Reproducerbarhet och harmonisering i forskning med biologiska standarder: exemplet på trombocytagonist kollagenrelaterad peptid

Summary

Här presenterar vi en metod för att standardisera trombocytagonistkollagenrelaterad peptidtvärbunden (CRP-XL) med hjälp av ljustransmissionsaggregometri. Även om protokollet är inriktat på trombocytfunktion, kan den experimentella processen tillämpas på de flesta biologiska molekyler och bioassays för att säkerställa vetenskaplig stringens och reproducerbarhet.

Abstract

Metrologi - vetenskapen om mått - är ett ämne som få biologiska forskare får lära sig om i sin utbildning till deras nackdel. Tillämpningen av enkla standardiseringsprocesser i det dagliga arbetet ger förtroende för data och reproducerbarhet över avstånd och tid.

Denna metod visar hur man standardiserar ett kärnlaboratorieexperiment som används i stor utsträckning inom hemostasforskning och klinisk praxis, specifikt för att mäta svar på trombocytkollagenreceptorn (glykoprotein [GP]VI) agonist kollagenrelaterad peptid, tvärbunden (CRP-XL) genom ljustransmissionsaggregometri (LTA). Genom att använda detta tillvägagångssätt säkerställs reproducerbarhet inom laboratoriet och harmonisering mellan laboratorier, oavsett agonistlager eller leverantör. Det är viktigt att denna metod är tillämplig på andra trombocytagonister och, faktiskt, många andra biologiska molekyler och bioassays.

Processen som beskrivs nedan innebär att man gör en 6-8-punkts utspädningsserie av "standarden" och "testet" (materialet du kontrollerar) och kör dem sida vid sida i en vald analys (i detta fall LTA). CRP-XL används vid mass-/volymkoncentrationer, men alla material ger inte samma biologiska aktivitet vid en given koncentration, så en spädningsserie görs för att jämföra standard- och testmaterialet och bestämma vilken koncentration som behövs för att ge ekvivalent aktivitet. Utspädningsserien måste spänna över 0-100 % aggregering. Data plottas med hjälp av icke-linjär regression och EC_50-värdet för varje prov (standard och test) bestäms. För att tilldela aktivitet, dividera EC_50-värdet för standarden med testets för att bestämma hur mycket mer eller mindre potent det är och justera koncentrationen därefter. Detta tillvägagångssätt kommer att säkerställa att samma biologiska "aktivitet" läggs till analysen om och om igen.

Introduction

Många av oss använder biologiska agonister och antagonister i våra experiment, oftast i en biologisk analys som kvantifierar deras effekt på cellens funktion under specifika förhållanden. Metoden som beskrivs här är för trombocytagonistkollagenrelaterad peptid, tvärbunden (CRP-XL), en glykoprotein VI-agonist som aktiverar trombocyter och vars aktivitet kan mätas i en mängd olika analyser (ljustransmissionsaggregometri, mikroskopi, flödescytometri, Ca²⁺ -frisättning, etc.), men agoniststandardiseringsprotokollet är tillämpligt på alla biologiska agonister/antagonister och/eller bioassay. De fysiska vetenskaperna är väl förtrogna med användningen av standarder i sitt dagliga arbete, och företag som utvecklar bioterapeutiska läkemedel inom den kommersiella sektorn förstår värdet av att använda referensstandarder¹, men de är fortfarande underutnyttjade av många biologiska forskare, särskilt i det akademiska forskarsamhället, och deras brist på användning påverkar kvaliteten på vetenskapliga resultat negativt.

CRP-XL är en specifik GPVI-specifik agonist som trombocytfältet har använt i årtionden sedan det beskrevs 1995², vilket hjälper samhället att avgränsa GPVI:s roll från andra kollagenbindande trombocytproteiner ända sedan ^3,4. Denna agonist kan anskaffas från en mängd olika kommersiella källor eller produceras internt. Peptidmonomeren kan köpas från en leverantör och sedan tvärbindas internt eller så kan detta göras av leverantören mot en extra avgift. Ytterligare kostnadsbesparingar kan göras genom att minska den renhet som krävs vid leverans (70 % jämfört med 95 %, till exempel). Det finns inte heller någon konsensus om hur CRP-XL ska förvaras, med vissa som väljer kryolagring och andra kylning, vissa behåller materialet frystorkat fram till användning, och andra förvarar det i lösning (vatten eller buffert, beroende på vad man föredrar). Därför är kvaliteten och sammansättningen av laboratorielager icke-standardiserade eller harmoniserade. Eftersom denna agonist används vid en definierad koncentration (massa/volym) snarare än aktivitetsenheter, kommer styrkan hos CRP-XL i ett laboratorium, t.ex. vid 1 μg/ml, inte att vara densamma som i ett annat. Det är värt att notera att andra trombocytagonister som används inom området redan är standardiserade (t.ex. trombin, som tillförs och används i aktivitetsenheter snarare än massa/volym), så övergången från massa/volym till biologiska enheter bör inte vara alltför utmanande för samhället. Det bör också noteras att patienters svar på trombocytagonister, inklusive CRP-XL, varierar när det gäller deras känslighet för agonister såväl som deras förmåga att svara (grad av respons)⁵, så det är ännu viktigare att använda konsekventa mängder agonistaktivitet i analyserna.

Om trombocytagonister kan harmoniseras genom att använda dem vid en definierad aktivitet snarare än vikt/volym, kan det säkerställas att ett experiment i ett laboratorium är direkt jämförbart med det i andra laboratorier och kan reproduceras korrekt med säkerhet. Fram till dess att fältet når en överenskommelse om hur CRP-XL-aktiviteten ska lagras och standardiseras är det viktigt att utföra regelbundna kontroller av materialet för att säkerställa dess konsistens under de månader/år då det används.

Aktivitetsvärdestilldelning för biologiska standarder måste göras genom kollaborativa, multicenterstudier (till exempel ^6,7) och kräver specialistkompetens. Behovet av etablerade biologiska standarder för trombocytagonister har nyligen belysts av en multicenterstudie⁸ som stöds av International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH); Fram till dess att en internationell CRP-XL-standard finns tillgänglig kan forskare standardisera sitt eget material lokalt för att säkerställa konsekvens över tid, och att nytt material som anskaffas kommersiellt eller internt är av jämförbar aktivitet med tidigare preparat, såväl som det i resten av samhället.

Protocol

Blod ska samlas in från samtyckande friska frivilliga och behandlas i enlighet med lokala regler. Detta protokoll mäter agonist-inducerad trombocytaggregation i trombocytrik plasma (PRP) genom ljustransmissionsaggregometri (LTA). ISTH tillhandahåller standardiserade protokoll, inklusive en 2013-metod för förberedelse av grundförutsättningar och LTA⁹.  Samla in helblod i 4 % natriumcitrat enligt ISTH:s rekommendationer i enlighet med lokala etiska kommittéregler. Uteslut donatorer som har tagit NSAID under de senaste 2 veckorna.

1. Metod för analys

1. Ta en alikvot stam CRP-XL och späd den i analysbuffert (Tyrodes¹⁰) (tabell 1) till en startkoncentration som ger maximal aggregering (se anmärkning nedan steg 1.3).
   ANMÄRKNING: I litteraturen kommer en koncentration på 1 μg/ml att inducera maximal aggregering, men vissa laboratorier behöver högre koncentrationer för att uppnå samma effekt - justera spädningsserien därefter
2. Gör en motsvarande utspädningsserie med standarden (se anmärkningen under steg 1.3 och figur 1) så att koncentrationerna är desamma som testreagensen.
3. Ta fram en 6- till 8-punkts utspädningsserie för testet och standarden, återigen i analysbuffert, som tar aggregeringssvaret från 100 % till 0 % aggregering. Ett exempel som visar en koncentrationskurva för 8-punkts utspädningsserier visas i tabell 2.
   OBS: Vissa laboratorier tillsätter agonist med totalt 10 % analysvolym, t.ex. 50 μL agonist till 450 μL trombocyter, så att de späder ut en 10x koncentration till en slutlig 1x koncentration i analysen, medan andra tillsätter mindre (mer koncentrerade) volymer agonist, t.ex. 5 μL agonist till 495 μL trombocyter - se bara till att spädningsserien är lämplig för analysen med tanke på hur volymförskjutningen påverkar trombocytkoncentrationen - återigen, var konsekvent. I exemplet tillsätts 30 μl 10x-agonist till 270 μL trombocytrik plasma (PRP).
4. När trombocyterna är vilande och redo att användas, lägg dem i LTA-kyvetter, tillsätt en omrörningsstav och låt dem nå 37 °C i förvaringsbrunnarna.
5. När temperaturen är framme, placera kyvetten/kyvetterna i aggregometern och börja registrera spåren/spåren. Tillsätt agonisten (under omrörning) och anteckna data.
6. Upprepa steg 1.4 för varje koncentration av testet och standarden tills de data som behövs för att rita kurvorna har samlats in (exempelkurvor visas i figur 2).
7. Beräkna testreagensens styrka i förhållande till standarden. Återigen, använd vilket mått som helst - maximal aggregering eller area under kurvan - så länge det finns konsekvens och analysmodellen passar data på rätt sätt.

2. Kontroll av koncentrationskurvorna

1. Kontrollera först att koncentrationsresponskurvorna är parallella. Det finns många mjukvarupaket som gör detta, men här beskrivs processen för Graphpad Prism (se figur 3).
   1. Ange data så att log (koncentration) ligger på X-axeln och responsen (% maximal aggregering/AUC) på Y-axeln (figur 3A)
   2. Omvandla CRP-XL-koncentrationer (figur 3B)
   3. Välj icke-linjär regression från analysfunktionerna och använd ekvationen för dos-responsstimulering/hämning.
   4. Välj log (agonist) kontra respons (variabel lutning) - använd 3- eller 4-vägspassning beroende på vilket som är bäst för data.
   5. Bestäm om kurvorna är parallella med hjälp av fliken Jämför (som visas i figur 3C) och klicka på knappen för att jämföra datauppsättningarna för att säkerställa att lutningen (kullens lutning) och asymptoter (kurvornas över- och undersida ) är likvärdiga. I det här exemplet är lutningen för testet 2,279 och standardens lutning är 2,025, vilket ger ett förhållande på 1,125.
   6. Om lutningarna är parallella (t.ex. ett acceptanskriterium för lutningsförhållande mellan 0,8-1,25) och asymptoterna är ekvivalenta, fortsätt med potensberäkningen (EC₅₀) med hjälp av steg 2.1.3 och 2.1.4. I exemplet som visas här har asymptoterna begränsats eftersom utvärderingen i steg 2.1.5 bekräftade att asymptoterna är ekvivalenta.
   7. Dividera EC_50-värdet för standarden med värdet för testet för att bestämma den relativa styrkan. I exemplet som visas här är test/standard (0,07259/0,1498) = 0,4846, dvs. "testet" är hälften så potent som standarden.
   8. Justera mass-/volymkoncentrationerna för att ta hänsyn till skillnaden i styrka, dvs. om standarden tidigare användes vid 1 μg/ml, skulle det nya materialet användas vid 1/0,4846 = 2,063 μg/ml) för att säkerställa att jämförbara mängder aktivt material används i experiment

Representative Results

Figur 1 är en schematisk framställning av en utspädningsserie och avsedd att belysa att en utspädningsserie behövs för både standarden och provningen. Figur 2A visar aggregeringsspår för standarden, medan testdata visas i figur 2B. Vid 0,075 μg/ml finns det ett tydligt svar på standarden, medan motsvarande koncentration (0,075 μg/ml) är platt för testet, dvs. inget svar. Dessa data används för att plotta de efterföljande graferna för att ge EC₅₀. I exemplet som visas här användes 100 % maximal aggregering för att plotta koncentrations-responskurvan och bestämma EC₅₀, som visas i figur 3.

Figur 1: Grafisk beskrivning av de två utspädningsserierna i provningen (vänster) och standarden (höger). Om vi börjar med den högsta koncentrationen (föreslagen koncentration: 10 μg/ml CRP-XL) görs sekventiella 1:2 utspädningar parallellt över 8 punkter (>3 logaritmenheter). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Aggregeringsspår för standard- (vänster) och provutspädningsserien (höger). När trombocytaggregationen fortsätter (x-axeln) ökar mängden ljus som passerar genom provet och når sensorn (y-axeln). (A) Standard. (B) Testa. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Datainmatning och analys. (A) Data matas in, (B) transformeras och (C,D) analyseras för parallellitet (be programvaran att berätta om Hill-sluttningarna och asymptoterna är jämförbara [C]). (E) Om kurvorna är parallella, bestäm potensen (EC₅₀) med hjälp av icke-linjär regressionskurva. (F) Plottade transformerade data. Se metoden för mer information. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tyrodes buffert9
Beståndsdelar	Koncentration	Kommentarer
NaCl	134 mM
Na2HPO4	0,34 mM
KCl	2,9 mM
NaHCO3	12 m²
4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES)	20 m²
Glukos	5 mM
MgCl2	1 mM	pH 7,3

Tabell 1: Sammansättning av Tyrodesbufferten.

Serie med 8-punkts utspädning
Utspädning 1	10 μg/ml
Utspädning 2	5 μg/ml
Utspädning 3	2,5 μg/ml
Utspädning 4	1,25 μg/ml
Utspädning 5	0,625 μg/ml
Utspädning 6	0,3125 μg/ml
Utspädning 7	0,15625 μg/ml
Utspädning 8	0,073125 μg/ml

Tabell 2: Ett exempel som visar en 8-punkts utspädningsserie.

Discussion

Som visas här är processen att standardisera materialen mycket enkel. Även om det kräver lite tid att utvärdera nya materialsatser och/eller att kontrollera att den aktuella satsen är stabil och inte förlorar aktivitet över tid, är belöningen att experimenten är reproducerbara om och om igen och jämförbara över flera år snarare än bara livslängden för en sats reagens. Det innebär också att andra forskare kan återskapa analysförhållanden på ett korrekt sätt och att samhället harmoniseras på global nivå. Kritiska steg i protokollet inkluderar helblodsinsamling och PRP-förberedelse⁹, samt precision vid tillverkning av spädningsserien. Det är också viktigt att se till att test- och standardkurvorna är parallella innan du fortsätter med EC_{50-jämförelsen} . Om linjerna inte är parallella, eller om asymptoterna inte är ekvivalenta, kan det tyda på att test- och standardmaterialet skiljer sig åt till viss del.

Alla som arbetar inom de biologiska vetenskaperna vet att biologiska analyser inte alltid fungerar konsekvent, så man måste vara uppmärksam på detta när man utvärderar data. I exemplet som visas här, även om vi använder samma donatorer för att mäta styrkan hos två mycket lika, om inte identiska, material, är kullsluttningarna och asymptoterna inte identiska. Ändå accepterar vi en viss variabilitet och drar slutsatsen att kurvorna i detta fall är parallella och därför lämpliga för att jämföra och justera potensen. Biologiska molekyler är stora och komplexa, och posttranslationella modifieringar under tillverkningen kan påverka deras styrka i bioassays. Standardisering av biomolekyler och bioassays kan inte göras med bara massa eller volym och måste göras genom att kvantifiera och jämföra biologisk aktivitet i en bioassay¹¹. Man måste använda sin utbildning och erfarenhet för att utvärdera data i samband med analysen.

Teknikens begränsningar är att även om data kan indikera ett problem med reagensen/reagenserna, kan de inte berätta vad problemet är. Ytterligare arbete kommer att behövas för att ta reda på varför materialen inte är jämförbara. I en idealisk värld skulle allt material som är kritiskt för experiment och efterföljande vetenskapliga slutsatser verifieras med masspektroskopi, men detta är inte alltid ett alternativ. Om uppgifterna inte är jämförbara är det dock fortfarande motiverat med ytterligare undersökningar i viss utsträckning. En annan begränsning med detta tillvägagångssätt är den tid och de resurser som krävs för att göra det. Helst bör testet och standarden jämföras med 3-6 donatorer för att ge ett visst förtroende för att tilldela biologisk aktivitet till materialet, men vi anser att detta är motiverat genom att stödja reproducerbarhet och tillförlitlighet. Standardisering av biologiskt material behövs inte varje gång försök körs, men det bör åtminstone göras för varje ny sats agonister, helst oftare, beroende på stabilitet och användning. Om en standard skulle göras tillgänglig är detta något som internationella standardiseringsorganisationer kan ge klarhet i.

Även om exemplet som visas här är för CRP-XL i samband med mätning av trombocytaggregation, är protokollet för att jämföra den biologiska aktiviteten hos biomolekyler i bioassays allmänt tillämpligt inom hela sektorn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.