Summary
O teste de segurança contra ameaças sociais permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento de evitação social como uma medida da aprendizagem condicionada aversiva e da capacidade de discriminação de segurança contra ameaças sociais, ambos utilizados para identificar indivíduos suscetíveis e resilientes ao estresse dentro de um único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente.
Abstract
O estresse social é uma das principais causas do desenvolvimento de transtornos mentais. Para aumentar o valor translacional de estudos pré-clínicos, a experiência de estresse social e seu impacto comportamental em camundongos devem ser comparáveis aos humanos. A derrota social crônica (DSC) utiliza um tipo de estresse social envolvendo ataques físicos e ameaças sensoriais para induzir disfunções mentais semelhantes a transtornos afetivos humanos. Para fortalecer o componente psicossocial do DSC, aplicou-se um protocolo de 10 dias de DSC, no qual as agressões físicas diárias são padronizadas para três episódios de 10 segundos seguidos por uma fase sensorial de 24 horas. Após a10ª fase sensorial, o protocolo de DSC é seguido por um ensaio comportamental refinado chamado teste de segurança de ameaça social (STST). Os ensaios comportamentais pós-estresse precisam determinar como e em que medida o estressor social influenciou o comportamento. O STST permite que camundongos machos cronicamente derrotados socialmente interajam com 2 novos indivíduos masculinos (alvos sociais): um alvo social da cepa atacante encontrada durante os dias de DSC e o outro de uma nova cepa. Ambos são apresentados simultaneamente em diferentes compartimentos de uma arena de teste de três câmaras. O teste permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento da evitação social para medir a aprendizagem condicionada aversiva bem-sucedida e a capacidade de discriminação de segurança e ameaça social. O desenvolvimento de evitação social para ambas as cepas reflete uma resposta aversiva generalizada e, portanto, uma medida de suscetibilidade ao estresse. Enquanto isso, o desenvolvimento de evitação social em relação apenas à cepa agressora reflete discriminação ameaça-segurança e, portanto, uma medida de resiliência ao estresse. Finalmente, a ausência de evitação social em relação à tensão agressora reflete aprendizagem condicionada aversiva prejudicada. O protocolo visa refinar os modelos de camundongos atualmente usados de suscetibilidade/resiliência ao estresse, incluindo critérios translacionais, especificamente discriminação de segurança de ameaça e generalização de resposta aversiva, para categorizar um único grupo de animais cronicamente derrotados socialmente em subgrupos resilientes e suscetíveis, eventualmente avançando futuras abordagens translacionais.
Introduction
O estresse é definido como a ruptura da homeostase causada por estímulos físicos ou psicológicos1. O estresse é um importante fator de risco bem conhecido para o desenvolvimento de transtornos mentais, como transtorno de estresse pós-traumático, depressão e ansiedade 2,3. Em particular, o estresse social é considerado um importante fator de risco para o desenvolvimento de transtornos mentais relacionados ao estresse4. Um tipo de estresse social que tem ganhado particular importância nas pesquisas é o estresse de subordinação social5. Os camundongos, assim como os humanos, são capazes de um rico conjunto de comportamentos sociais6, tornando-os adequados para investigações que envolvam estresse social. No ambiente de laboratório, quando camundongos adultos são alojados em grupo, eles estabelecem uma estrutura social que envolve a formação de fileiras7. Nesse sentido, o modelo de colônia foi desenhado para estudar os efeitos de hierarquias sociais naturalmente estabelecidas em grupos mistos de camundongos8. Ao longo dos anos, variações do modelo de colônia foram desenvolvidas para utilizar o estresse de subordinação social, incluindo modelos de grupos do mesmo sexo, o modelo de instabilidade social e o modelo de colônia intrusa. Nos últimos anos, no entanto, uma variante específica conhecida como modelo residente-intruso masculino foi popularizada na literatura, simplificando a complexidade social para dois ratos: um residente e um intruso. O animal de interesse, conhecido como intruso, é colocado na gaiola de um criador maior, mais velho e aposentado, conhecido como morador ou agressor. O morador então ataca fisicamente o intruso como método de confronto, estabelecendo uma hierarquia social em que o morador é dominante e o intruso é subordinado. Quando os confrontos são eventos únicos, eles classificam como "agudos" (o "modelo de derrota social aguda"), enquanto confrontos repetidos que duram vários dias (geralmente 10) são conhecidos como "crônicos" (o "modelo de derrota social crônica"). No modelo de derrota social crônica (DSC), os ataques são intermitentes e tipicamente confinados a um período de 5-10 min9, denominado fase física. Após a fase física, o intruso e o residente são mantidos durante a noite na mesma gaiola, separados ao meio com uma parede de malha, permitindo todas as formas de interação, exceto o contato físico. Essa configuração, conhecida como fase sensorial, induz o estresse por meio do aparecimento contínuo de ameaça em vez do confronto físico direto. Em 2018, van der Kooji e colegas introduziram um tratamento social crônico modificado para se concentrar no componente psicossocial do modelo, padronizando e limitando estritamente a fase física10. O modelo modificado limita as agressões físicas a três episódios de 10 s com diferentes residentes, ocorrendo em intervalos interepisódios de 15 min da fase sensorial. Após o terceiro episódio físico, a fase sensorial dura durante a noite. Esse ciclo se repete por 10 dias consecutivos com novos residentes por episódio. O tratamento modificado aumenta a validade translacional do modelo de derrota social crônica à medida que o dano físico do intruso é minimizado e a variabilidade de desfecho de durações diferenciais de ataques físicos é reduzida.
Uma vez que o modelo de DSC é utilizado para estudar doenças relacionadas ao estresse (por exemplo, depressão, ansiedade, transtorno de estresse pós-traumático), ensaios pós-comportamentais são escolhidos, incluindo, mas não limitado a, ensaios comportamentais de agressividade, memória e anedonia. Nos últimos anos, ensaios comportamentais pós-DSC em camundongos frequentemente avaliam como e em que medida a sociabilidade éafetada9. A sociabilidade é definida como a preferência inata dos ratos em interagir socialmente em vez de evitar socialmente um conespecífico. Uma vez que a sociabilidade está sujeita aos efeitos do estresse, foram estabelecidos ensaios que avaliam apenas o desenvolvimento da evitação social. A evitação social induzida pelo estresse tem relevância translacional por representar um dos principais sintomas comportamentais de ansiedade social e depressão em humanos11. Semelhante aos humanos, nem todos os camundongos desenvolvem evitação social após o tratamento com DSC, sugerindo a presença de individualidade na responsividade ao estresse. Cohen e colaboradores propuseram critérios comportamentais de corte como uma abordagem promissora para o estudo da neurobiologia da individualidade12. A seleção dos animais com base no comportamento resulta na divisão dos grupos, reforçando a base para estudos gene-ambiente. Posteriormente, diferentes subgrupos frequentemente mostram enriquecimento distinto de variantes/modificações genéticas específicas, que por sua vez podem ser investigadas sob diferentes condições ambientais13. Nesse sentido, a individualidade no desenvolvimento da esquiva social foi utilizada para dividir o único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente em dois subgrupos: suscetíveis ao estresse (socialmente evitativos) e resilientes ao estresse (socialmente nãoevitativos9,14). No entanto, a interpretação do fenótipo de esquiva social em camundongos como um comportamento desadaptativo ou adaptativo deve ser considerada no contexto geral do tratamento (aqui DSC) e do ensaio comportamental pós-tratamento. Além disso, o ensaio comportamental de escolha pós-tratamento idealmente avaliaria outras facetas da sociabilidade e não apenas o desenvolvimento da esquiva social. Nosso trabalho recente revelou o envolvimento da aprendizagem condicionada na evitação social induzida porDSC15. Especificamente, a esquiva social induzida pelo DSC é uma resposta condicionada aversiva aos traços caracterizadores da tensão dos residentes, servindo como estímulo condicionado ao estímulo incondicionado, ou seja, os ataques dos residentes. Além disso, dentro do subgrupo socialmente evitativo, alguns indivíduos podem discriminar entre os traços da cepa dos residentes aversivos e os de outras cepas novas seguras, enquanto outros indivíduos mostram evitação social generalizada para ambas as cepas. Propomos aqui um refinado ensaio comportamental pós-DSC: o Social Threat-Safety Test (STST)15. Ao contrário de outros testes de interação social9, o STST permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento da evitação social como uma medida da resposta condicionada aversiva correta (isto é, aprendizagem condicionada bem-sucedida) e da capacidade de discriminação de segurança e ameaça social, ambas utilizadas para identificar indivíduos suscetíveis e resistentes ao estresse dentro de um único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente. A avaliação da discriminação de ameaça social versus generalização de resposta aversiva amplia os critérios translacionais usados para classificar o único grupo de animais cronicamente derrotados socialmente em subgrupos resilientes e suscetíveis.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias relativa aos cuidados e utilização de animais em procedimentos experimentais e foram aprovados pelas autoridades locais (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). A Figura 1 representa uma linha do tempo esquemática.
1. Tratamento
- Animais de interesse: Obter camundongos machos C57BL6/J com 7 semanas de idade e, na chegada, em uma instalação com temperatura e umidade controladas em um ciclo claro-escuro de 12 h (luzes acesas: 8:00; luzes apagadas: 20:00; 23 °C; 38% de umidade) com comida e água ad libitum.
- Derrota social crônica (DSC)
- Grupo de tratamento
- Após 1 semana de habituação, realizar o tratamento do DSC por 10 dias consecutivos usando a cepa CD-1 como cepa do residente (para um protocolo detalhado, consulte a derrota social crônica9 e o tratamento modificado da derrota social crônica10).
- Introduza o mouse C57BL6/J na gaiola do mouse CD-1 e conte 10 s de ataque físico. Repita este episódio três vezes, cada uma com um mouse CD-1 diferente, e separe por intervalos de 15 minutos entre episódios.
- Coloque uma parede de malha entre o mouse C57BL6/J e o mouse CD-1 durante esses intervalos, permitindo apenas o contato sensorial. Após o terceiro episódio, abrigar os camundongos C57BL6/J durante a noite nas gaiolas dos camundongos CD-1, separando ambos por uma parede de malha. Repita por 10 dias.
NOTA: Número de ratos CD-1 = número de ratos C57BL6/J + 1. Se o número de camundongos tratados com C57BL6/J for inferior a 10, um mínimo de 10 camundongos CD-1 ainda é necessário para garantir que todos os dias a última fase sensorial (durando durante a noite) seja com um novo camundongo CD-1 durante os 10 dias de tratamento. - Avalie cuidadosamente o bem-estar físico dos animais ao longo dos 10 dias. Se um animal estiver gravemente ferido, exclua-o da experiência por razões éticas e científicas (mobilidade/atividade durante o teste pós-tratamento). A Tabela 1 fornece uma lista de verificação de bem-estar.
- Grupo controle
- Na chegada, mantenha camundongos da mesma idade nas mesmas condições que o grupo de tratamento.
- Após 1 semana de habituação, introduzir os animais de controle por 90 s em uma gaiola vazia e, em seguida, devolvê-los a gaiolas individuais (unicaseiras) separadas ao meio por paredes de malha idênticas às usadas para o grupo de tratamento. Realize isso diariamente em paralelo aos 10 dias de tratamento.
NOTA: É aconselhável manter o grupo controle e o grupo de tratamento alojados em salas diferentes.
- Grupo de tratamento
- Após a última (10ª) fase sensorial, alojar sozinho todos os camundongos em novas gaiolas em condições semelhantes às descritas na chegada e deixá-los descansar durante a noite.
NOTA: A última fase sensorial deve durar 24 h, então os animais são uni-alojados.
2. Teste pós-tratamento: Teste de ameaça social-segurança (Figura 2)
- Após o tratamento com DSC, todos os camundongos (grupos tratados e controle) em novas gaiolas em condições semelhantes às descritas na chegada e deixá-los em repouso durante a noite.
- Durante as horas da manhã (8:00-13:30), limpe a arena de três câmaras (retângulo em forma com tamanho total de 60 cm x 40 cm, feito de paredes de acrílico transparente e piso liso) com 5% de etanol e coloque-a sob a câmera com condições de luz de 37 lux. Certifique-se de que toda a arena esteja visível.
- Limpe os compartimentos de malha (em forma de gaiola feitos de metal ou acrílico) com etanol a 5% e posicione-os como mostrado nos cantos da Figura 1A.
- Fase de habituação: Introduza o animal de interesse no centro da arena, permita a exploração por 6 minutos e, em seguida, devolva-o à sua gaiola de origem.
- Coloque o novo alvo social (desconhecido) CD-1 (conespecífico) sob um compartimento de malha e o novo alvo social 129/Sv sob o outro compartimento de malha.
NOTA: É importante usar um conespecífico 129/Sv desconhecido para evitar um viés de familiaridade. Preferencialmente ter 4 recintos de malha por arena: 2 atribuídos à fase de habituação e 2 à fase de testes. - Fase de testes: Reintroduzir imediatamente o animal de interesse no centro da arena e permitir a exploração por 6 min.
- Devolva todos os animais para sua casa. Limpar a arena e os recintos de malha com etanol 5% entre os testes de diferentes animais, mas nunca durante a observação do mesmo animal, ou seja, nunca entre as fases de habituação e teste.
- Alternar a localização dos recintos de malha entre os animais (e nunca entre as duas fases dentro do mesmo animal) para controlar possíveis vieses preferenciais de localização.
3. Pontuação e análise
OBS: Apenas o teste pós-tratamento de estresse, ou seja, o STST é pontuado e analisado (e não o tratamento de estresse do DSC).
- Defina a zona de interação como 2 cm ao redor dos limites dos compartimentos de malha.
- Pontuar o tempo gasto explorando os recintos de malha durante a fase de habituação, quando o nariz do animal estiver dentro da zona de interação.
- Pontuar o tempo gasto interagindo com os alvos sociais durante a fase de teste quando o nariz do animal está dentro da zona de interação.
NOTA: A detecção pode ser feita manualmente (usando um temporizador ou software para pontuação manual) ou automaticamente. Independentemente do método de detecção, pegue o ponto do nariz para medidas de exploração e interação social e o ponto central do corpo para medidas relacionadas à atividade (por exemplo, distância deslocada). - Calcule o índice de interação social da seguinte forma: tempo gasto explorando cada alvo social durante a fase de teste / tempo médio gasto explorando os dois compartimentos de malha vazios durante a fase de habituação (Figura 2B).
- Divida o grupo de tratamento em 3 subgrupos da seguinte forma: Animais com índice de interação social ≥1 com o alvo social CD-1 são não evitadores, animais com índice de interação social <1 com ambos os alvos sociais são evitadores indiscriminados, animais com índice de interação social ≥1 apenas com o alvo social 129/Sv são evitadores discriminatórios (Figura 2C-D).
NOTA: O número de animais dentro de cada um dos três subgrupos pode diferir entre diferentes lotes de animais (cerca de 1/3 de todos os animais que se submetem ao tratamento com DSC exibirá as características fenotípicas de um dos três subgrupos). - Avaliar o efeito do estresse analisando estatisticamente o índice de interação social com o CD-1 alvo social entre os grupos de tratamento e controle (teste t paramétrico para duas amostras ou teste não paramétrico de Mann-Whitney).
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Representative Results
Índice de interação social como medida de resposta condicionada aversiva
Um índice de interação social ≥1 reflete maior interação social com o respectivo alvo social em comparação com a exploração dos recintos de malha vazios. Em condições basais, aqui definidas como não tendo experiência apetitiva ou aversiva com os traços caracterizadores de uma cepa específica (aqui tanto alvos sociais para o grupo controle quanto o alvo social 129/Sv para o grupo de tratamento), níveis de sociabilidade intactos são refletidos em um índice de interação social ≥1 com essa mesma cepa. Enquanto isso, após uma experiência de condicionamento socialmente aversivo (aqui tratamento de DSC) com uma cepa específica (aqui a cepa do residente, ou seja, a cepa CD-1) e, portanto, com seus traços caracterizadores servindo como um estímulo condicionado, o desenvolvimento da evitação social como medida de uma resposta condicionada aversiva correta se reflete em um índice de interação social <1 com essa mesma cepa. O efeito do stress da DSC é o primeiro a ser avaliado e a nível global do grupo de tratamento (ver passo 3.6 do protocolo). Especificamente, o efeito do estresse é refletido no grupo de tratamento ter um índice de interação social <1 com a meta social CD-1 como uma medida do desenvolvimento de evitação social em relação à cepa CD-1. Enquanto isso, os níveis basais de sociabilidade intactos do grupo controle se refletem em ter um índice de interação social ≥1 com o mesmo alvo social. Isso resulta em uma diferença significativa (p < 0,05) no índice de interação social com o alvo social CD-1 entre os dois grupos (Figura 2C).
Identificação de três subgrupos fenotípicos distintos dentro de um único grupo cronicamente derrotado socialmente pelo teste de ameaça social-segurança
Após a divisão dos animais com base no índice de interação social, conforme explicado nas etapas 3.4 e 3.5 do protocolo, uma diferença significativa (p < 0,05) no índice dentro de um único subgrupo entre os dois alvos sociais, só será encontrada dentro do subgrupo de evitadores de discriminação (Figura 2D,E). O subgrupo de evitadores discriminadores e o subgrupo de evitadores indiscriminados têm um índice de interação social <1 com o alvo social CD-1, uma medida do desenvolvimento da evitação social em direção ao estímulo condicionado (tensão CD-1), refletindo assim o desenvolvimento de uma resposta condicionada aversiva correta e de aprendizagem condicionada aversiva bem-sucedida. Em contraste, o índice de interação social (≥1) do subgrupo de não evitadores reflete a aprendizagem condicionada aversiva prejudicada com o mesmo alvo social (cepa CD-1). Enquanto isso, a capacidade de discriminação ameaça-segurança é refletida no subgrupo de evitadores de discriminação ter um índice de interação social ≥1 com o alvo social 129/Sv como uma medida dos níveis de sociabilidade intactos em direção a um estímulo seguro/neutro (cepa 129/Sv). Em contraste, a generalização da resposta aversiva do subgrupo evitadores indiscriminados reflete-se em ter um índice de interação social <1 com o mesmo alvo social como medida de evitação social e, portanto, uma resposta condicionada aversiva em direção a um estímulo seguro/neutro. A porcentagem de camundongos dentro de cada subgrupo é de cerca de 33%; no entanto, isso é imprevisível, pois alguns lotes de animais têm mais ou menos em cada subgrupo. Finalmente, a ausência de viés de preferência social como potencial fator de confusão reflete-se em índices de interação social de ≥1 (i.e., p>0,05) com ambos os alvos sociais dentro do grupo controle.
Interpretação dos resultados dos testes de ameaça social-segurança
As características do subgrupo de evitadores de discriminação, incluindo o aprendizado condicionado bem-sucedido de pistas associadas à ameaça e a discriminação ameaça-segurança, são discutidas como características de indivíduos resilientes ao estresse 16,17,18,19,20,21,22 . Em contraste, respostas condicionadas aversivas generalizadas após eventos traumáticos, como visto pelo subgrupo Evitadores indiscriminados, são um sintoma-chave de transtornos mentais relacionados ao estresse, como transtorno de estresse pós-traumático e transtornos de ansiedade 16,17,23,24,25,26 e, portanto, são características de indivíduos suscetíveis ao estresse. Finalmente, o subgrupo não evitadores representa um fenótipo de aprendizagem prejudicada16.
Figura 1: Linha do tempo esquemática. Ao chegar à instalação, hospede sozinho todos os camundongos por 7 dias e designe para os tratamentos: grupo tratado com estresse CSD ou grupo tratado controle manipulado. Os tratamentos duram 10 dias, após os quais os animais são alojados individualmente por 1 dia. Montar as arenas para realizar o STST (que ocorre após o alojamento único dos animais por 1 dia). Comece com a fase de habituação por 6 min. Siga a fase de habituação imediatamente com a fase de teste por mais 6 min. Por fim, devolva os animais para suas gaiolas domésticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Teste de segurança contra ameaças sociais. (A) Projeto de ensaio. O teste é realizado em uma arena de três câmaras divididas em três partes iguais separadas por paredes transparentes com aberturas, permitindo que o animal de interesse (C57BL6/J, preto) se mova no meio. Em cada uma das periferias, é colocado um recinto de malha. Um recinto contém um novo alvo social da cepa dos residentes encontrada mais cedo durante o tratamento do DSC (CD-1, branco); o outro contém um novo alvo social de uma nova cepa combinada em idade, tamanho e sexo com o novo rato da cepa dos residentes, mas de cor de pele diferente (129/Sv, marrom). Ambos os alvos sociais são mais antigos e maiores do que o animal de interesse. O animal de interesse é introduzido no meio da arena e é autorizado a explorar a arena por 6 min durante a fase de habituação, quando os recintos de malha estão vazios, e novamente durante a fase de teste, quando os alvos sociais são colocados dentro dos recintos de malha, conforme descrito. (B) Índice de interação social. Pontuar o tempo gasto explorando os recintos de malha durante a fase de habituação quando o nariz do animal estiver dentro da zona de interação (2 cm ao redor dos limites dos recintos de malha). Posteriormente, pontuar o tempo gasto interagindo com os alvos sociais durante a fase de teste quando o nariz estiver dentro da zona de interação. Calcule o índice de interação social conforme mostrado. (C) Efeito de estresse social crônico: O grupo de tratamento tem um índice de interação social <1 com o alvo social CD-1 como uma medida do desenvolvimento de evitação social em relação à cepa CD-1. Enquanto isso, os níveis basais de sociabilidade intactos do grupo controle se refletem em ter um índice de interação social ≥1 com o mesmo alvo social. Isso resulta em uma diferença significativa (p < 0,05) no índice de interação social com o alvo social CD-1 entre os dois grupos. Resultados apresentados como média ± erro padrão da média (EPM), n=16 por grupo, teste de Mann-Whitney. (D) Resultados representativos do teste de segurança de ameaça social após tratamento crônico de derrota social. O grupo de tratamento é dividido em três subgrupos com base nos índices de interação social dos animais com os alvos sociais. Camundongos com um índice de interação social ≥1 com o alvo social CD-1 são denominados não-evitadores, camundongos com um índice de interação social <1 com ambos os alvos sociais são denominados evitadores indiscriminados, e camundongos com um índice de interação social ≥1 apenas com o alvo social 129/Sv são denominados evitadores-discriminadores. O grupo controle apresenta índices semelhantes com ambos os alvos sociais. Resultados apresentados como média ± EPM, n = 55 por sub/grupo. (E) Mapas de calor representativos de cada sub/grupo durante a fase de ensaio do STST. Cores mais escuras indicam mais tempo gasto na área. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Critérios de abortamento para procedimento de derrota social crônica. A tabela apresenta um total de quatro famílias de observações, cada uma com várias sub-observações27. Cada observação tem uma pontuação. Dependendo da soma da pontuação, medidas a serem tomadas são indicadas. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
O protocolo comportamental aqui descreve o Teste de Segurança de Ameaça Social, usado para dividir um único grupo de tratamento pós-DSC em três subgrupos diferentes, servindo como um método para investigar a biologia subjacente da suscetibilidade ao estresse e resiliência e testar terapias potenciais. O contexto biológico e os detalhes técnicos precisam ser cuidadosamente considerados para orientar um planejamento experimental completo.
Diferentes condições de moradia podem alterar os níveis de sociabilidade da agressão, potencialmente influenciando os resultados obtidos no teste pós-tratamento28,29,30. Tais condições incluem alojamento único de todos os animais na chegada e 24 h antes do teste pós-tratamento, bem como alojamento único do grupo controle durante os 10 dias de tratamento. Além disso, o efeito do estresse do DSC pode ser comprometido se o grupo controle for acidentalmente estressado. Isso pode resultar da exposição do grupo controle a odores e vocalizações induzidos por estresse do grupo de tratamento durante os 10 dias de tratamento, bem como do grupo controle testemunhando o tratamento31. Assim, é aconselhável manter o grupo controle e o grupo de tratamento alojados em salas diferentes. Além disso, devido ao envolvimento da aprendizagem condicionada15, algumas etapas são fundamentais para a obtenção de resultados de testes pós-tratamento semelhantes aos aqui descritos. Isso inclui a realização do tratamento em adultos jovens por 10 dias, bem como a realização do teste pós-tratamento 24 h após o repouso (ver etapa 2.1 do protocolo). A aprendizagem condicionada pode ser diferente em ratos mais jovens (ou mais velhos). Da mesma forma, realizar o tratamento por mais ou menos de 10 dias significa mais ou menos condicionamento do animal, respectivamente. Mudanças na duração do tratamento podem resultar em diferentes tamanhos de subgrupos. Além disso, é aconselhável que, dentro de um mesmo experimento, ou o mesmo experimentador realize o tratamento e o teste pós-tratamento em todos os animais ou haja uma separação entre os experimentadores que realizam o tratamento e aqueles que realizam o teste pós-tratamento que seja semelhante em todos os animais. Isso ocorre porque o(s) experimentador(es) representa(m) parte do contexto geral de condicionamento (tratamento de DSC) e teste (teste pós-tratamento de ameaça social-segurança) para o animal; Assim, todos os animais dentro de um mesmo experimento devem ser expostos ao mesmo contexto durante todo o experimento. Além disso, o comportamento dos animais durante o teste pós-tratamento pode ser confundido por sinais de odor32. A limpeza com etanol a 5% entre os animais padroniza os sinais de odor. No entanto, evite a limpeza entre as duas fases do teste pós-tratamento (habituação e teste) entre o mesmo animal. Isso ocorre porque a fase de habituação é parcialmente destinada a familiarizar o animal com a arena, de modo que, durante a fase de teste, o comportamento do animal é impulsionado principalmente pela nova presença dos novos alvos sociais. Assim, a limpeza entre as duas fases pode comprometer os sinais de odor marcados pelo animal durante a fase de habituação, tornando a arena menos familiar durante a fase de teste do teste pós-tratamento33. Além disso, é preferível ter quatro recintos de malha por arena, dois dos quais são atribuídos à fase de habituação (sempre usados vazios) e dois à fase de teste (sempre usados com os alvos sociais), a fim de extinguir o cheiro residual potencial dos alvos sociais CD-1 e 129/Sv nos recintos de malha desde a fase de teste até a fase de habituação. A eliminação do odor residual nos recintos de malha é crítica, pois pode influenciar a exploração dos recintos de tela pelo animal durante a fase de habituação, alterando os resultados do índice de interação social e, assim, a divisão do grupo de tratamento em três subgrupos33. Da mesma forma, é aconselhável atribuir metas sociais específicas para o teste pós-tratamento e mantê-las em condições semelhantes quando não estiverem em uso. Isso porque envolver um alvo social em outros tratamentos e testes pode influenciar o comportamento do respectivo alvo no recinto de tela durante o teste pós-tratamento. Por exemplo, o uso do alvo social CD-1 em outros experimentos como residente para o tratamento de DSC pode alterar seus níveis de agressividade em relação ao 129/Sv quando usado no teste de ameaça social e segurança pós-tratamento. Diferenças nos níveis de agressão podem sinalizar pistas diferentes para o animal de interesse durante o teste pós-tratamento, criando um viés preferencial que não é atribuído ao aprendizado condicionado a partir dos 10 dias de tratamento. Assim, ambos os alvos sociais que têm experiências semelhantes antes do uso no teste pós-tratamento podem ajudar a padronizar o comportamento e as pistas de ambos enquanto estão no recinto da tela. Outra medida para evitar a implicação de um viés preferencial inclui o uso de alvos sociais mais antigos e maiores do que o animal de interesse15, afirmando a pista principal como os traços caracterizadores da cepa, não a idade ou tamanho. Para isso, o teste pós-tratamento emprega a cepa 129/Sv para contrastar as cepas CD-1 e C57BL6/J. A variedade 129/Sv tem uma cor de pele diferente de ambas. Seria interessante testar diferentes cepas de diferentes cores de pele e ver como os resultados no teste pós-tratamento são influenciados15.
A Derrota Social Crônica é um dos modelos mais robustos para transtorno de estresse pós-traumático, depressão e outras doenças relacionadas ao estresse34. Apresenta excelente validade etiológica35, preditiva, discriminativa, farmacológica e deface8,36. Aqui, um protocolo modificado de DSC em camundongos machos introduzido por van Der Kooji e colaboradores que visa fortalecer o componente psicossocial do estresse induzido é descrito10. O fenótipo de evitação social é robusto, confiável, facilmente testável, possui relevância etológica e forte validade facial34. Ao contrário de outros testes de interação social9, o STST permite avaliar simultaneamente o desenvolvimento de evitação social e a capacidade de discriminação de ameaça sociale segurança 16. Os resultados do STST são utilizados para identificar subgrupos suscetíveis e resistentes ao estresse dentro de um único grupo de camundongos cronicamente derrotados socialmente, o que se alinha com as evidências em humanos caracterizando indivíduos resilientes com discriminação ameaça-segurança e indivíduos suscetíveis com generalização de resposta aversiva16. Essa classificação pode ser seguida por manipulações experimentais para ajudar a desvendar a base neural da resiliência e suscetibilidade ao estresse em geral e específica à discriminação ameaça-segurança versus generalização da resposta aversiva16,37. Apesar de décadas de pesquisa e certas melhorias no tratamento, os transtornos mentais relacionados ao estresse permanecem prevalentes em humanos. No entanto, ao focar na heterogeneidade entre diferentes indivíduos em resposta ao mesmo estressor, há uma mudança de paradigma da condução de pesquisa orientada apenas para a doença para a condução simultânea de pesquisas orientadas para a doença e para a saúde. Essa mudança de paradigma pode ajudar a desenvolver novas abordagens de prevenção38,39 e identificar melhores estratégias de tratamento direcionadas.
Uma limitação do modelo é que apenas o sexo masculino foi investigado. Como o STST é baseado no modelo CSD, que foi desenvolvido com base no comportamento de camundongos machos na natureza40, o teste não foi avaliado quanto à sua compatibilidade com camundongos fêmeas. Um teste compatível com camundongos fêmeas seria aquele que segue um tratamento de estresse criado em ambos os sexos ou apenas em fêmeas. Mais estudos são necessários para estender esses achados relatados de camundongos machos para fêmeas. Além disso, os resultados esperados aqui relatados são de camundongos adultos jovens. Acrescentaria ao nosso entendimento saber como (se) os achados mudam usando diferentes idades. É importante ressaltar que um estudo recente descobriu que o comportamento de evitação social após DSC é semelhante entre camundongos de diferentes faixas etárias41. Da mesma forma, outras variáveis a serem consideradas são a duração do tratamento, se diferente de 10 dias, e o tempo de ensaio comportamental, se realizado mais de 24 h após o repouso. Em geral, o modelo refina substancialmente os modelos de suscetibilidade/resiliência ao estresse atualmente usados em camundongos e contribui para o avanço de futuras abordagens translacionais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa é apoiada pelo Centro de Pesquisa Colaborativa 1193, Subprojeto Z02, financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Alemanha (SFB1193, Neurobiologia da Resiliência) e pela Fundação Boehringer Ingelheim (concessão ao Instituto Leibniz de Pesquisa em Resiliência e Fenotipagem Individual e Análise Comportamental Automatizada de Alta Resolução). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Konstantin Radyushkin e à Sra. Sandra Reichel por sua assistência técnica, bem como à Sra. Hanna Kim por seu suporte em inglês. As fontes de financiamento não tiveram envolvimento no desenho do modelo; coleta, análise e interpretação dos dados; na redação do protocolo; e na decisão de submeter o protocolo para publicação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arenas | Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x 40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors |
| Camera for video recording | Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg |
ace Classic acA1300-60gc |
If using automatic detection program, make sure cameras are compatible |
| Camera objective | KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv |
Part-No. 10504 | |
| Detection program/Timer | Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/ethovision-xt | Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically |
| Housing cages | ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel |
3010010 | Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C |
| Mesh enclosures | Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol) |
| Mesh wall | selfmade | N/A | Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact |
| Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders | Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl |
Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl | CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice |
References
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