissance relative. Dans l’exemple présenté ici, test/standard (0,07259/0,1498) = 0,4846, c’est-à-dire que le « test » est deux fois moins puissant que le standard.
   8. Ajuster les concentrations massiques/volumiques pour tenir compte de la différence de puissance, c’est-à-dire que si l’étalon était utilisé auparavant à 1 μg/mL, le nouveau matériau serait utilisé à 1/0,4846 = 2,063 μg/mL) pour s’assurer que des quantités comparables de matière active sont utilisées dans les expériences.

Representative Results

La figure 1 est une représentation schématique d’une série de dilution et vise à mettre en évidence qu’une série de dilution est nécessaire à la fois pour l’étalon et pour l’essai. La figure 2A montre les traces d’agrégation de la norme, tandis que les données de test sont illustrées à la figure 2B. À 0,075 μg/mL, il y a une réponse claire à la norme, tandis que pour le test, la concentration correspondante (0,075 μg/mL) est plate, c’est-à-dire qu’il n’y a pas de réponse. Ces données sont utilisées pour tracer les graphiques suivants afin d’obtenir l’EC₅₀. Dans l’exemple illustré ici, une agrégation maximale de 100 % a été utilisée pour tracer la courbe concentration-réponse et déterminer l’EC₅₀, comme le montre la figure 3.

Figure 1 : Description graphique des deux séries de dilutions de l’essai (à gauche) et de l’étalon (à droite). En commençant par la concentration maximale (concentration suggérée : 10 μg/mL CRP-XL), des dilutions séquentielles de 1 sur 2 sont effectuées en parallèle sur 8 points (>3 unités logarithmiques). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Traces d’agrégation pour la série de dilution standard (à gauche) et la série de dilution d’essai (à droite). Au fur et à mesure que l’agrégation plaquettaire se poursuit (axe des abscisses), la quantité de lumière traversant l’échantillon et atteignant le capteur augmente (axe des ordonnées). (A) Standard. (B) Test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Saisie et analyse des données. (A) Les données sont saisies, (B) transformées et (C,D) analysées pour le parallélisme (demandez au logiciel de dire si les pentes et les asymptotes de Hill sont comparables [C]). (E) Si les courbes sont parallèles, déterminer la puissance (EC₅₀) à l’aide d’un ajustement de courbe de régression non linéaire. (F) Données transformées tracées. Veuillez vous référer à la méthode pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tampon Tyrodes9
Constituants	Concentration	Commentaires
NaCl	134 millimètres d’altitude
Na2HPO4	0,34 millimètre métrique
Kcl	2,9 millions d’euros
NaHCO3	12 mM
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)	20 mM
Glucose	5 mM
MgCl2	1 mM	pH 7,3

Tableau 1 : Composition de la zone tampon de Tyrodes.

Série de dilution en 8 points
Dilution 1	10 μg/mL
Dilution 2	5 μg/mL
Dilution 3	2,5 μg/mL
Dilution 4	1,25 μg/mL
Dilution 5	0,625 μg/mL
Dilution 6	0,3125 μg/mL
Dilution 7	0,15625 μg/mL
Dilution 8	0,073125 μg/mL

Tableau 2 : Exemple d’une série de dilution à 8 points.

Discussion

Comme le montre ici, le processus de normalisation des matériaux est très simple. Bien qu’il faille un peu de temps pour évaluer de nouveaux lots de matériel et/ou pour vérifier que le lot actuel est stable et ne perd pas d’activité au fil du temps, la récompense est que les expériences sont reproductibles à maintes reprises et comparables sur des années plutôt que sur la durée de vie d’un lot de réactif. Cela signifie également que d’autres chercheurs peuvent recréer avec précision les conditions d’analyse et que la communauté est harmonisée au niveau mondial. Les étapes critiques du protocole comprennent le prélèvement de sang total et la préparation du PRP⁹, ainsi que la précision lors de la réalisation de la série de dilution. Il est également important de s’assurer que les courbes d’essai et d’étalon sont parallèles avant de procéder à la comparaison EC₅₀ . Si les lignes ne sont pas parallèles ou si les asymptotes ne sont pas équivalentes, cela peut indiquer que le matériau de test et le matériau standard sont différents dans une certaine mesure.

Tous ceux qui travaillent dans le domaine des sciences biologiques savent que les tests biologiques ne fonctionnent pas toujours de manière cohérente, il faut donc en tenir compte lors de l’évaluation des données. Dans l’exemple présenté ici, même si nous utilisons les mêmes donneurs pour mesurer la puissance de deux matériaux très similaires, sinon identiques, les pentes et les asymptotes ne sont pas identiques. Cependant, nous acceptons un certain degré de variabilité et concluons que les courbes sont, dans ce cas, parallèles, et donc adaptées à la comparaison et à l’ajustement de la puissance. Les molécules biologiques sont volumineuses et complexes, et les modifications post-traductionnelles au cours de la fabrication peuvent influencer leur puissance dans les essais biologiques. La normalisation des biomolécules et des essais biologiques ne peut pas se faire uniquement en utilisant la masse ou le volume et doit se faire en quantifiant et en comparant l’activité biologique dans un essai biologique¹¹. Il faut utiliser sa formation et son expérience pour évaluer les données dans le contexte de l’essai.

Les limites de la technique sont que, bien que les données puissent indiquer un problème avec le(s) réactif(s), elles ne peuvent pas vous dire quel est le problème. D’autres travaux seront nécessaires pour déterminer pourquoi les matériaux ne sont pas comparables. Dans un monde idéal, tout matériau essentiel pour les expériences et les conclusions scientifiques ultérieures serait vérifié par spectroscopie de masse, mais ce n’est pas toujours une option. Toutefois, si les données ne sont pas comparables, une enquête plus approfondie est toujours justifiée dans une certaine mesure. Une autre limite de cette approche est le temps et les ressources nécessaires pour la mettre en œuvre. Idéalement, le test et la norme devraient être comparés chez 3 à 6 donneurs pour fournir une certaine confiance dans l’attribution de l’activité biologique au matériel, mais nous pensons que cela est justifié par le soutien de la reproductibilité et de la fiabilité. Il n’est pas nécessaire de normaliser le matériel biologique à chaque fois que des expériences sont menées, mais au minimum, cela devrait être fait pour chaque nouveau lot d’agonistes, de préférence plus fréquemment, en fonction de la stabilité et de l’utilisation. En effet, si une norme est mise à disposition, les organismes internationaux de normalisation peuvent apporter des éclaircissements à ce sujet.

Bien que l’exemple présenté ici soit pour la CRP-XL dans le contexte de la mesure de l’agrégation plaquettaire, le protocole de comparaison de l’activité biologique des biomolécules dans les essais biologiques est largement applicable dans l’ensemble du secteur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.