Reproduceerbaarheid en harmonisatie in onderzoek met behulp van biologische standaarden: het voorbeeld van bloedplaatjesagonist collageen-gerelateerd peptide

Summary

Hier presenteren we een methode om de bloedplaatjesagonist collageen-gerelateerd peptide cross-linked (CRP-XL) te standaardiseren met behulp van lichttransmissie-aggregometrie. Hoewel het protocol gericht is op de bloedplaatjesfunctie, kan het experimentele proces worden toegepast op de meeste biologische moleculen en bioassays om wetenschappelijke nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te garanderen.

Abstract

Metrologie - de wetenschap van de maat - is een onderwerp waarover maar weinig biologische wetenschappers in hun opleiding worden onderwezen, tot hun nadeel; De toepassing van eenvoudige standaardisatieprocessen op de dagelijkse werkpraktijk zorgt voor vertrouwen in gegevens en reproduceerbaarheid over afstand en tijd.

Deze methode laat zien hoe een kernlaboratoriumexperiment kan worden gestandaardiseerd dat veel wordt gebruikt in hemostaseonderzoek en klinische praktijk, met name het meten van reacties op de bloedplaatjescollageenreceptor (glycoproteïne [GP]VI) agonist collageengerelateerd peptide, verknoopt (CRP-XL) door lichttransmissie-aggregometrie (LTA). Het gebruik van deze aanpak zorgt voor reproduceerbaarheid binnen het laboratorium en harmonisatie tussen laboratoria, ongeacht de voorraad agonisten of leveranciers. Belangrijk is dat deze methode toepasbaar is op andere bloedplaatjesagonisten en, inderdaad, vele andere biologische moleculen en bioassays.

Het hieronder beschreven proces omvat het maken van een 6-8-punts verdunningsreeks van de 'standaard' en de 'test' (het materiaal dat u controleert) en deze naast elkaar te laten lopen in een gekozen test (in dit geval LTA). CRP-XL wordt gebruikt bij massa/volumeconcentraties, maar niet elk materiaal geeft dezelfde biologische activiteit bij een bepaalde concentratie, dus wordt een verdunningsreeks gemaakt om het standaard- en testmateriaal te vergelijken en te bepalen welke concentratie nodig is om een gelijkwaardige activiteit te geven. De verdunningsreeks moet 0-100% aggregatie omvatten. De gegevens worden uitgezet met behulp van niet-lineaire regressie en de EC_50-waarde van elk monster (standaard en test) wordt bepaald. Om activiteit toe te wijzen, deelt u de EC_50-waarde van de norm door die van de test om te bepalen hoeveel meer of minder krachtig deze is en past u de concentratie dienovereenkomstig aan. Deze aanpak zorgt ervoor dat steeds weer dezelfde biologische 'activiteit' aan de test wordt toegevoegd.

Introduction

Velen van ons gebruiken biologische agonisten en antagonisten in onze experimenten, meestal in een biologische test die hun effect op de celfunctie onder specifieke omstandigheden kwantificeert. De hier beschreven methode is voor de bloedplaatjesagonist collageengerelateerd peptide, cross-linked (CRP-XL), een glycoproteïne VI-agonist die bloedplaatjes activeert en waarvan de activiteit kan worden gemeten in verschillende assays (lichttransmissie-aggregometrie, microscopie, flowcytometrie, Ca²⁺ -afgifte, enz.), maar het agonist-standaardisatieprotocol is van toepassing op elke biologische agonist/antagonist en/of bioassay. De natuurwetenschappen zijn goed thuis in het gebruik van normen in hun dagelijkse werkpraktijken, en bedrijven die biotherapeutische geneesmiddelen ontwikkelen in de commerciële sector begrijpen de waarde van het gebruik van referentienormen¹, maar ze blijven onderbenut door veel biologische wetenschappers, vooral in de academische onderzoeksgemeenschap, en hun gebrek aan gebruik heeft een negatieve invloed op de kwaliteit van de wetenschappelijke output.

CRP-XL is een specifieke GPVI-specifieke agonist die het bloedplaatjesveld al tientallen jaren gebruikt sinds de beschrijving in 1995², waardoor de gemeenschap de rol van GPVI kan onderscheiden van die van andere collageenbindende bloedplaatjeseiwitten sinds ^3,4. Deze agonist kan uit verschillende commerciële bronnen worden verkregen of in eigen huis worden geproduceerd. Het peptidemonomeer kan worden ingekocht bij een leverancier en vervolgens in eigen beheer worden verknoopt of dit kan tegen een extra vergoeding door de leverancier worden gedaan. Verdere kostenbesparingen kunnen worden gerealiseerd door de vereiste zuiverheid bij levering te verminderen (bijvoorbeeld 70% versus 95%). Er is ook geen consensus over hoe CRP-XL moet worden bewaard, sommigen kiezen voor cryo-opslag en anderen voor koeling, sommigen houden het materiaal gevriesdroogd tot gebruik, en anderen bewaren het in oplossing (water of buffer, afhankelijk van de voorkeur). Daarom zijn de kwaliteit en samenstelling van laboratoriumvoorraden niet gestandaardiseerd of geharmoniseerd. Omdat deze agonist wordt gebruikt in een bepaalde concentratie (massa/volume) in plaats van in eenheden van activiteit, zal de potentie van CRP-XL in het ene laboratorium, bijvoorbeeld bij 1 μg/ml, niet hetzelfde zijn als in een ander. Het is vermeldenswaard dat andere bloedplaatjesagonisten die in het veld worden gebruikt, al gestandaardiseerd zijn (bijv. trombine, dat wordt geleverd en gebruikt in eenheden van activiteit in plaats van massa/volume), dus de beweging van massa/volume naar eenheden van biologische zou niet al te uitdagend moeten zijn voor de gemeenschap. Er moet ook worden opgemerkt dat de respons van patiënten op bloedplaatjesagonisten, waaronder CRP-XL, variabel is in termen van hun gevoeligheid voor agonisten en hun reactievermogen (mate van respons)⁵, dus het is nog belangrijker om consistente hoeveelheden agonistactiviteit in de tests te gebruiken.

Als bloedplaatjesagonisten kunnen worden geharmoniseerd door ze te gebruiken bij een gedefinieerde activiteit in plaats van gewicht/volume, kan ervoor worden gezorgd dat een experiment in het ene laboratorium direct vergelijkbaar is met dat in andere laboratoria en nauwkeurig en met vertrouwen kan worden gereproduceerd. Totdat het veld overeenstemming bereikt over hoe CRP-XL-activiteit moet worden opgeslagen en gestandaardiseerd, is het essentieel om regelmatig controles uit te voeren op het materiaal om de consistentie ervan te garanderen gedurende de maanden/jaren waarin het wordt gebruikt.

De toewijzing van activiteitswaarden voor biologische standaarden moet worden gedaan door middel van collaboratieve, multicenter studies (bijvoorbeeld ^6,7) en vereist specialistische expertise. De noodzaak van vastgestelde biologische normen voor bloedplaatjesagonisten is onlangs benadrukt door een gezamenlijke multicenter studie⁸ ondersteund door de International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH); totdat er een internationale CRP-XL-standaard beschikbaar is, kunnen onderzoekers hun eigen materiaal lokaal standaardiseren om consistentie in de loop van de tijd te garanderen, en dat nieuw materiaal dat commercieel of intern wordt ingekocht, is van vergelijkbare activiteit als eerdere preparaten, evenals die van de rest van de gemeenschap.

Protocol

Bloed moet worden afgenomen bij gezonde vrijwilligers die toestemming geven en worden verwerkt in overeenstemming met de lokale regels. Dit protocol meet agonist-geïnduceerde bloedplaatjesaggregatie in bloedplaatjesrijk plasma (PRP) door middel van lichttransmissie-aggregometrie (LTA). De ISTH biedt gestandaardiseerde protocollen, waaronder een methode uit 2013 voor PRP-voorbereiding en LTA⁹.  Verzamel volbloed in 4% natriumcitraat volgens de ISTH-aanbevelingen in overeenstemming met de regels van de lokale ethische commissie. Sluit donoren uit die in de afgelopen 2 weken NSAID's hebben gebruikt.

1. Analyseprocedure

1. Neem een aliquot van de voorraad CRP-XL en verdun deze in de analysebuffer (Tyrodes ¹⁰) (tabel 1) tot een beginconcentratie die maximale aggregatie veroorzaakt (zie de OPMERKING onder stap 1.3).
   OPMERKING: In de literatuur zal een concentratie van 1 μg/ml maximale aggregatie induceren, maar sommige laboratoria hebben hogere concentraties nodig om hetzelfde effect te bereiken - pas de verdunningsreeks dienovereenkomstig aan
2. Maak een overeenkomstige verdunningsreeks met de norm (zie de OPMERKING onder stap 1.3 en figuur 1), zodanig dat de concentraties gelijk zijn aan die van het testreagens.
3. Produceer een 6- tot 8-punts verdunningsreeks voor de test en de standaard, opnieuw in de analysebuffer, die de aggregatierespons van 100% naar 0% aggregatie brengt. Tabel 2 geeft een voorbeeld van een concentratiecurve van een 8-punts verdunningsreeks.
   OPMERKING: Sommige laboratoria voegen agonist toe met een totaal van 10% testvolume, bijv. 50 μL agonist op 450 μL bloedplaatjes, zodat ze een concentratie van 10x verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 1x in de test, terwijl andere kleinere (meer geconcentreerde) volumes agonist toevoegen, bijv. 5 μL agonist op 495 μL bloedplaatjes - zorg er wel voor dat de verdunningsreeks geschikt is voor de test, rekening houdend met hoe de volumeverplaatsing Beïnvloedt de bloedplaatjesconcentratie - nogmaals, wees consistent. In het voorbeeld wordt 30 μL 10x-agonist toegevoegd aan 270 μL bloedplaatjesrijk plasma (PRP).
4. Zodra de bloedplaatjes zijn uitgerust en klaar voor gebruik, aliquoteert u ze in LTA-cuvetten, voegt u een roerstaaf toe en laat u ze 37 °C bereiken in de opvangputjes.
5. Eenmaal op temperatuur, plaatst u de cuvet(ten) in de aggregometer en begint u met het registreren van de sporen. Voeg de agonist toe (met roeren) en noteer de gegevens.
6. Herhaal stap 1.4 voor elke concentratie van de test en de norm totdat de gegevens zijn verzameld die nodig zijn om de curven te plotten (voorbeeldcurven weergegeven in figuur 2).
7. Bereken de potentie van het testreagens ten opzichte van die van de standaard; Nogmaals, gebruik een metriek - maximale aggregatie of oppervlakte onder de curve - zolang er consistentie is en het analysemodel op de juiste manier bij de gegevens past.

2. Controle van de concentratiecurven

1. Controleer eerst of de concentratieresponscurven parallel zijn. Er zijn veel softwarepakketten die dit doen, maar hier wordt het proces beschreven voor Graphpad Prism (zie figuur 3).
   1. Voer de gegevens zo in dat log(concentratie) zich op de X-as bevindt en de respons (% maximale aggregatie/AUC) op de Y-as (Figuur 3A)
   2. CRP-XL-concentraties transformeren (Figuur 3B)
   3. Selecteer Niet-lineaire regressie in de analysefuncties en gebruik de vergelijking voor dosis-responsstimulatie/-remming.
   4. Selecteer log (agonist) vs. respons (variabele helling) - gebruik 3- of 4-way fit, afhankelijk van wat het beste is voor de gegevens.
   5. Bepaal of de curven parallel zijn met behulp van het tabblad Vergelijken (zoals weergegeven in figuur 3C) en klik op de knop om de datasets te vergelijken om er zeker van te zijn dat de helling (heuvelhelling) en asymptoten (de boven- en onderkant van de curves) gelijkwaardig zijn. In dit voorbeeld is de heuvelhelling voor de test 2,279 en die van de standaard 2,025, wat een verhouding van 1,125 oplevert.
   6. Als de hellingen evenwijdig zijn (bijvoorbeeld een acceptatiecriterium van de hellingsverhouding tussen 0,8-1,25) en de asymptoten gelijkwaardig zijn, gaat u verder met de berekening van de potentie (EC₅₀) met behulp van de stappen 2.1.3 en 2.1.4. In het hier getoonde voorbeeld zijn de asymptoten beperkt omdat de evaluatie in stap 2.1.5 bevestigde dat de asymptoten gelijkwaardig zijn.
   7. Deel de EC_50-waarde van de norm door die van de test om de relatieve potentie te bepalen. In het hier getoonde voorbeeld is test/standaard (0,07259/0,1498) = 0,4846, d.w.z. de 'test' is half zo krachtig als de standaard.
   8. Pas de massa/volumeconcentraties aan om rekening te houden met het verschil in potentie, d.w.z. als de standaard eerder werd gebruikt bij 1 μg/ml, zou het nieuwe materiaal worden gebruikt bij 1/0,4846 = 2,063 μg/ml) om ervoor te zorgen dat vergelijkbare hoeveelheden actief materiaal worden gebruikt in experimenten

Representative Results

Figuur 1 is een schematische weergave van een verdunningsreeks en is bedoeld om te benadrukken dat een verdunningsreeks nodig is voor zowel de norm als de test. Figuur 2A toont aggregatiesporen voor de standaard, terwijl de testgegevens worden weergegeven in Figuur 2B. Bij 0,075 μg/ml is er een duidelijke respons op de norm, terwijl voor de test de overeenkomstige concentratie (0,075 μg/ml) vlak is, d.w.z. geen respons. Deze gegevens worden gebruikt om de volgende grafieken uit te zetten om de EC₅₀ te geven. In het hier getoonde voorbeeld werd 100% maximale aggregatie gebruikt om de concentratie-responscurve uit te zetten en EC₅₀ te bepalen, zoals weergegeven in figuur 3.

Figuur 1: Grafische beschrijving van de twee verdunningsreeksen van de test (links) en de standaard (rechts). Beginnend met de hoogste concentratie (aanbevolen concentratie: 10 μg/ml CRP-XL), worden opeenvolgende verdunningen van 1 op 2 parallel gemaakt over 8 punten (>3 log-eenheden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Aggregatiesporen voor de standaard- (links) en testverdunningsreeks (rechts). Naarmate de bloedplaatjesaggregatie vordert (x-as), neemt de hoeveelheid licht die door het monster gaat en de sensor bereikt toe (y-as). (A) Standaard. (B) Test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Gegevensinvoer en -analyse. (A) Gegevens worden ingevoerd, (B) getransformeerd en (C,D) geanalyseerd op parallellisme (vraag de software om te zien of de heuvelhellingen en asymptoten vergelijkbaar zijn [C]). (E) Als de curven evenwijdig zijn, bepaal dan de potentie (EC₅₀) met behulp van niet-lineaire regressiecurve-fitting. (F) Geplotte getransformeerde gegevens. Raadpleeg de methode voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tyrodes buffer9
Kiezers	Concentratie	Opmerkingen
NaCl	134 mM
Na2HPO4	0,34 mM
Kcl	2,9 mM
NaHCO3	12 mM
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES)	20 mM
Glucose	5 mM
MgCl2	1 mM	pH 7,3

Tabel 1: Samenstelling van de tyrodenbuffer.

8-punts verdunningsreeks
Verdunning 1	10 μg/ml
Verdunning 2	5 μg/ml
Verdunning 3	2,5 μg/ml
Verdunning 4	1,25 μg/ml
Verdunning 5	0,625 μg/ml
Verdunning 6	0,3125 μg/ml
Verdunning 7	0,15625 μg/ml
Verdunning 8	0,073125 μg/ml

Tabel 2: Een voorbeeld van een 8-punts verdunningsreeks.

Discussion

Zoals hier te zien is, is het proces van het standaardiseren van de materialen heel eenvoudig. Hoewel het een beetje tijd kost om nieuwe partijen materiaal te evalueren en/of om te controleren of de huidige partij stabiel is en na verloop van tijd geen activiteit verliest, is de beloning dat experimenten keer op keer reproduceerbaar zijn en over jaren vergelijkbaar zijn in plaats van alleen de levensduur van een partij reagens. Het betekent ook dat andere onderzoekers de testomstandigheden nauwkeurig kunnen nabootsen en dat de gemeenschap op mondiaal niveau wordt geharmoniseerd. Cruciale stappen in het protocol zijn onder meer volbloedafname en PRP-bereiding⁹, evenals precisie bij het maken van de verdunningsreeks. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de test- en standaardcurven parallel lopen voordat u doorgaat met de EC_{50-vergelijking} . Als de lijnen niet evenwijdig zijn, of als de asymptoten niet gelijkwaardig zijn, kan dit erop wijzen dat het test- en standaardmateriaal tot op zekere hoogte verschillen.

Iedereen die in de biologische wetenschappen werkt, weet dat biologische tests niet altijd consistent presteren, dus men moet hier rekening mee houden bij het evalueren van de gegevens. In het hier getoonde voorbeeld, hoewel we dezelfde donoren gebruiken om de potentie van twee zeer vergelijkbare, zo niet identieke, materialen te meten, zijn de heuvelhellingen en asymptoten niet identiek. Toch accepteren we een zekere mate van variabiliteit en concluderen we dat de curves in dit geval parallel zijn, en daarom geschikt om de potentie te vergelijken en aan te passen. Biologische moleculen zijn groot en complex, en posttranslationele modificaties tijdens de productie kunnen hun potentie in bioassays beïnvloeden. Het standaardiseren van biomoleculen en bioassays kan niet worden gedaan met alleen massa of volume en moet worden gedaan door de biologische activiteit in een bioassay te kwantificeren en te vergelijken¹¹. Men moet zijn/haar opleiding en ervaring gebruiken om de gegevens in de context van de test te evalueren.

Beperkingen van de techniek zijn dat hoewel de gegevens kunnen wijzen op een probleem met het (de) reagens(en), het u niet kan vertellen wat het probleem is. Verder onderzoek zal nodig zijn om vast te stellen waarom de materialen niet vergelijkbaar zijn. In een ideale wereld zou elk materiaal dat cruciaal is voor experiment(en) en daaropvolgende wetenschappelijke conclusies worden geverifieerd door middel van massaspectroscopie, maar dit is niet altijd een optie. Als de gegevens echter niet vergelijkbaar zijn, is verder onderzoek in een bepaalde hoedanigheid nog steeds gerechtvaardigd. Een andere beperking van deze aanpak is de tijd en middelen die nodig zijn om het te doen. Idealiter zouden de test en de standaard moeten worden vergeleken bij 3-6 donoren om enig vertrouwen te geven in het toekennen van biologische activiteit aan het materiaal, maar we zijn van mening dat dit gerechtvaardigd is door reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid te ondersteunen. Het standaardiseren van biologisch materiaal is niet elke keer nodig wanneer experimenten worden uitgevoerd, maar het moet op zijn minst worden gedaan voor elke nieuwe batch agonisten, bij voorkeur vaker, afhankelijk van de stabiliteit en het gebruik. Mocht er een norm beschikbaar komen, dan is dit iets waar internationale normalisatie-instellingen duidelijkheid over kunnen verschaffen.

Hoewel het hier getoonde voorbeeld voor CRP-XL is in de context van het meten van bloedplaatjesaggregatie, is het protocol voor het vergelijken van de biologische activiteit van biomoleculen in bioassays breed toepasbaar in de hele sector.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.