Reprodutibilidade e harmonização em pesquisas utilizando padrões biológicos: o exemplo do peptídeo relacionado ao colágeno agonista plaquetário

Summary

Apresentamos aqui um método para padronizar o peptídeo agonista plaquetário relacionado ao colágeno reticulado (CRP-XL) usando agregometria de transmissão de luz. Enquanto o protocolo é direcionado para a função plaquetária, o processo experimental pode ser aplicado à maioria das moléculas biológicas e bioensaios para garantir rigor científico e reprodutibilidade.

Abstract

A metrologia - a ciência da medida - é um assunto sobre o qual poucos cientistas biológicos são ensinados em sua formação em detrimento deles; A aplicação de processos simples de padronização às práticas cotidianas de trabalho proporciona confiança nos dados e reprodutibilidade ao longo da distância e do tempo.

Este método demonstra como padronizar um experimento laboratorial central amplamente utilizado na pesquisa em hemostasia e na prática clínica, especificamente, medindo as respostas ao peptídeo relacionado ao colágeno agonista do receptor de colágeno plaquetário (glicoproteína [GP]VI), reticulado (CRP-XL) por agregometria de transmissão de luz (ARLT). O uso dessa abordagem garantirá a reprodutibilidade intralaboratorial e a harmonização interlaboratorial, independentemente do estoque ou fornecedor de agonistas. É importante ressaltar que este método é aplicável a outros agonistas plaquetários e, de fato, a muitas outras moléculas biológicas e bioensaios.

O processo descrito abaixo envolve fazer uma série de diluição de 6-8 pontos do "padrão" e do "teste" (o material que você está verificando) e executá-los lado a lado em um ensaio escolhido (neste caso, LTA). O CRP-XL é utilizado em concentrações massa/volume, mas nem todos os materiais apresentam a mesma actividade biológica numa dada concentração, pelo que é feita uma série de diluição para comparar o material padrão e o material de ensaio e determinar qual a concentração necessária para dar uma actividade equivalente. A série de diluição deve abranger 0-100% de agregação. Os dados são plotados por meio de regressão não linear e o valor de EC₅₀ de cada amostra (padrão e teste) é determinado. Para atribuir atividade, divida o valor EC₅₀ da norma pelo valor do teste para determinar o quanto ela é mais ou menos potente e ajustar a concentração de acordo. Esta abordagem garantirá que a mesma "actividade" biológica seja repetidamente adicionada ao ensaio.

Introduction

Muitos de nós usamos agonistas e antagonistas biológicos em nossos experimentos, na maioria das vezes em um ensaio biológico que quantifica seu efeito sobre a função celular sob condições específicas. O método aqui descrito é para o agonista plaquetário peptídeo relacionado ao colágeno, reticulado (CRP-XL), um agonista da glicoproteína VI que ativa plaquetas e cuja atividade pode ser medida em uma variedade de ensaios (agregometria de transmissão de luz, microscopia, citometria de fluxo, liberação de Ca²⁺ , etc.), mas o protocolo de padronização do agonista é aplicável a qualquer agonista biológico/antagonista e/ou bioensaio. As ciências físicas são bem versadas no uso de padrões em suas práticas diárias de trabalho, e as empresas que desenvolvem medicamentos bioterapêuticos no setor comercial entendem o valor do uso de padrões de referência¹, mas eles permanecem subutilizados por muitos cientistas biológicos, especialmente na comunidade acadêmica de pesquisa, e sua falta de uso impacta negativamente a qualidade da produção científica.

A CRP-XL é um agonista específico específico para GPVI que o campo plaquetário utiliza há décadas, desde sua descrição em 1995², ajudando a comunidade a delinear o papel da GPVI em relação a outras proteínas plaquetárias ligadoras de colágeno desde então ^3,4. Este agonista pode ser adquirido de uma variedade de fontes comerciais ou produzido internamente. O monômero peptídico pode ser comprado de um fornecedor e, em seguida, reticulado internamente ou isso pode ser feito pelo fornecedor por uma taxa extra. Uma maior economia de custos pode ser feita reduzindo a pureza necessária no momento da entrega (70% versus 95%, por exemplo). Também não há consenso sobre como o CRP-XL deve ser armazenado, sendo que alguns optam pelo crioarmazenamento e outros pela refrigeração, alguns mantendo o material liofilizado até o uso, e outros armazenando-o em solução (água ou tampão, dependendo da preferência). Portanto, a qualidade e a composição dos estoques laboratoriais não são padronizadas ou harmonizadas. Como esse agonista é usado em uma concentração definida (massa/volume) em vez de unidades de atividade, a potência da PCR-XL em um laboratório, por exemplo, a 1 μg/mL, não será a mesma de outro. Vale a pena notar que outros agonistas plaquetários usados no campo já são padronizados (por exemplo, trombina, que é fornecida e usada em unidades de atividade em vez de massa/volume), de modo que o movimento de massa/volume para unidades biológicas não deve ser muito desafiador para a comunidade. Deve-se notar também que as respostas dos pacientes aos agonistas plaquetários, incluindo a PCR-XL, são variáveis em termos de sensibilidade aos agonistas, bem como de sua capacidade de resposta (extensão da resposta)⁵, por isso é ainda mais importante usar quantidades consistentes de atividade agonista nos ensaios.

Se os agonistas plaquetários puderem ser harmonizados usando-os em uma atividade definida em vez de peso/volume, pode-se garantir que um experimento em um laboratório seja diretamente comparável ao de outros laboratórios e possa ser reproduzido com precisão com confiança. Até que o campo chegue a um acordo sobre como armazenar e padronizar a atividade do CRP-XL, é essencial realizar verificações regulares no material para garantir sua consistência ao longo dos meses/anos em que está sendo utilizado.

A atribuição de valor de atividade para padrões biológicos deve ser feita por meio de estudos colaborativos e multicêntricos (por exemplo, ^6,7) e requer especialização especializada. A necessidade de padrões biológicos estabelecidos para agonistas plaquetários foi recentemente destacada por um estudo multicêntrico colaborativo⁸ apoiado pela Sociedade Internacional de Trombose e Hemostasia (ISTH); até que um padrão internacional CRP-XL esteja disponível, os pesquisadores podem padronizar seu próprio material localmente para garantir a consistência ao longo do tempo, e que o novo material obtido comercialmente ou internamente seja de atividade comparável às preparações anteriores, bem como ao do resto da comunidade.

Protocol

O sangue deve ser coletado de voluntários saudáveis e processados de acordo com as regras locais. Este protocolo mede a agregação plaquetária induzida por agonistas no plasma rico em plaquetas (PRP) por meio da agregometria por transmissão de luz (ARLT). O ISTH fornece protocolos padronizados, incluindo um método de 2013 para preparação de PRP e LTA⁹.  Coletar sangue total em citrato de sódio a 4% de acordo com as recomendações do ISTH de acordo com as regras do comitê de ética local. Exclua doadores que tenham tomado qualquer AINE nas últimas 2 semanas.

1. Procedimento de ensaio

1. Pegue uma alíquota de estoque CRP-XL e dilua-a em tampão de ensaio (Tyrodes¹⁰) (Tabela 1) para uma concentração inicial que causará agregação máxima (veja a NOTA abaixo passo 1.3).
   NOTA: Na literatura, uma concentração de 1 μg/mL induzirá a agregação máxima, mas alguns laboratórios necessitam de concentrações mais altas para atingir o mesmo efeito - ajustar a série de diluição de acordo
2. Fazer uma série de diluição correspondente com a norma (ver NOTA abaixo passo 1.3 e figura 1) de modo a que as concentrações sejam as mesmas que o reagente de ensaio.
3. Produzir uma série de diluição de 6 a 8 pontos para o teste e o padrão, novamente em tampão de ensaio, que leva a resposta de agregação de 100% a 0% de agregação. Um exemplo mostrando uma curva de concentração da série de diluição de 8 pontos é mostrado na Tabela 2.
   NOTA: Alguns laboratórios adicionam agonista a um total de 10% do volume do ensaio, por exemplo, 50 μL de agonista a 450 μL de plaquetas, de modo que diluem uma concentração de 10x para uma concentração final de 1x no ensaio, enquanto outros adicionam volumes menores (mais concentrados) de agonista, por exemplo, 5 μL de agonista a 495 μL de plaquetas - apenas certifique-se de que a série de diluição é apropriada para o ensaio, tendo em mente como o deslocamento do volume afeta a concentração plaquetária - novamente, seja consistente. No exemplo, 30 μL de 10x agonista são adicionados a 270 μL de plasma rico em plaquetas (PRP).
4. Quando as plaquetas estiverem descansadas e prontas para uso, aliquote-as em cubetas de LTA, adicione uma barra de agitação e deixe-as atingir 37 °C nos poços de retenção.
5. Uma vez na temperatura, coloque a(s) cubeta(s) no agregômetro e comece a registrar o(s) vestígio(s). Adicione o agonista (com agitação) e registre os dados.
6. Repetir o passo 1.4 para cada concentração do ensaio e do padrão até que os dados necessários para traçar as curvas tenham sido recolhidos (exemplo de curvas apresentadas na figura 2).
7. Calcular a potência do reagente de ensaio em relação à da norma; Novamente, use qualquer métrica - agregação máxima ou área sob a curva - desde que haja consistência e o modelo de análise se ajuste adequadamente aos dados.

2. Verificação das curvas de concentração

1. Primeiro, verifique se as curvas de resposta à concentração são paralelas. Existem muitos pacotes de software que fazem isso, mas aqui o processo é descrito para o Graphpad Prism (veja a Figura 3).
   1. Insira os dados para que log(concentração) esteja no eixo X e a resposta (% agregação máxima/AUC) esteja no eixo Y (Figura 3A)
   2. Transformar concentrações de CRP-XL (Figura 3B)
   3. Selecione Regressão Não-Linear nas funções Análise e use a equação para estimulação/inibição dose-resposta.
   4. Selecione log (agonista) vs. resposta (inclinação variável) - use ajuste de 3 ou 4 vias, dependendo do que for melhor para os dados.
   5. Determine se as curvas são paralelas usando a guia Comparar (como mostrado na Figura 3C) e clique no botão para comparar os conjuntos de dados para garantir que a inclinação (inclinação Hill) e assíntotas ( a parte superior e inferior das curvas) sejam equivalentes. Neste exemplo, a inclinação da colina para o teste é 2,279, e a do padrão é 2,025, dando uma razão de 1,125.
   6. Se as inclinações forem paralelas (por exemplo, um critério de aceitação da razão de inclinação entre 0,8-1,25) e as assíntotas forem equivalentes, proceda ao cálculo da potência (EC₅₀) usando as etapas 2.1.3 e 2.1.4. No exemplo mostrado aqui, as assíntotas foram restringidas, pois a avaliação na etapa 2.1.5 confirmou que as assíntotas são equivalentes.
   7. Divida o valor EC₅₀ da norma pelo valor do teste para determinar a potência relativa. No exemplo mostrado aqui, teste/padrão (0,07259/0,1498) = 0,4846, ou seja, o 'teste' é metade da potência do padrão.
   8. Ajustar as concentrações de massa/volume para levar em conta a diferença de potência, ou seja, se o padrão foi usado anteriormente em 1 μg/mL, o novo material seria usado em 1/0,4846 = 2,063 μg/mL) para garantir que quantidades comparáveis de material ativo estejam sendo usadas em experimentos

Representative Results

A Figura 1 é uma representação diagramática de uma série de diluição e pretende destacar que uma série de diluição é necessária tanto para o padrão quanto para o teste. A Figura 2A mostra os traços de agregação para o padrão, enquanto os dados de teste são mostrados na Figura 2B. A 0,075 μg/mL, há uma resposta clara ao padrão, enquanto para o teste, a concentração correspondente (0,075 μg/mL) é plana, ou seja, nenhuma resposta. Esses dados são usados para plotar os gráficos subsequentes para fornecer o EC₅₀. No exemplo mostrado aqui, a agregação máxima de 100% foi usada para traçar a curva concentração-resposta e determinar a EC₅₀, como mostra a Figura 3.

Figura 1: Descrição gráfica das duas séries de diluições do ensaio (esquerda) e do padrão (direita). A partir da concentração máxima (concentração sugerida: 10 μg/mL CRP-XL), diluições sequenciais de 1 em 2 são feitas em paralelo ao longo de 8 pontos (>3 unidades logarítmicas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Traços de agregação para as séries padrão (esquerda) e diluição de ensaio (direita). À medida que a agregação plaquetária prossegue (eixo x), a quantidade de luz que passa pela amostra e atinge o sensor aumenta (eixo y). (A) Padrão. (B) Teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Entrada e análise dos dados. (A) Os dados são inseridos, (B) transformados e (C,D) analisados quanto ao paralelismo (peça ao software para dizer se as encostas e assíntotas são comparáveis [C]). (E) Se as curvas forem paralelas, determinar a potência (EC₅₀) usando o ajuste da curva de regressão não linear. (F) Dados transformados plotados. Consulte o método para obter mais detalhes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tampão Tyrodes9
Constituintes	Concentração	Comentários
NaCl	134 mM
Na2HPO4	0,34 mM
Kcl	2,9 mM
NaHCO3	12 mM
ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES)	20 mM
Glicose	5 mM
MgCl2	1 mM	pH 7,3

Tabela 1: Composição do tampão Tyrodes.

Série de diluição de 8 pontos
Diluição 1	10 μg/mL
Diluição 2	5 μg/mL
Diluição 3	2,5 μg/mL
Diluição 4	1,25 μg/mL
Diluição 5	0,625 μg/mL
Diluição 6	0,3125 μg/mL
Diluição 7	0,15625 μg/mL
Diluição 8	0,073125 μg/mL

Tabela 2: Um exemplo mostrando uma série de diluição de 8 pontos.

Discussion

Como mostrado aqui, o processo de padronização dos materiais é muito simples. Embora exija um pouco de tempo para avaliar novos lotes de material e/ou para verificar se o lote atual é estável e não perde atividade ao longo do tempo, a recompensa é que os experimentos são reprodutíveis repetidamente e comparáveis ao longo de anos, em vez de apenas a vida útil de um lote de reagente. Isso também significa que outros pesquisadores podem recriar com precisão as condições do ensaio e que a comunidade está harmonizada em nível global. As etapas críticas do protocolo incluem a coleta de sangue total e o preparo do PRP⁹, bem como a precisão na confecção da série de diluição. Também é importante garantir que o teste e as curvas padrão sejam paralelos antes de prosseguir com a comparação EC₅₀ . Se as linhas não forem paralelas, ou as assíntotas não forem equivalentes, isso pode indicar que o material de ensaio e o material padrão são diferentes em algum grau.

Todo mundo que trabalha nas ciências biológicas sabe que os ensaios biológicos nem sempre têm um desempenho consistente, então é preciso estar atento a isso ao avaliar os dados. No exemplo mostrado aqui, embora estejamos usando os mesmos doadores para medir a potência de dois materiais muito semelhantes, se não idênticos, as encostas e assíntotas não são idênticas. No entanto, aceitamos um grau de variabilidade e concluímos que as curvas são, neste caso, paralelas e, portanto, adequadas para comparar e ajustar a potência. As moléculas biológicas são grandes e complexas, e modificações pós-traducionais durante a fabricação podem influenciar sua potência em bioensaios. A padronização de biomoléculas e bioensaios não pode ser feita apenas em massa ou volume e deve ser feita quantificando-se e comparando-se a atividade biológica em um bioensaio¹¹. Deve-se usar seu treinamento e experiência para avaliar os dados no contexto do ensaio.

As limitações da técnica são que, embora os dados possam indicar um problema com o(s) reagente(s), ele não pode dizer qual é o problema. Mais trabalhos serão necessários para determinar por que os materiais não são comparáveis. Em um mundo ideal, qualquer material crítico para experimento(s) e subsequentes conclusões científicas seria verificado por espectroscopia de massas, mas isso nem sempre é uma opção. No entanto, se os dados não forem comparáveis, ainda se justifica uma investigação mais aprofundada a algum nível. Outra limitação dessa abordagem é o tempo e os recursos necessários para fazê-lo. Idealmente, o teste e o padrão devem ser comparados em 3-6 doadores para fornecer alguma confiança na atribuição de atividade biológica ao material, mas achamos que isso se justifica por apoiar a reprodutibilidade e confiabilidade. A padronização do material biológico não é necessária toda vez que experimentos são realizados, mas, no mínimo, deve ser feita para cada novo lote de agonistas, de preferência com maior frequência, dependendo da estabilidade e do uso. De fato, caso uma norma seja disponibilizada, isso é algo sobre o qual as organizações internacionais de normalização podem fornecer clareza.

Enquanto o exemplo mostrado aqui é para CRP-XL no contexto da medição da agregação plaquetária, o protocolo de comparação da atividade biológica de biomoléculas em bioensaios é amplamente aplicável em todo o setor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.