שכפול והרמוניזציה במחקר באמצעות סטנדרטים ביולוגיים: הדוגמה של אגוניסט טסיות פפטיד הקשור לקולגן

Summary

כאן אנו מציגים שיטה לסטנדרטיזציה של אגוניסט טסיות הדם פפטיד הקשור לקולגן צולב (CRP-XL) באמצעות אגרגומטריה של העברת אור. בעוד שהפרוטוקול מכוון לתפקוד טסיות הדם, ניתן ליישם את התהליך הניסיוני על רוב המולקולות הביולוגיות והבדיקות הביולוגיות כדי להבטיח קפדנות מדעית ויכולת שחזור.

Abstract

מטרולוגיה - מדע המידה - היא נושא שרק מדענים ביולוגיים מעטים לומדים עליו בהכשרתם לרעתם; היישום של תהליכי סטנדרטיזציה פשוטים בנוהלי עבודה יומיומיים מספק ביטחון בנתונים ויכולת שחזור על פני מרחק וזמן.

שיטה זו מדגימה כיצד לתקנן ניסוי מעבדה מרכזי הנמצא בשימוש נרחב במחקר ובפרקטיקה הקלינית של המוסטזיס, בפרט, מדידת תגובות לקולטן קולגן טסיות הדם (גליקופרוטאין [GP]VI) אגוניסט פפטיד הקשור לקולגן, צולב (CRP-XL) על ידי אגרגומטריה של העברת אור (LTA). שימוש בגישה זו יבטיח שחזור תוך מעבדה והרמוניה בין מעבדות, ללא קשר למלאי אגוניסט או ספק. חשוב לציין, שיטה זו ישימה עבור אגוניסטים טסיות אחרים, ואכן, מולקולות ביולוגיות רבות אחרות bioassays.

התהליך המתואר להלן כולל ביצוע סדרת דילול של 6-8 נקודות של ה"תקן" וה"מבחן" (החומר שאתה בודק) והרצתם זה לצד זה בבדיקה נבחרת (במקרה זה, LTA). CRP-XL משמש בריכוזי מסה/נפח, אך לא כל חומר נותן את אותה פעילות ביולוגית בריכוז נתון, ולכן נעשית סדרת דילול כדי להשוות את החומר הסטנדרטי וחומר הבדיקה ולקבוע איזה ריכוז נדרש כדי לתת פעילות מקבילה. סדרת הדילול חייבת להשתרע על פני 0-100% צבירה. הנתונים מתווטים באמצעות רגרסיה לא ליניארית, ונקבע ערך EC₅₀ של כל מדגם (תקן ומבחן). כדי להקצות פעילות, חלק את ערך EC₅₀ של התקן בזה של הבדיקה כדי לקבוע כמה חזק יותר או פחות הוא ולהתאים את הריכוז בהתאם. גישה זו תבטיח שאותה "פעילות" ביולוגית תתווסף לבדיקה שוב ושוב.

Introduction

רבים מאיתנו משתמשים באגוניסטים ביולוגיים ובאנטגוניסטים בניסויים שלנו, לרוב בבדיקה ביולוגית המכמתת את השפעתם על תפקוד התא בתנאים מסוימים. השיטה המתוארת כאן היא עבור אגוניסט טסיות פפטיד הקשור לקולגן (CRP-XL), אגוניסט לגליקופרוטאין VI המפעיל טסיות דם ופעילותו ניתנת למדידה במגוון בדיקות (אגרגומטריה של העברת אור, מיקרוסקופיה, ציטומטריית זרימה, שחרור Ca²⁺ וכו'), אך פרוטוקול התקינה האגוניסטי חל על כל אגוניסט/אנטגוניסט ביולוגי ו/או ביואסי. המדעים הפיזיקליים בקיאים בשימוש בתקנים בפרקטיקות העבודה היומיומיות שלהם, וחברות המפתחות תרופות ביותרפיות במגזר המסחרי מבינות את הערך של שימוש בתקני ייחוס¹, אך הם עדיין אינם מנוצלים מספיק על ידי מדענים ביולוגיים רבים, במיוחד בקהילת המחקר האקדמית, וחוסר השימוש בהם משפיע לרעה על איכות התפוקה המדעית.

CRP-XL הוא אגוניסט ספציפי ספציפי ל-GPVI ששדה הטסיות השתמש בו במשך עשרות שנים מאז תיאורו בשנת 1995², ומסייע לקהילה להגדיר את תפקיד GPVI מזה של חלבוני טסיות קושרי קולגן אחרים מאז ^3,4. אגוניסט זה ניתן לרכוש ממגוון רחב של מקורות מסחריים או מיוצר בתוך הבית. מונומר פפטיד ניתן לרכוש מספק ולאחר מכן cross-linked בתוך הבית או שזה יכול להיעשות על ידי הספק תמורת תשלום נוסף. חיסכון נוסף בעלויות יכול להתבצע על ידי הפחתת הטוהר הנדרש בעת המשלוח (70% לעומת 95%, למשל). כמו כן, אין הסכמה על אופן האחסון של CRP-XL, כאשר חלקם בוחרים באחסון בהקפאה ואחרים בקירור, חלקם שומרים על החומר עד לשימוש, ואחרים מאחסנים אותו בתמיסה (מים או חיץ, בהתאם להעדפה). לכן, האיכות וההרכב של מלאי המעבדה אינם סטנדרטיים או הרמוניים. מכיוון שאגוניסט זה משמש בריכוז מוגדר (מסה/נפח) ולא ביחידות פעילות, העוצמה של CRP-XL במעבדה אחת, למשל ב-1 מיקרוגרם/מ"ל, לא תהיה זהה לאחרת. ראוי לציין כי אגוניסטים טסיות אחרים המשמשים בתחום הם כבר סטנדרטיים (למשל, טרומבין, אשר מסופק ומשמש ביחידות פעילות ולא מסה / נפח), ולכן התנועה ממסה / נפח ליחידות ביולוגיות לא צריך להיות מאתגר מדי עבור הקהילה. כמו כן, יש לציין כי תגובות המטופלים לאגוניסטים של טסיות הדם, כולל CRP-XL, משתנות מבחינת רגישותם לאגוניסטים כמו גם מבחינת יכולתם להגיב (מידת התגובה)⁵, ולכן חשוב עוד יותר להשתמש בכמויות עקביות של פעילות אגוניסטית בבדיקות.

אם ניתן ליצור הרמוניה בין אגוניסטים לטסיות דם על ידי שימוש בהם בפעילות מוגדרת ולא במשקל/נפח, ניתן להבטיח שניסוי במעבדה אחת יהיה דומה ישירות לניסוי במעבדות אחרות וניתן יהיה לשחזר אותו במדויק בביטחון. עד שהשטח יגיע להסכמה כיצד לאחסן ולתקנן את פעילות CRP-XL, חיוני לבצע בדיקות שוטפות על החומר כדי להבטיח את עקביותו לאורך החודשים / השנים בהם נעשה בו שימוש.

הקצאת ערך פעילות לתקנים ביולוגיים חייבת להיעשות באמצעות מחקרים שיתופיים ורב-מרכזיים (לדוגמה ^6,7) ודורשת מומחיות מומחה. הצורך בסטנדרטים ביולוגיים מבוססים לאגוניסטים לטסיות הודגש לאחרונה על ידי מחקר רב-מרכזי משותף⁸ הנתמך על ידי האגודה הבינלאומית לפקקת והמוסטזיס (ISTH); עד שיהיה תקן CRP-XL בינלאומי זמין, החוקרים יכולים לתקנן את החומר שלהם באופן מקומי כדי להבטיח עקביות לאורך זמן, ושחומר חדש שמקורו מסחרי או פנימי הוא בעל פעילות דומה להכנות קודמות, כמו גם לשאר הקהילה.

Protocol

יש לאסוף דם ממתנדבים בריאים בהסכמה ולעבד בהתאם לכללים המקומיים. פרוטוקול זה מודד הצטברות טסיות המושרה על ידי אגוניסט בפלזמה עשירה בטסיות (PRP) על ידי אגרגומטריה של העברת אור (LTA). ה- ISTH מספק פרוטוקולים סטנדרטיים, כולל שיטת 2013 להכנת PRP ו- LTA⁹.  יש לאסוף דם מלא לתוך 4% נתרן ציטראט בהתאם להמלצות ISTH בהתאם לכללי ועדת האתיקה המקומית. לא לכלול תורמים שנטלו NSAID כלשהו בשבועיים האחרונים.

1. הליך הבדיקה

1. קח aliquot של מניות CRP-XL ודלל אותו במאגר הבדיקה (Tyrodes¹⁰) (טבלה 1) לריכוז התחלתי שיגרום לצבירה מקסימלית (ראה הערה להלן שלב 1.3).
   הערה: בספרות, ריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל יגרום לצבירה מרבית, אך חלק מהמעבדות זקוקות לריכוזים גבוהים יותר כדי להגיע לאותו אפקט - התאימו את סדרת הדילול בהתאם
2. צור סדרת דילול מתאימה עם התקן (ראה הערה להלן, שלב 1.3 ואיור 1) כך שהריכוזים יהיו זהים למגיב הבדיקה.
3. הפק סדרת דילול של 6 עד 8 נקודות עבור הבדיקה והתקן, שוב במאגר הבדיקה, שלוקח את תגובת הצבירה מ- 100% ל- 0% צבירה. דוגמה המציגה עקומת ריכוז של סדרת דילול של 8 נקודות מוצגת בטבלה 2.
   הערה: מעבדות מסוימות מוסיפות אגוניסט בנפח כולל של 10% בדיקה, למשל, 50 μL של אגוניסט ל 450 μL של טסיות, כך שהן מדללות ריכוז של 10x לריכוז סופי של 1x בבדיקה, בעוד שאחרות מוסיפות נפחים קטנים יותר (מרוכזים יותר) של אגוניסט, למשל, 5 μL של אגוניסט ל 495 μL של טסיות - רק לוודא כי סדרת דילול מתאים לבדיקה תוך התחשבות כיצד נפח תזוזה משפיע על ריכוז טסיות הדם - שוב, להיות עקבי. בדוגמה, 30 μL של אגוניסט 10x מתווסף 270 μL של פלזמה עשירה טסיות (PRP).
4. לאחר שהטסיות נחות ומוכנות לשימוש, הכניסו אותן לקוביות LTA, הוסיפו מוט ערבוב ואפשרו להן להגיע ל-37 מעלות צלזיוס בבארות האחיזה.
5. ברגע שאתה בטמפרטורה, מניחים את הקובטה (ים) לתוך aggregometer ולהתחיל להקליט את trace(s). מוסיפים את האגוניסט (עם ערבוב) ומקליטים את הנתונים.
6. חזור על שלב 1.4 עבור כל ריכוז של הבדיקה והתקן עד שייאספו הנתונים הדרושים להתוויית העקומות (עקומות לדוגמה מוצגות באיור 2).
7. לחשב את העוצמה של מגיב הבדיקה ביחס לזה של התקן; שוב, השתמש בכל מדד - צבירה מקסימלית או שטח מתחת לעקומה - כל עוד יש עקביות ומודל הניתוח מתאים לנתונים.

2. בדיקת עקומות הריכוז

1. ראשית, בדקו שעקומות תגובת הריכוז מקבילות. ישנן חבילות תוכנה רבות שעושות זאת, אולם כאן התהליך מתואר עבור Graphpad Prism (ראה איור 3).
   1. הזן את הנתונים כך ש- log(concentration) יהיה על ציר X והתגובה (% צבירה מרבית/AUC) תהיה על ציר Y (איור 3A)
   2. התמרת ריכוזי CRP-XL (איור 3B)
   3. בחר רגרסיה לא ליניארית מפונקציות הניתוח והשתמש במשוואה לגירוי/עיכוב מנה-תגובה.
   4. בחר יומן (אגוניסט) לעומת תגובה (שיפוע משתנה) - השתמש בהתאמה של 3 או 4 כיוונים בהתאם לשיטה הטובה ביותר עבור הנתונים.
   5. קבע אם העקומות מקבילות באמצעות הכרטיסייה השוואה (כפי שמוצג באיור 3C) ולחץ על הלחצן כדי להשוות בין ערכות הנתונים כדי להבטיח שהשיפוע (שיפוע גבעה) והאסימפטוטות (החלק העליון והתחתון של העקומות) שקולים. בדוגמה זו, שיפוע הגבעה לבדיקה הוא 2.279, וזה של התקן הוא 2.025 נותן יחס של 1.125.
   6. אם השיפועים מקבילים (לדוגמה, קריטריון קבלה של יחס שיפוע בין 0.8-1.25) והאסימפטוטות שקולות, המשך בחישוב עוצמה (EC₅₀) באמצעות שלבים 2.1.3 ו- 2.1.4. בדוגמה המוצגת כאן, האסימפטוטים הוגבלו מכיוון שההערכה בשלב 2.1.5 אישרה כי האסימפטוטים שקולים.
   7. חלק את ערך EC₅₀ של התקן בזה של הבדיקה כדי לקבוע את העוצמה היחסית. בדוגמה המוצגת כאן, test/standard (0.07259/0.1498) = 0.4846, כלומר, ה'מבחן' חזק בחצי מהתקן.
   8. התאם את ריכוזי המסה/נפח כדי להסביר את ההבדל בעוצמה, כלומר, אם התקן שימש בעבר ב 1 מיקרוגרם / מ"ל, החומר החדש ישמש ב 1/0.4846 = 2.063 מיקרוגרם / מ"ל) כדי להבטיח כמויות דומות של חומר פעיל משמשים בניסויים

Representative Results

איור 1 הוא ייצוג דיאגרמטי של סדרת דילול ונועד להדגיש שסדרת דילול נחוצה הן עבור התקן והן עבור הבדיקה. איור 2A מציג עקבות צבירה עבור התקן, בעוד שנתוני הבדיקה מוצגים באיור 2B. ב-0.075 מק"ג/מ"ל יש תגובה ברורה לתקן, ואילו בבדיקה הריכוז המתאים (0.075 מק"ג/מ"ל) שטוח, כלומר אין תגובה. נתונים אלה משמשים כדי להתוות את הגרפים הבאים כדי לתת EC₅₀. בדוגמה המוצגת כאן, נעשה שימוש בצבירה מרבית של 100% כדי להתוות את עקומת הריכוז-תגובה ולקבוע EC₅₀, כפי שמוצג באיור 3.

איור 1: תיאור גרפי של שתי סדרות הדילולים של הבדיקה (משמאל) והתקן (מימין). החל מהריכוז העליון (ריכוז מומלץ: 10 מיקרוגרם/מ"ל CRP-XL), דילול רציף של 1 מתוך 2 נעשה במקביל מעל 8 נקודות (>3 יחידות לוג). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: עקבות צבירה עבור סדרות דילול סטנדרטיות (משמאל) ובדיקות דילול (מימין). ככל שצבירת טסיות הדם מתקדמת (ציר x), כמות האור העוברת דרך הדגימה ומגיעה לחיישן גדלה (ציר y). (א) תקן. (B) בדיקה. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הזנת נתונים וניתוחם. (A) הנתונים מוזנים, (B) מותמרים, ו-(C,D) מנותחים לצורך הקבלה (בקשו מהתוכנה לדעת אם מדרונות הגבעה והאסימפטוטים דומים [C]). (E) אם העקומות מקבילות, קבע את העוצמה (EC₅₀) באמצעות התאמת עקומת רגרסיה לא ליניארית. (ו) התווה נתונים מותמרים. אנא עיין בשיטה לפרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חיץ טירודס9
מרכיבי המדד	ריכוז	הערות
NaCl	134 מ"מ
נא2HPO4	0.34 מ"מ
KCl	2.9 מ"מ
NaHCO3	12 מ"מ
4-(2- הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאןחומצה סולפונית (HEPES)	20 מ"מ
גלוקוז	5 מ"מ
MgCl2	1 מ"מ	pH 7.3

טבלה 1: הרכב חיץ טירודס.

סדרת דילול 8 נקודות
דילול 1	10 מיקרוגרם/מ"ל
דילול 2	5 מיקרוגרם/מ"ל
דילול 3	2.5 מיקרוגרם/מ"ל
דילול 4	1.25 מיקרוגרם/מ"ל
דילול 5	0.625 מיקרוגרם/מ"ל
דילול 6	0.3125 מיקרוגרם/מ"ל
דילול 7	0.15625 מיקרוגרם/מ"ל
דילול 8	0.073125 מיקרוגרם/מ"ל

טבלה 2: דוגמה המציגה סדרת דילול של 8 נקודות.

Discussion

כפי שמוצג כאן, תהליך הסטנדרטיזציה של החומרים הוא פשוט מאוד. למרות שנדרש מעט זמן להעריך אצוות חדשות של חומר ו/או לבדוק שהאצווה הנוכחית יציבה ולא מאבדת פעילות לאורך זמן, התגמול הוא שהניסויים ניתנים לשחזור פעם אחר פעם וניתנים להשוואה לאורך שנים ולא רק לאורך החיים של אצווה של מגיב. זה גם אומר שחוקרים אחרים יכולים לשחזר במדויק את תנאי הבדיקה ושהקהילה הרמונית ברמה העולמית. השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים איסוף דם מלא והכנת PRP⁹, כמו גם דיוק בעת ביצוע סדרת הדילול. חשוב גם לוודא שעקומות הבדיקה והתקן מקבילות לפני שממשיכים בהשוואה EC₅₀ . אם הקווים אינם מקבילים, או שהאסימפטוטים אינם שקולים, זה יכול להצביע על כך שהבדיקה והחומר הסטנדרטי שונים במידה מסוימת.

כל מי שעובד במדעי הביולוגיה יודע שבדיקות ביולוגיות לא תמיד מתפקדות באופן עקבי, ולכן יש לשים לב לכך בעת הערכת הנתונים. בדוגמה המוצגת כאן, למרות שאנו משתמשים באותם תורמים כדי למדוד את עוצמתם של שני חומרים דומים מאוד, אם לא זהים, מדרונות הגבעות והאסימפטוטים אינם זהים. עם זאת, אנו מקבלים מידה מסוימת של שונות ומסיקים כי העקומות הן, במקרה זה, מקבילות, ולכן מתאימות להשוואה והתאמה של עוצמה. מולקולות ביולוגיות הן גדולות ומורכבות, ושינויים שלאחר התרגום במהלך הייצור יכולים להשפיע על עוצמתן בבדיקות ביולוגיות. סטנדרטיזציה של ביומולקולות ובדיקות ביולוגיות אינה יכולה להיעשות באמצעות מסה או נפח בלבד, ויש לעשות זאת על ידי כימות והשוואה של פעילות ביולוגית בביו-אסאי¹¹. יש להשתמש בהכשרתו ובניסיונו כדי להעריך את הנתונים בהקשר של הבדיקה.

מגבלות הטכניקה הן שבעוד שהנתונים עשויים להצביע על בעיה בריאגנטים, הם אינם יכולים לומר לך מה הבעיה. עבודה נוספת תידרש כדי לקבוע מדוע החומרים אינם דומים. בעולם אידיאלי, כל חומר קריטי לניסוי(ים) ולמסקנות מדעיות לאחר מכן יאומת על ידי ספקטרוסקופיית מסות, אך זו לא תמיד אופציה. עם זאת, אם הנתונים אינם ברי השוואה, חקירה נוספת עדיין נדרשת במידה מסוימת. מגבלה נוספת של גישה זו היא הזמן והמשאבים הדרושים כדי לעשות זאת. באופן אידיאלי, יש להשוות את הבדיקה ואת התקן ב 3-6 תורמים כדי לספק ביטחון מסוים בהקצאת פעילות ביולוגית לחומר, אך אנו מרגישים שזה מוצדק על ידי תמיכה בשחזור ואמינות. סטנדרטיזציה של חומר ביולוגי אינה נחוצה בכל פעם שניסויים מתבצעים, אך לכל הפחות, יש לעשות זאת עבור כל אצווה חדשה של אגוניסטים, רצוי בתדירות גבוהה יותר, בהתאם ליציבות ולשימוש. אכן, אם יהיה תקן זמין, זה משהו שארגוני תקינה בינלאומיים יכולים לספק בהירות לגביו.

בעוד שהדוגמה המוצגת כאן היא עבור CRP-XL בהקשר של מדידת צבירת טסיות, פרוטוקול השוואת הפעילות הביולוגית של ביומולקולות בבדיקות ביולוגיות ישים באופן נרחב בכל המגזר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.