Reproduzierbarkeit und Harmonisierung in der Forschung mit biologischen Standards: Das Beispiel des Thrombozytenagonisten-Kollagen-verwandten Peptids

Summary

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Standardisierung des Thrombozytenagonisten-Kollagen-verwandten Peptids Cross-Linked (CRP-XL) mittels Lichttransmissionsaggregometrie vor. Während das Protokoll auf die Thrombozytenfunktion abzielt, kann das experimentelle Verfahren auf die meisten biologischen Moleküle und Bioassays angewendet werden, um wissenschaftliche Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Abstract

Metrologie - die Wissenschaft des Messens - ist ein Thema, über das nur wenige Biowissenschaftler in ihrer Ausbildung unterrichtet werden, zu ihrem Nachteil; Die Anwendung einfacher Standardisierungsprozesse auf die tägliche Arbeitspraxis schafft Vertrauen in Daten und Reproduzierbarkeit über Distanz und Zeit.

Diese Methode zeigt, wie ein Kernlaborexperiment standardisiert werden kann, das in der Hämostaseforschung und in der klinischen Praxis weit verbreitet ist, insbesondere die Messung der Reaktionen auf das Thrombozyten-Kollagenrezeptor (Glykoprotein [GP]VI)-Agonisten-Kollagen-verwandte Peptid, vernetzt (CRP-XL) durch Lichttransmissionsaggregometrie (LTA). Die Verwendung dieses Ansatzes gewährleistet die Reproduzierbarkeit innerhalb des Labors und die Harmonisierung zwischen den Laboren, unabhängig vom Agonistenbestand oder dem Lieferanten. Wichtig ist, dass diese Methode auf andere Thrombozytenagonisten und in der Tat auf viele andere biologische Moleküle und Bioassays anwendbar ist.

Der unten beschriebene Prozess beinhaltet die Erstellung einer 6-8-Punkt-Verdünnungsreihe des "Standards" und des "Tests" (das Material, das Sie überprüfen) und deren Gegenüberstellung in einem ausgewählten Assay (in diesem Fall LTA). CRP-XL wird bei Masse-/Volumenkonzentrationen verwendet, aber nicht jedes Material weist bei einer bestimmten Konzentration die gleiche biologische Aktivität auf, so dass eine Verdünnungsreihe erstellt wird, um das Standard- und Testmaterial zu vergleichen und zu bestimmen, welche Konzentration erforderlich ist, um eine gleichwertige Aktivität zu erzielen. Die Verdünnungsreihe muss eine Aggregation von 0 bis 100 % umfassen. Die Daten werden mit Hilfe der nichtlinearen Regression aufgetragen, und der EC_50-Wert jeder Probe (Standard und Test) wird bestimmt. Um die Aktivität zuzuordnen, dividieren Sie den EC_50-Wert des Standards durch den Wert des Tests, um zu bestimmen, wie viel mehr oder weniger wirksam er ist, und passen Sie die Konzentration entsprechend an. Dieser Ansatz stellt sicher, dass dem Assay immer wieder die gleiche biologische "Aktivität" hinzugefügt wird.

Introduction

Viele von uns verwenden biologische Agonisten und Antagonisten in ihren Experimenten, meist in einem biologischen Assay, der ihre Wirkung auf die Zellfunktion unter bestimmten Bedingungen quantifiziert. Das hier beschriebene Verfahren gilt für den Thrombozytenagonisten Kollagen-verwandtes Peptid, vernetzt (CRP-XL), einen Glykoprotein-VI-Agonisten, der Blutplättchen aktiviert und dessen Aktivität in einer Vielzahl von Assays gemessen werden kann (Lichttransmissionsaggregometrie, Mikroskopie, Durchflusszytometrie,^Ca2+ -Freisetzung usw.), aber das Agonisten-Standardisierungsprotokoll ist auf jeden biologischen Agonisten/Antagonisten und/oder Bioassay anwendbar. Die Naturwissenschaften sind mit der Verwendung von Standards in ihrer täglichen Arbeitspraxis bestens vertraut, und Unternehmen, die biotherapeutische Arzneimittel im kommerziellen Bereich entwickeln, verstehen den Wert der Verwendung von Referenzstandards¹, aber sie werden von vielen Biowissenschaftlern, insbesondere in der akademischen Forschungsgemeinschaft, nach wie vor nicht ausreichend genutzt, und ihre mangelnde Verwendung wirkt sich negativ auf die Qualität der wissenschaftlichen Ergebnisse aus.

CRP-XL ist ein spezifischer GPVI-spezifischer Agonist, der seit seiner Beschreibung im Jahr 1995 seit Jahrzehnten im Thrombozytenfeld verwendet wird² und der der Gemeinschaft hilft, die Rolle von GPVI von der anderer kollagenbindender Thrombozytenproteine abzugrenzen ^3,4. Dieser Agonist kann aus einer Vielzahl von kommerziellen Quellen bezogen oder im eigenen Haus hergestellt werden. Das Peptidmonomer kann von einem Lieferanten erworben und dann intern vernetzt werden, oder dies kann vom Lieferanten gegen eine zusätzliche Gebühr durchgeführt werden. Weitere Kosteneinsparungen lassen sich erzielen, indem die erforderliche Reinheit bei der Auslieferung reduziert wird (z. B. 70 % gegenüber 95 %). Es gibt auch keinen Konsens darüber, wie CRP-XL gelagert werden sollte, wobei sich einige für die Kryolagerung und andere für die Kühlung entscheiden, einige das Material bis zur Verwendung lyophilisiert halten und wieder andere es in Lösung (Wasser oder Puffer, je nach Präferenz) lagern. Daher sind die Qualität und Zusammensetzung von Laborvorräten nicht standardisiert oder harmonisiert. Da dieser Agonist in einer definierten Konzentration (Masse/Volumen) und nicht in Aktivitätseinheiten verwendet wird, ist die Wirksamkeit von CRP-XL in einem Labor, z. B. bei 1 μg/ml, nicht die gleiche wie in einem anderen. Es ist erwähnenswert, dass andere Thrombozytenagonisten, die in diesem Bereich verwendet werden, bereits standardisiert sind (z. B. Thrombin, das in Aktivitätseinheiten und nicht in Masse/Volumen geliefert und verwendet wird), so dass der Übergang von Masse/Volumen zu Einheiten von biologischem Material für die Gemeinschaft keine allzu große Herausforderung darstellen sollte. Es sollte auch beachtet werden, dass das Ansprechen von Patienten auf Thrombozytenagonisten, einschließlich CRP-XL, in Bezug auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Agonisten sowie auf ihre Fähigkeit zum Ansprechen (Ausmaß des ^Ansprechens) variabel ist5, so dass es umso wichtiger ist, konsistente Mengen an Agonistenaktivität in den Assays zu verwenden.

Wenn Thrombozytenagonisten harmonisiert werden können, indem sie bei einer definierten Aktivität und nicht bei Gewicht/Volumen verwendet werden, kann sichergestellt werden, dass ein Experiment in einem Labor direkt mit dem in anderen Labors vergleichbar ist und mit Sicherheit genau reproduziert werden kann. Bis zu dem Zeitpunkt, an dem sich das Feld über die Lagerung und Standardisierung der CRP-XL-Aktivität geeinigt hat, ist es wichtig, regelmäßige Kontrollen des Materials durchzuführen, um seine Konsistenz über die Monate/Jahre, in denen es verwendet wird, sicherzustellen.

Die Zuweisung von Aktivitätswerten für biologische Standards muss durch kollaborative, multizentrische Studien erfolgen (z. B. ^6,7) und erfordert Fachwissen. Die Notwendigkeit etablierter biologischer Standards für Thrombozytenagonisten wurde kürzlich durch eine kollaborative multizentrische Studie⁸ hervorgehoben, die von der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase (ISTH) unterstützt wurde. Bis ein internationaler CRP-XL-Standard verfügbar ist, können Forscher ihr eigenes Material lokal standardisieren, um die Konsistenz im Laufe der Zeit zu gewährleisten, und dass neues Material, das kommerziell oder intern beschafft wird, von vergleichbarer Aktivität ist wie frühere Präparate sowie die des Rests der Gemeinschaft.

Protocol

Blut sollte von einwilligenden gesunden Freiwilligen entnommen und in Übereinstimmung mit den örtlichen Vorschriften verarbeitet werden. Dieses Protokoll misst die Agonisten-induzierte Thrombozytenaggregation in plättchenreichem Plasma (PRP) mittels Lichttransmissionsaggregometrie (LTA). Das ISTH stellt standardisierte Protokolle zur Verfügung, darunter eine Methode aus dem Jahr 2013 zur PRP-Herstellung und LTA⁹.  Sammeln Sie Vollblut zu 4 % Natriumcitrat gemäß den ISTH-Empfehlungen in Übereinstimmung mit den Regeln der örtlichen Ethikkommission. Schließen Sie Spender aus, die innerhalb der letzten 2 Wochen NSAR eingenommen haben.

1. Prüfverfahren

1. Nehmen Sie ein Aliquot von CRP-XL und verdünnen Sie es im Assay-Puffer (Tyrodes¹⁰) (Tabelle 1) auf eine Ausgangskonzentration, die eine maximale Aggregation bewirkt (siehe HINWEIS unter Schritt 1.3).
   HINWEIS: In der Literatur führt eine Konzentration von 1 μg/ml zu einer maximalen Aggregation, aber einige Labore benötigen höhere Konzentrationen, um den gleichen Effekt zu erzielen - passen Sie die Verdünnungsreihe entsprechend an
2. Mit dem Standard wird eine entsprechende Verdünnungsreihe erstellt (siehe ANMERKUNG unter Schritt 1.3 und Abbildung 1), so dass die Konzentrationen mit denen des Prüfreagenzes übereinstimmen.
3. Erzeugen Sie eine 6- bis 8-Punkt-Verdünnungsreihe für den Test und den Standard, wiederum als Assay-Puffer, die die Aggregationsreaktion von 100 % auf 0 % Aggregation erhöht. Ein Beispiel für eine 8-Punkt-Konzentrationskurve für Verdünnungsreihen ist in Tabelle 2 dargestellt.
   HINWEIS: Einige Labore fügen Agonisten mit einem Gesamtvolumen von 10 % hinzu, z. B. 50 μl Agonist auf 450 μl Thrombozyten, so dass sie eine 10-fache Konzentration auf eine endgültige 1-fache Konzentration im Assay verdünnen, während andere kleinere (konzentriertere) Mengen Agonisten hinzufügen, z. B. 5 μl Agonist auf 495 μl Thrombozyten - stellen Sie nur sicher, dass die Verdünnungsreihe für den Assay geeignet ist, wobei zu berücksichtigen ist, wie die Volumenverschiebung beeinflusst die Thrombozytenkonzentration - auch hier gilt: Seien Sie konsequent. Im Beispiel werden 30 μl 10x-Agonist zu 270 μl plättchenreichem Plasma (PRP) gegeben.
4. Sobald die Plättchen ruhen und gebrauchsfertig sind, aliquotieren Sie sie in LTA-Küvetten, fügen Sie einen Rührstab hinzu und lassen Sie sie in den Warmhaltevertiefungen 37 °C erreichen.
5. Sobald die Temperatur erreicht ist, legen Sie die Küvette(n) in das Aggregometer und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Spur(en). Fügen Sie den Agonisten hinzu (unter Rühren) und zeichnen Sie die Daten auf.
6. Wiederholen Sie Schritt 1.4 für jede Konzentration des Tests und des Standards, bis die zum Zeichnen der Kurven erforderlichen Daten erfasst wurden (Beispielkurven in Abbildung 2).
7. Berechnen Sie die Wirksamkeit des Testreagenzes im Verhältnis zu der des Standards. Auch hier gilt: Verwenden Sie eine beliebige Metrik (maximale Aggregation oder Fläche unter der Kurve), solange Konsistenz besteht und das Analysemodell zu den Daten passt.

2. Überprüfung der Konzentrationskurven

1. Prüfen Sie zunächst, ob die Konzentrations-Reaktions-Kurven parallel verlaufen. Es gibt viele Softwarepakete, die dies tun, aber hier wird der Prozess für Graphpad Prism beschrieben (siehe Abbildung 3).
   1. Geben Sie die Daten so ein, dass sich log(Konzentration) auf der X-Achse und die Antwortvariable (% maximale Aggregation/AUC) auf der Y-Achse befindet (Abbildung 3A)
   2. CRP-XL-Konzentrationen transformieren (Abbildung 3B)
   3. Wählen Sie in den Analysefunktionen die Option Nichtlineare Regression aus, und verwenden Sie die Gleichung für die Dosis-Wirkungs-Stimulation/-Hemmung.
   4. Wählen Sie log (Agonist) vs. Antwort (variable Steigung) - verwenden Sie die 3- oder 4-Wege-Anpassung, je nachdem, was für die Daten am besten geeignet ist.
   5. Ermitteln Sie, ob die Kurven parallel sind, indem Sie die Registerkarte Vergleichen verwenden (wie in Abbildung 3C dargestellt), und klicken Sie auf die Schaltfläche, um die Datasets zu vergleichen, um sicherzustellen, dass die Steigung (Steigung des Hügels) und die Asymptoten (die Ober- und Unterseite der Kurven) gleichwertig sind. In diesem Beispiel beträgt die Hill-Steigung für den Test 2,279 und die des Standards 2,025, was ein Verhältnis von 1,125 ergibt.
   6. Wenn die Steigungen parallel sind (z. B. ein Akzeptanzkriterium des Steigungsverhältnisses zwischen 0,8 und 1,25) und die Asymptoten äquivalent sind, fahren Sie mit der Potenzberechnung (EC₅₀) mit den Schritten 2.1.3 und 2.1.4 fort. In dem hier gezeigten Beispiel wurden die Asymptoten eingeschränkt, da die Auswertung in Schritt 2.1.5 bestätigte, dass die Asymptoten äquivalent sind.
   7. Dividieren Sie den EC_50-Wert des Standards durch den Wert des Tests, um die relative Wirksamkeit zu bestimmen. In dem hier gezeigten Beispiel ist test/standard (0,07259/0,1498) = 0,4846, d.h. der "Test" ist halb so potent wie der Standard.
   8. Passen Sie die Masse-/Volumenkonzentrationen an, um den Unterschied in der Wirksamkeit zu berücksichtigen, d. h. wenn der Standard zuvor bei 1 μg/ml verwendet wurde, würde das neue Material bei 1/0,4846 = 2,063 μg/ml verwendet werden, um sicherzustellen, dass vergleichbare Mengen an aktivem Material in Experimenten verwendet werden

Representative Results

Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung einer Verdünnungsreihe und soll verdeutlichen, dass eine Verdünnungsreihe sowohl für den Standard als auch für den Test erforderlich ist. Abbildung 2A zeigt Aggregationsspuren für den Standard, während die Testdaten in Abbildung 2B dargestellt sind. Bei 0,075 μg/ml zeigt sich ein deutliches Ansprechen auf den Standard, während für den Test die entsprechende Konzentration (0,075 μg/ml) flach ist, d. h. keine Reaktion. Diese Daten werden verwendet, um die nachfolgenden Diagramme zu zeichnen, um den EC₅₀ zu erhalten. In dem hier gezeigten Beispiel wurde eine maximale Aggregation von 100 % verwendet, um die Konzentrations-Wirkungs-Kurve aufzuzeichnen und EC₅₀ zu bestimmen, wie in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 1: Grafische Darstellung der beiden Verdünnungsreihen des Tests (links) und des Standards (rechts). Beginnend mit der Höchstkonzentration (empfohlene Konzentration: 10 μg/mL CRP-XL) werden sequentielle 1 zu 2 Verdünnungen parallel über 8 Punkte (>3 log-Einheiten) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Aggregationsspuren für die Standard- (links) und Testverdünnungsreihen (rechts). Mit fortschreitender Thrombozytenaggregation (x-Achse) nimmt die Lichtmenge zu, die durch die Probe dringt und den Sensor erreicht (y-Achse). (A) Standard. (B) Testen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Dateneingabe und -analyse. (A) Die Daten werden eingegeben, (B) transformiert und (C,D) auf Parallelität analysiert (bitten Sie die Software, festzustellen, ob die Hill-Hänge und Asymptoten vergleichbar sind [C]). (E) Wenn die Kurven parallel sind, ist die Potenz (EC₅₀) mit Hilfe der nichtlinearen Regressionskurvenanpassung zu bestimmen. (F) Dargestellte transformierte Daten. Weitere Informationen finden Sie in der Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tyroden-Puffer9
Bestandteile	Konzentration	Kommentare
NaCl	134 mM
Na2HPO4	0,34 mM
Kcl	2,9 mM
NaHCO3	12 mM
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)	20 mM
Traubenzucker	5 mM
MgCl2	1 mM	pH-Wert 7,3

Tabelle 1: Zusammensetzung des Tyrodes-Puffers.

8-Punkt-Verdünnungsreihe
Verdünnung 1	10 μg/ml
Verdünnung 2	5 μg/ml
Verdünnung 3	2,5 μg/ml
Verdünnung 4	1,25 μg/ml
Verdünnung 5	0,625 μg/ml
Verdünnung 6	0,3125 μg/ml
Verdünnung 7	0,15625 μg/ml
Verdünnung 8	0,073125 μg/ml

Tabelle 2: Ein Beispiel mit einer 8-Punkt-Verdünnungsreihe.

Discussion

Wie hier gezeigt, ist der Prozess der Standardisierung der Materialien sehr einfach. Obwohl es ein wenig Zeit in Anspruch nimmt, neue Materialchargen zu bewerten und/oder zu überprüfen, ob die aktuelle Charge stabil ist und im Laufe der Zeit nicht an Aktivität verliert, besteht die Belohnung darin, dass die Experimente immer wieder reproduzierbar und über Jahre hinweg vergleichbar sind und nicht nur die Lebensdauer einer Reagenzcharge. Es bedeutet auch, dass andere Forscher die Assay-Bedingungen genau nachbilden können und dass die Gemeinschaft auf globaler Ebene harmonisiert ist. Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die Vollblutentnahme und die PRP-Aufbereitung⁹ sowie die Präzision bei der Erstellung der Verdünnungsreihe. Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass die Test- und Standardkurven parallel sind, bevor Sie mit dem EC_50-Vergleich fortfahren. Wenn die Linien nicht parallel sind oder die Asymptoten nicht äquivalent sind, könnte dies darauf hindeuten, dass sich das Test- und das Standardmaterial bis zu einem gewissen Grad unterscheiden.

Jeder, der in den Biowissenschaften arbeitet, weiß, dass biologische Assays nicht immer konsistent funktionieren, daher muss man dies bei der Auswertung der Daten berücksichtigen. In dem hier gezeigten Beispiel sind die Hanghänge und Asymptoten nicht identisch, obwohl wir dieselben Donatoren verwenden, um die Potenz von zwei sehr ähnlichen, wenn nicht sogar identischen Materialien zu messen. Dennoch akzeptieren wir ein gewisses Maß an Variabilität und kommen zu dem Schluss, dass die Kurven in diesem Fall parallel sind und daher geeignet sind, die Potenz zu vergleichen und anzupassen. Biologische Moleküle sind groß und komplex, und posttranslationale Modifikationen während der Herstellung können ihre Wirksamkeit in Bioassays beeinflussen. Die Standardisierung von Biomolekülen und Bioassays kann nicht nur anhand von Masse oder Volumen erfolgen, sondern muss durch Quantifizierung und Vergleich der biologischen Aktivität in einem Bioassay erfolgen¹¹. Man muss seine/ihre Ausbildung und Erfahrung nutzen, um die Daten im Kontext des Assays zu bewerten.

Die Einschränkungen der Technik bestehen darin, dass die Daten zwar auf ein Problem mit dem/den Reagenz(en) hinweisen können, aber nicht sagen können, was das Problem ist. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um festzustellen, warum die Materialien nicht vergleichbar sind. In einer idealen Welt würde jegliches Material, das für Experimente und nachfolgende wissenschaftliche Schlussfolgerungen entscheidend ist, durch Massenspektroskopie verifiziert werden, aber das ist nicht immer eine Option. Wenn die Daten jedoch nicht vergleichbar sind, sind weitere Untersuchungen in gewisser Weise dennoch gerechtfertigt. Eine weitere Einschränkung dieses Ansatzes ist der Zeit- und Ressourcenaufwand. Im Idealfall sollten der Test und der Standard bei 3-6 Spendern verglichen werden, um ein gewisses Vertrauen in die Zuordnung der biologischen Aktivität des Materials zu schaffen, aber wir sind der Meinung, dass dies durch die Unterstützung der Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit gerechtfertigt ist. Die Standardisierung von biologischem Material ist nicht jedes Mal erforderlich, wenn Experimente durchgeführt werden, aber sie sollte zumindest für jede neue Charge von Agonisten durchgeführt werden, vorzugsweise häufiger, je nach Stabilität und Verwendung. Sollte eine Norm zur Verfügung gestellt werden, können internationale Normungsorganisationen Klarheit schaffen.

Während das hier gezeigte Beispiel für CRP-XL im Zusammenhang mit der Messung der Thrombozytenaggregation gilt, ist das Protokoll zum Vergleich der biologischen Aktivität von Biomolekülen in Bioassays branchenweit verbreitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.