Summary
Il test di sicurezza della minaccia sociale consente una valutazione simultanea dello sviluppo dell'evitamento sociale come misura dell'apprendimento condizionato avversivo e della capacità di discriminazione della sicurezza della minaccia sociale, entrambi utilizzati per identificare individui suscettibili allo stress e resilienti allo stress all'interno di un singolo gruppo di topi maschi cronicamente socialmente sconfitti.
Abstract
Lo stress sociale è una delle principali cause dello sviluppo di disturbi mentali. Per aumentare il valore traslazionale degli studi preclinici, l'esperienza dello stress sociale e il suo impatto comportamentale sui topi dovrebbero essere paragonabili a quelli umani. La sconfitta sociale cronica (CSD) utilizza un tipo di stress sociale che coinvolge attacchi fisici e minacce sensoriali per indurre disfunzioni mentali simili ai disturbi affettivi umani. Per rafforzare la componente psicosociale della CSD, è stato applicato un protocollo CSD di 10 giorni in cui gli attacchi fisici quotidiani sono standardizzati in tre episodi di 10 secondi seguiti da una fase sensoriale di 24 ore. Dopo la decimafase sensoriale , il protocollo CSD è seguito da un test comportamentale raffinato chiamato test di sicurezza della minaccia sociale (STST). I test comportamentali post-stress devono determinare come e in che misura il fattore di stress sociale ha influenzato il comportamento. L'STST consente ai topi maschi cronicamente socialmente sconfitti di interagire con 2 nuovi individui maschi (bersagli sociali): un bersaglio sociale del ceppo attaccante incontrato durante i giorni della CSD e l'altro di un nuovo ceppo. Entrambi sono presentati simultaneamente in diversi compartimenti di un'arena di prova a tre camere. Il test consente una valutazione simultanea dello sviluppo dell'evitamento sociale per misurare l'apprendimento condizionato avversivo di successo e la capacità di discriminazione della minaccia sociale e della sicurezza. Lo sviluppo dell'evitamento sociale nei confronti di entrambi i ceppi riflette una risposta avversiva generalizzata e, quindi, una misurazione della suscettibilità allo stress. Nel frattempo, lo sviluppo dell'evitamento sociale solo verso il ceppo attaccante riflette la discriminazione della sicurezza della minaccia e, quindi, una misura della resilienza allo stress. Infine, l'assenza di evitamento sociale nei confronti del ceppo attaccante riflette un apprendimento condizionato avversivo alterato. Il protocollo mira a perfezionare i modelli murini di suscettibilità/resilienza allo stress attualmente utilizzati includendo criteri traslazionali, in particolare la discriminazione minaccia-sicurezza e la generalizzazione della risposta avversiva, per classificare un singolo gruppo di animali cronicamente socialmente sconfitti in sottogruppi resilienti e suscettibili, avanzando infine futuri approcci traduzionali.
Introduction
Lo stress è definito come l'interruzione dell'omeostasi causata da stimoli fisici o psicologici1. Lo stress è un noto fattore di rischio importante per lo sviluppo di disturbi mentali come il disturbo da stress post-traumatico, la depressione e l'ansia 2,3. In particolare, lo stress sociale è considerato un importante fattore di rischio per lo sviluppo di disturbi mentali legati allo stress4. Un tipo di stress sociale che ha acquisito particolare importanza nella ricerca è lo stress di subordinazione sociale5. I topi, come gli esseri umani, sono in grado di sviluppare un ricco insieme di comportamenti sociali6, il che li rende adatti per indagini che coinvolgono lo stress sociale. Nell'ambiente di laboratorio, quando i topi adulti sono ospitati in gruppo, stabiliscono una struttura sociale che coinvolge la formazione dei ranghi7. Di conseguenza, il modello di colonia è stato progettato per studiare gli effetti delle gerarchie sociali stabilite naturalmente in gruppi misti di topi8. Nel corso degli anni, sono state sviluppate varianti del modello di colonia per utilizzare lo stress di subordinazione sociale, compresi i modelli di gruppo dello stesso sesso, il modello di instabilità sociale e il modello di colonia di intrusi. Negli ultimi anni, tuttavia, una particolare variante nota come modello residente maschile-intruso è stata resa popolare in letteratura, semplificando la complessità sociale a due topi: un residente e un intruso. L'animale di interesse, noto come intruso, viene messo nella gabbia di un allevatore più grande, più anziano e in pensione, noto come residente o aggressore. Il residente attacca quindi fisicamente l'intruso come metodo di confronto, stabilendo una gerarchia sociale in cui il residente è dominante e l'intruso è subordinato. Quando gli scontri sono eventi una tantum, vengono classificati come "acuti" (il "modello della sconfitta sociale acuta"), mentre gli scontri ripetuti che durano diversi giorni (di solito 10) sono noti come "cronici" (il "modello della sconfitta sociale cronica"). Nel modello di sconfitta sociale cronica (CSD), gli attacchi sono intermittenti e tipicamente limitati a un periodo di 5-10 minuti9, chiamato fase fisica. Dopo la fase fisica, l'intruso e il residente vengono tenuti per la notte nella stessa gabbia, separati a metà da una parete a rete, consentendo tutte le forme di interazione tranne il contatto fisico. Questa configurazione, nota come fase sensoriale, induce stress attraverso la continua comparsa di una minaccia invece di un confronto fisico diretto. Nel 2018, van der Kooji e colleghi hanno introdotto un trattamento di sconfitta sociale cronica modificato per concentrarsi sulla componente psicosociale del modello, standardizzando e limitando rigorosamente la fasefisica 10. Il modello modificato limita gli attacchi fisici a tre episodi di 10 secondi con residenti diversi, che si verificano a intervalli di 15 minuti tra un episodio e l'altro della fase sensoriale. Dopo il terzo episodio fisico, la fase sensoriale dura tutta la notte. Questo ciclo si ripete per 10 giorni consecutivi con nuovi residenti per episodio. Il trattamento modificato migliora la validità traslazionale del modello di sconfitta sociale cronica in quanto il danno fisico dell'intruso è ridotto al minimo e la variabilità dei risultati derivanti da durate differenziali degli attacchi fisici è ridotta.
Poiché il modello CSD viene utilizzato per studiare le malattie legate allo stress (ad esempio, depressione, ansia, disturbo da stress post-traumatico), vengono scelti saggi post-comportamentali, inclusi, ma non limitati a, saggi comportamentali di aggressività, memoria e anedonia. Negli ultimi anni, i saggi comportamentali post-CSD nei topi spesso valutano come e in che misura la socialità è influenzata9. La socievolezza è definita come la preferenza innata dei topi di interagire socialmente piuttosto che evitare socialmente un conspecifico. Poiché la socialità è soggetta agli effetti dello stress, sono stati stabiliti saggi che valutano esclusivamente lo sviluppo dell'evitamento sociale. L'evitamento sociale indotto dallo stress ha una rilevanza traslazionale in quanto rappresenta uno dei principali sintomi comportamentali dell'ansia sociale e della depressione negli esseri umani11. Analogamente agli esseri umani, non tutti i topi sviluppano l'evitamento sociale dopo il trattamento con CSD, suggerendo la presenza di individualità nella risposta allo stress. Cohen e colleghi hanno proposto che i criteri comportamentali cut-off siano un approccio promettente per lo studio della neurobiologia dell'individualità12. La selezione degli animali in base al comportamento si traduce in una divisione del gruppo, sottolineando le basi per gli studi gene-ambientali. Successivamente, diversi sottogruppi mostrano spesso un distinto arricchimento di specifiche varianti/modificazioni genetiche, che a loro volta possono essere studiate in diverse condizioni ambientali13. Di conseguenza, l'individualità nello sviluppo dell'evitamento sociale è stata utilizzata per dividere il singolo gruppo di topi maschi cronicamente socialmente sconfitti in due sottogruppi: suscettibili allo stress (socialmente evitanti) e resistenti allo stress (socialmente non evitanti 9,14). Tuttavia, l'interpretazione del fenotipo di evitamento sociale nei topi come comportamento disadattivo o adattativo dovrebbe essere considerata nel contesto generale sia del trattamento (in questo caso CSD) che del test comportamentale post-trattamento. Inoltre, il test comportamentale post-trattamento di scelta valuterebbe idealmente altri aspetti della socialità e non solo lo sviluppo dell'evitamento sociale. Il nostro recente lavoro ha rivelato il coinvolgimento dell'apprendimento condizionato nell'evitamento sociale indotto dalla CSD15. In particolare, l'evitamento sociale indotto da CSD è una risposta condizionata avversiva nei confronti dei tratti caratterizzanti del ceppo dei residenti che funge da stimolo condizionato allo stimolo incondizionato, vale a dire gli attacchi da parte dei residenti. Inoltre, all'interno del sottogruppo socialmente evitante, alcuni individui possono discriminare tra i tratti del ceppo dei residenti avversi e quelli di altri nuovi ceppi sicuri, mentre altri individui mostrano un evitamento sociale generalizzato a entrambi i ceppi. Proponiamo qui un raffinato test comportamentale post-CSD: il Social Threat-Safety Test (STST)15. A differenza di altri test di interazione sociale9, l'STST consente una valutazione simultanea dello sviluppo dell'evitamento sociale come misura della corretta risposta condizionata avversiva (cioè l'apprendimento condizionato di successo) e della capacità di discriminazione della minaccia sociale e della sicurezza, entrambe utilizzate per identificare individui suscettibili allo stress e resilienti allo stress all'interno di un singolo gruppo di topi maschi cronicamente socialmente sconfitti. La valutazione della discriminazione tra minaccia sociale e sicurezza rispetto alla generalizzazione della risposta avversiva estende i criteri traslazionali utilizzati per classificare il singolo gruppo di animali cronicamente socialmente sconfitti in sottogruppi resilienti e suscettibili.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee relativa alla cura e all'uso degli animali per le procedure sperimentali e sono state approvate dalle autorità locali (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). La Figura 1 rappresenta una sequenza temporale schematica.
1. Trattamento
- Animali di interesse: Ottenere topi maschi C57BL6/J a 7 settimane di età e, all'arrivo, in una casa singola in una struttura a temperatura e umidità controllata con un ciclo luce-buio di 12 ore (luci accese: 8:00; luci spente: 20:00; 23 °C; 38% di umidità) con cibo e acqua ad libitum.
- Sconfitta sociale cronica (CSD)
- Gruppo di trattamento
- Dopo 1 settimana di assuefazione, eseguire il trattamento con CSD per 10 giorni consecutivi utilizzando il ceppo CD-1 come ceppo del residente (per un protocollo dettagliato, fare riferimento a sconfitta sociale cronica9 e trattamento di sconfitta sociale cronicamodificata 10).
- Introdurre il mouse C57BL6/J nella gabbia del mouse CD-1 e contare 10 s di attacco fisico. Ripeti questo episodio tre volte, ognuna con un mouse CD-1 diverso, e separa di intervalli di 15 minuti tra un episodio e l'altro.
- Posizionare una parete a rete tra il mouse C57BL6/J e il mouse CD-1 durante questi intervalli, consentendo solo il contatto sensoriale. Dopo il terzo episodio, alloggia i topi C57BL6/J durante la notte nelle gabbie dei topi CD-1, separandoli entrambi da un muro a rete. Ripetere per 10 giorni.
NOTA: Numero di topi CD-1 = numero di topi C57BL6/J + 1. Se il numero di topi trattati con C57BL6/J è inferiore a 10, è comunque necessario un minimo di 10 topi CD-1 per garantire che ogni giorno l'ultima fase sensoriale (che dura tutta la notte) sia con un nuovo topo CD-1 per tutti i 10 giorni di trattamento. - Valutare attentamente il benessere fisico degli animali durante i 10 giorni. Se un animale è gravemente ferito, escluderlo dall'esperimento per motivi etici e scientifici (mobilità/attività durante il test post-trattamento). La Tabella 1 fornisce una lista di controllo per il benessere.
- Gruppo di controllo
- All'arrivo, mantenere i topi della stessa età nelle stesse condizioni del gruppo di trattamento.
- Dopo 1 settimana di assuefazione, introdurre gli animali di controllo per 90 secondi in una gabbia vuota e poi riportarli in gabbie individuali (a stabulazione singola) separate a metà da pareti a maglie identiche a quelle utilizzate per il gruppo di trattamento. Eseguire questa operazione quotidianamente in parallelo ai 10 giorni di trattamento.
NOTA: Si consiglia di tenere il gruppo di controllo e il gruppo di trattamento alloggiati in stanze diverse.
- Gruppo di trattamento
- Dopo l'ultima (decima) fase sensoriale, alloggiare tutti i topi in nuove gabbie in condizioni simili a quelle descritte all'arrivo e lasciarli riposare per tutta la notte.
NOTA: L'ultima fase sensoriale dovrebbe durare 24 ore, dopodiché gli animali vengono alloggiati in una casa singola.
2. Test post-trattamento: test di sicurezza contro la minaccia sociale (Figura 2)
- Dopo il trattamento con CSD, tutti i topi (trattati e gruppi di controllo) sono stati isolati in nuove gabbie in condizioni simili a quelle descritte all'arrivo e li hanno lasciati riposare per la notte.
- Durante le ore mattutine (8:00-13:30), pulire l'arena a tre camere (di forma rettangolare con dimensioni totali di 60 cm x 40 cm, realizzata con pareti acriliche trasparenti e pavimenti lisci) con etanolo al 5% e posizionarla sotto la telecamera con condizioni di luce di 37 lux. Assicurati che l'intera arena sia visibile.
- Pulire gli involucri a rete (simili a gabbie in metallo o acrilico) con etanolo al 5% e posizionarli come mostrato negli angoli della Figura 1A.
- Fase di assuefazione: introduci l'animale di interesse al centro dell'arena, consenti l'esplorazione per 6 minuti e poi riportalo nella sua gabbia di casa.
- Posizionare il nuovo (sconosciuto) bersaglio sociale CD-1 (conspecifico) sotto un recinto a rete e il nuovo bersaglio sociale 129/Sv sotto l'altro recinto a rete.
NOTA: È importante utilizzare un conspecifico 129/Sv sconosciuto per evitare un bias di familiarità. Preferibilmente avere 4 recinti a rete per arena: 2 attribuiti alla fase di assuefazione e 2 alla fase di test. - Fase di test: reintrodurre immediatamente l'animale di interesse al centro dell'arena e consentire l'esplorazione per 6 minuti.
- Riporta tutti gli animali a casa loro. Pulire l'arena e i recinti a rete con etanolo al 5% tra i test di animali diversi, ma mai durante l'osservazione dello stesso animale, cioè mai tra la fase di assuefazione e quella di test.
- Alternare la posizione degli involucri a rete tra gli animali (e mai tra le due fasi all'interno dello stesso animale) per controllare eventuali distorsioni preferenziali di posizione.
3. Punteggio e analisi
NOTA: Viene valutato e analizzato solo il test di trattamento post-stress, ovvero l'STST (e non il trattamento da stress CSD).
- Definire la zona di interazione come 2 cm attorno ai contorni degli involucri della rete.
- Calcola la durata dell'esplorazione dei recinti a rete durante la fase di assuefazione quando il naso dell'animale si trova all'interno della zona di interazione.
- Assegna un punteggio alla durata dell'interazione con i target sociali durante la fase di test, quando il naso dell'animale si trova all'interno della zona di interazione.
NOTA: Il rilevamento può essere ottenuto manualmente (utilizzando un timer o un software per l'assegnazione manuale del punteggio) o automaticamente. Indipendentemente dal metodo di rilevamento, prendi il punto del naso per le misurazioni dell'esplorazione e dell'interazione sociale e il punto centrale del corpo per le misurazioni relative all'attività (ad esempio, la distanza percorsa). - Calcola l'indice di interazione sociale come segue: tempo trascorso ad esplorare ciascun bersaglio sociale durante la fase di test / tempo medio trascorso ad esplorare i due recinti a rete vuoti durante la fase di assuefazione (Figura 2B).
- Suddividere il gruppo di trattamento in 3 sottogruppi come segue: gli animali con un indice di interazione sociale ≥1 con il bersaglio sociale CD-1 non sono evitanti, gli animali con un indice di interazione sociale <1 con entrambi i bersagli sociali sono evitatori indiscriminati, gli animali con un indice di interazione sociale ≥1 solo con il bersaglio sociale 129/Sv sono discriminanti-evitatori (Figura 2C-D).
NOTA: Il numero di animali all'interno di ciascuno dei tre sottogruppi può differire tra i diversi lotti di animali (circa 1/3 di tutti gli animali sottoposti al trattamento CSD presenterà le caratteristiche fenotipiche di uno dei tre sottogruppi). - Valutare l'effetto dello stress analizzando statisticamente l'indice di interazione sociale con il target sociale CD-1 tra il gruppo di trattamento e il gruppo di controllo (test t parametrico a due campioni o test di Mann-Whitney non parametrico).
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Representative Results
L'indice di interazione sociale come misura della risposta condizionata avversiva
Un indice di interazione sociale ≥1 riflette una maggiore interazione sociale con il rispettivo target sociale rispetto all'esplorazione dei recinti a rete vuota. In condizioni basali, qui definite come non avere né esperienza appetitiva né avversiva con i tratti caratterizzanti di un ceppo specifico (qui sia i bersagli sociali per il gruppo di controllo che il bersaglio sociale 129/Sv per il gruppo di trattamento), i livelli di socialità intatti si riflettono in un indice di interazione sociale ≥1 con lo stesso ceppo. Nel frattempo, a seguito di un'esperienza di condizionamento socialmente avversivo (in questo caso il trattamento della CSD) con un ceppo specifico (in questo caso il ceppo del residente, cioè il ceppo CD-1) e quindi, con i suoi tratti caratterizzanti che fungono da stimolo condizionato, lo sviluppo dell'evitamento sociale come misura di una corretta risposta condizionata avversiva si riflette in un indice di interazione sociale <1 con lo stesso ceppo. L'effetto dello stress della CSD è il primo ad essere valutato e a livello generale di gruppo di trattamento (vedere la fase 3.6 del protocollo). In particolare, l'effetto dello stress si riflette nel gruppo di trattamento che ha un indice di interazione sociale <1 con il target sociale CD-1 come misura dello sviluppo dell'evitamento sociale nei confronti del ceppo CD-1. Nel frattempo, i livelli di socialità basale intatti del gruppo di controllo si riflettono nell'avere un indice di interazione sociale ≥1 con lo stesso target sociale. Ciò si traduce in una differenza significativa (p < 0,05) nell'indice di interazione sociale con il target sociale CD-1 tra i due gruppi (Figura 2C).
Identificazione di tre distinti sottogruppi fenotipici all'interno di un singolo gruppo cronicamente socialmente sconfitto mediante il test di rischio-sicurezza sociale
Dopo aver diviso gli animali in base al loro indice di interazione sociale, come spiegato nei passaggi 3.4 e 3.5 del protocollo, una differenza significativa (p < 0,05) nell'indice all'interno di un singolo sottogruppo tra i due obiettivi sociali, sarà trovata solo all'interno del sottogruppo degli evitatori discriminanti (Figura 2D,E). Il sottogruppo degli evitatori discriminanti e il sottogruppo degli evitatori indiscriminati hanno un indice di interazione sociale <1 con l'obiettivo sociale CD-1, una misura dello sviluppo dell'evitamento sociale verso lo stimolo condizionato (ceppo CD-1), riflettendo così lo sviluppo di una corretta risposta condizionata avversiva e di un apprendimento condizionato avversivo di successo. Al contrario, l'indice di interazione sociale (≥1) del sottogruppo dei non-evitanti riflette l'apprendimento condizionato avversivo alterato con lo stesso obiettivo sociale (ceppo CD-1). Nel frattempo, la capacità di discriminazione minaccia-sicurezza si riflette nel sottogruppo degli evitatori discriminanti che hanno un indice di interazione sociale ≥1 con il target sociale 129/Sv come misura dei livelli di socialità intatti verso uno stimolo sicuro/neutro (ceppo 129/Sv). Al contrario, la generalizzazione della risposta avversiva del sottogruppo degli evitatori indiscriminati si riflette nell'avere un indice di interazione sociale <1 con lo stesso obiettivo sociale come misura dell'evitamento sociale e, quindi, una risposta condizionata avversiva verso uno stimolo sicuro/neutro. La percentuale di topi all'interno di ciascun sottogruppo è di circa il 33%; Tuttavia, questo è imprevedibile in quanto alcuni lotti di animali ne hanno più o meno in ogni sottogruppo. Infine, l'assenza di bias preferenziali sociali come potenziale fattore di confusione si riflette negli indici di interazione sociale di ≥1 (cioè p>0,05) con entrambi gli obiettivi sociali all'interno del gruppo di controllo.
Interpretazione dei risultati del test di sicurezza per la minaccia sociale
Le caratteristiche del sottogruppo degli evitatori discriminanti, tra cui l'apprendimento condizionato di successo dei segnali associati alla minaccia e la discriminazione della sicurezza, sono discusse come caratteristiche degli individui resilienti allo stress 16,17,18,19,20,21,22 . Al contrario, le risposte condizionate avversive generalizzate dopo eventi traumatici, come visto dal sottogruppo degli evitatori indiscriminati, sono un sintomo chiave dei disturbi mentali legati allo stress come il disturbo da stress post-traumatico e i disturbi d'ansia 16,17,23,24,25,26 e, quindi, sono caratteristici degli individui suscettibili allo stress. Infine, il sottogruppo dei non-evitanti rappresenta un fenotipo di apprendimento alterato16.
Figura 1: Sequenza temporale schematica. All'arrivo presso la struttura, tutti i topi sono stati sottoposti a una sola casa per 7 giorni, quindi designare per i trattamenti: gruppo trattato con stress CSD o gruppo trattato con controllo manipolato. I trattamenti durano 10 giorni, dopodiché gli animali vengono alloggiati singolarmente per 1 giorno. Allestire le arene per eseguire l'STST (che si svolge dopo la stabulazione singola degli animali di 1 giorno). Inizia con la fase di assuefazione per 6 min. Seguire immediatamente la fase di assuefazione con la fase di test per altri 6 min. Infine, riporta gli animali nelle loro gabbie domestiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Test di sicurezza contro le minacce sociali. (A) Progettazione del test. Il test viene eseguito in un'arena a tre camere divisa in tre parti uguali separate da pareti trasparenti con aperture, che consentono all'animale di interesse (C57BL6/J, nero) di muoversi nel mezzo. In ciascuna delle periferie è posizionato un recinto a rete. Un recinto contiene un nuovo bersaglio sociale del ceppo dei residenti incontrato in precedenza durante il trattamento con CSD (CD-1, bianco); l'altro contiene un nuovo bersaglio sociale di un nuovo ceppo abbinato per età, dimensioni e sesso al nuovo topo del ceppo dei residenti ma di diverso colore della pelliccia (129/Sv, marrone). Entrambi i bersagli sociali sono più vecchi e più grandi dell'animale di interesse. L'animale di interesse viene introdotto al centro dell'arena e gli viene permesso di esplorare l'arena per 6 minuti durante la fase di assuefazione quando i recinti a rete sono vuoti e di nuovo durante la fase di test quando i bersagli sociali vengono posizionati all'interno dei recinti a rete come raffigurato. (B) Indice di interazione sociale. Segna il tempo trascorso ad esplorare i recinti a rete durante la fase di assuefazione quando il naso dell'animale si trova all'interno della zona di interazione (2 cm intorno ai confini dei recinti a rete). Successivamente, assegnare un punteggio al tempo trascorso interagendo con i target sociali durante la fase di test quando il naso si trova all'interno della zona di interazione. Calcola l'indice di interazione sociale come mostrato. (C) Effetto di stress da sconfitta sociale cronica: il gruppo di trattamento ha un indice di interazione sociale <1 con l'obiettivo sociale CD-1 come misura dello sviluppo dell'evitamento sociale verso il ceppo CD-1. Nel frattempo, i livelli di socialità basale intatti del gruppo di controllo si riflettono nell'avere un indice di interazione sociale ≥1 con lo stesso target sociale. Ciò si traduce in una differenza significativa (p < 0,05) nell'indice di interazione sociale con il target sociale CD-1 tra i due gruppi. Risultati presentati come media ± errore standard della media (SEM), n=16 per gruppo, test di Mann-Whitney. (D) Risultati rappresentativi dei test di sicurezza contro la minaccia sociale a seguito di un trattamento di sconfitta sociale cronica. Il gruppo di trattamento è diviso in tre sottogruppi in base agli indici di interazione sociale degli animali con gli obiettivi sociali. I topi con un indice di interazione sociale ≥1 con il bersaglio sociale CD-1 sono definiti non evitanti, i topi con un indice di interazione sociale <1 con entrambi gli obiettivi sociali sono definiti evitatori indiscriminati e i topi con un indice di interazione sociale ≥1 solo con il bersaglio sociale 129/Sv sono definiti evitatori discriminanti. Il gruppo di controllo ha indici simili con entrambi i target sociali. Risultati presentati come media ± SEM, n = 55 per sottogruppo. (E) Mappe termiche rappresentative di ciascun sottogruppo/gruppo durante la fase di prova dell'STST. I colori più scuri indicano più tempo trascorso nell'area. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Criteri di aborto per la procedura di sconfitta sociale cronica. La tabella presenta un totale di quattro famiglie di osservazioni, ciascuna con diverse sotto-osservazioni27. Ogni osservazione ha un punteggio. A seconda della somma del punteggio, vengono indicate le misure da adottare. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Il protocollo comportamentale qui descrive il Social Threat-Safety Test, utilizzato per dividere un singolo gruppo di trattamento post-CSD in tre diversi sottogruppi, che funge da metodo per indagare la biologia sottostante della suscettibilità allo stress e della resilienza e per testare potenziali terapie. Il contesto biologico e i dettagli tecnici devono essere attentamente considerati per guidare un disegno sperimentale approfondito.
Diverse condizioni abitative possono alterare i livelli di socievolezza dell'aggressività, influenzando potenzialmente i risultati ottenuti dal test post-trattamento28,29,30. Tali condizioni includono la stabulazione singola di tutti gli animali all'arrivo e 24 ore prima del test post-trattamento, nonché la stabulazione singola del gruppo di controllo durante i 10 giorni di trattamento. Inoltre, l'effetto dello stress del CSD può essere compromesso se il gruppo di controllo viene accidentalmente sollecitato. Ciò può derivare dall'esposizione del gruppo di controllo agli odori e alle vocalizzazioni indotte dallo stress del gruppo di trattamento durante i 10 giorni di trattamento, nonché del gruppo di controllo che assiste al trattamento31. Pertanto, si consiglia di mantenere il gruppo di controllo e il gruppo di trattamento alloggiati in stanze diverse. Inoltre, a causa del coinvolgimento dell'apprendimento condizionato15, alcuni passaggi sono fondamentali per ottenere risultati di test post-trattamento simili a quelli qui descritti. Ciò include l'esecuzione del trattamento su giovani adulti per 10 giorni e l'esecuzione del test post-trattamento 24 ore dopo il riposo (vedere il passaggio 2.1 del protocollo). L'apprendimento condizionato può essere diverso nei topi più giovani (o più anziani). Allo stesso modo, eseguire il trattamento per più o meno di 10 giorni significa rispettivamente più o meno condizionamento dell'animale. I cambiamenti nella durata del trattamento possono comportare diverse dimensioni del sottogruppo. Inoltre, è consigliabile che all'interno dello stesso esperimento, lo stesso sperimentatore esegua il trattamento e il test post-trattamento su tutti gli animali o vi sia una separazione tra gli sperimentatori che eseguono il trattamento e quelli che eseguono il test post-trattamento che è simile su tutti gli animali. Ciò è dovuto al fatto che il/i sperimentatore/i rappresenta parte del contesto complessivo di condizionamento (trattamento CSD) e test (test post-trattamento di minaccia sociale-sicurezza) per l'animale; Pertanto, tutti gli animali all'interno dello stesso esperimento dovrebbero essere esposti allo stesso contesto per tutta la durata dell'esperimento. Inoltre, il comportamento degli animali durante il test post-trattamento può essere confuso da segnali olfattivi32. La pulizia con etanolo al 5% tra gli animali standardizza i segnali olfattivi. Tuttavia, evitare la pulizia tra le due fasi del test post-trattamento (assuefazione e test) tra lo stesso animale. Questo perché la fase di assuefazione ha in parte lo scopo di familiarizzare l'animale con l'arena in modo che durante la fase di test, il comportamento dell'animale sia principalmente guidato dalla nuova presenza dei nuovi bersagli sociali. Pertanto, la pulizia tra le due fasi può compromettere i segnali olfattivi marcati dall'animale durante la fase di assuefazione, rendendo l'arena meno familiare durante la fase di test del test post-trattamento33. Inoltre, è preferibile disporre di quattro recinti a rete per arena, due dei quali sono attribuiti alla fase di assuefazione (sempre utilizzati vuoti) e due alla fase di test (sempre utilizzati con i bersagli sociali), al fine di estinguere il potenziale odore residuo dei bersagli sociali CD-1 e 129/Sv nei recinti a rete dalla fase di test alla fase di assuefazione. L'eliminazione dell'odore residuo nei recinti a rete è fondamentale perché può influenzare l'esplorazione da parte dell'animale dei recinti a rete durante la fase di assuefazione, modificando i risultati dell'indice di interazione sociale e, quindi, la divisione del gruppo di trattamento in tre sottogruppi33. Allo stesso modo, è consigliabile attribuire obiettivi sociali specifici per il test post-trattamento e mantenerli in condizioni simili quando non sono in uso. Questo perché il coinvolgimento di un bersaglio sociale in altri trattamenti e test può influenzare il comportamento del rispettivo bersaglio nell'involucro della rete durante il test post-trattamento. Ad esempio, l'utilizzo del bersaglio sociale CD-1 in altri esperimenti come residente per il trattamento della CSD può modificare i suoi livelli di aggressività rispetto al 129/Sv quando viene utilizzato nel test post-trattamento di minaccia sociale-sicurezza. Le differenze nei livelli di aggressività possono segnalare segnali diversi all'animale di interesse durante il test post-trattamento, creando un bias preferenziale che non viene attribuito all'apprendimento condizionato dai 10 giorni di trattamento. Pertanto, entrambi i bersagli sociali che hanno esperienze simili prima dell'uso nel test post-trattamento possono aiutare a standardizzare il comportamento e i segnali di entrambi mentre si trovano nel recinto della rete. Un'altra misura per evitare l'implicazione di un pregiudizio preferenziale include l'uso di obiettivi sociali più vecchi e più grandi rispetto all'animale di interesse15, affermando che il segnale principale sono i tratti caratterizzanti del ceppo, non l'età o le dimensioni. A tale scopo, il test post-trattamento utilizza il ceppo 129/Sv per contrastare i ceppi CD-1 e C57BL6/J. Il ceppo 129/Sv ha un colore della pelliccia diverso da entrambi. Sarebbe interessante testare diversi ceppi di diversi colori di pelliccia e vedere come vengono influenzati i risultati nel test post-trattamento15.
La sconfitta sociale cronica è uno dei modelli più robusti per il disturbo da stress post-traumatico, la depressione e altre malattie legate allo stress. Ha un'eccellente validità eziologica-35, predittiva-, discriminativa-, farmacologica- e facciale 8,36. Qui, viene descritto un protocollo CSD modificato nei topi maschi introdotto da van Der Kooji e colleghi che mira a rafforzare la componente psicosociale dello stress indotto10. Il fenotipo dell'evitamento sociale è robusto, affidabile e facilmente verificabile e possiede rilevanza etologica e una forte validità facciale34. A differenza di altri test di interazione sociale9, l'STST consente di valutare simultaneamente lo sviluppo dell'evitamento sociale e la capacità di discriminazione tra minaccia sociale e sicurezza16. I risultati dell'STST sono utilizzati per identificare sottogruppi suscettibili allo stress e resilienti allo stress all'interno di un singolo gruppo di topi cronicamente socialmente sconfitti, il che si allinea con l'evidenza negli esseri umani che caratterizzano gli individui resilienti con discriminazione minaccia-sicurezza e gli individui suscettibili con generalizzazione della risposta avversiva16. Questa classificazione può essere seguita da manipolazioni sperimentali per aiutare a svelare le basi neurali della resilienza e della suscettibilità allo stress in generale e in particolare alla discriminazione minaccia-sicurezza rispetto alla generalizzazione della risposta avversiva16,37. Nonostante decenni di ricerca e alcuni miglioramenti nel trattamento, i disturbi mentali legati allo stress rimangono prevalenti negli esseri umani. Tuttavia, concentrandosi sull'eterogeneità tra individui diversi in risposta allo stesso fattore di stress, c'è un cambiamento di paradigma dal condurre solo ricerche orientate alla malattia al condurre contemporaneamente ricerche orientate alla malattia e alla salute. Questo cambiamento di paradigma potrebbe aiutare a sviluppare nuovi approcci di prevenzione38,39 e a identificare migliori strategie di trattamento mirato.
Un limite del modello è che sono stati studiati solo i maschi. Poiché l'STST si basa sul modello CSD, che è stato sviluppato sulla base del comportamento dei topi maschi in natura40, il test non è stato valutato per la sua compatibilità con i topi femmina. Un test compatibile con topi femmina sarebbe quello che segue un trattamento da stress creato su entrambi i sessi o solo sulle femmine. Sono necessari ulteriori studi per estendere questi risultati riportati dai topi maschi a quelli femmine. Inoltre, i risultati attesi qui riportati provengono da topi giovani adulti. Sarebbe un valore aggiunto per la nostra comprensione sapere come (se) i risultati cambiano utilizzando età diverse. Da notare che uno studio recente ha rilevato che il comportamento di evitamento sociale dopo la CSD è simile tra topi di diversi gruppi di età41. Allo stesso modo, altre variabili da considerare sono la durata del trattamento, se diverso da 10 giorni, e il tempo del test comportamentale, se condotto più di 24 ore dopo il riposo. Nel complesso, il modello perfeziona sostanzialmente i modelli murini di suscettibilità/resilienza allo stress attualmente utilizzati e contribuisce a far progredire i futuri approcci traslazionali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è supportata dal Collaborative Research Center 1193, Subproject Z02, finanziato dalla Fondazione Nazionale Tedesca per la Ricerca (SFB1193, Neurobiologia della Resilienza) e dalla Fondazione Boehringer Ingelheim (sovvenzione al Leibniz Institute for Resilience Research and Individual Phenotyping and High-Resolution Automated Behavioural Analysis). Vorremmo ringraziare il Dr. Konstantin Radyushkin e la Sig.ra Sandra Reichel per la loro assistenza tecnica, nonché la Sig.ra Hanna Kim per il suo supporto in lingua inglese. Le fonti di finanziamento non hanno avuto alcun coinvolgimento nella progettazione del modello; raccolta, analisi e interpretazione dei dati; nella stesura del protocollo; e nella decisione di presentare il protocollo per la pubblicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arenas | Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x 40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors |
| Camera for video recording | Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg |
ace Classic acA1300-60gc |
If using automatic detection program, make sure cameras are compatible |
| Camera objective | KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv |
Part-No. 10504 | |
| Detection program/Timer | Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/ethovision-xt | Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically |
| Housing cages | ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel |
3010010 | Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C |
| Mesh enclosures | Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol) |
| Mesh wall | selfmade | N/A | Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact |
| Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders | Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl |
Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl | CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice |
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