Summary
Der soziale Bedrohungs-Sicherheits-Test ermöglicht eine gleichzeitige Bewertung der Entwicklung sozialer Vermeidung als Maß für aversives konditioniertes Lernen und soziale Bedrohungs-Sicherheits-Unterscheidungsfähigkeit, die beide verwendet werden, um stressanfällige und stressresistente Individuen innerhalb einer einzigen Gruppe von chronisch sozial besiegten männlichen Mäusen zu identifizieren.
Abstract
Sozialer Stress ist eine der Hauptursachen für die Entstehung psychischer Störungen. Um den translationalen Wert präklinischer Studien zu erhöhen, sollten soziale Stresserfahrungen und ihre Auswirkungen auf das Verhalten von Mäusen mit denen des Menschen vergleichbar sein. Chronische soziale Niederlagen (CSD) nutzen eine Art von sozialem Stress, der körperliche Angriffe und sensorische Bedrohungen beinhaltet, um psychische Funktionsstörungen hervorzurufen, die menschlichen affektiven Störungen ähneln. Um die psychosoziale Komponente der CSD zu stärken, wurde ein 10-tägiges CSD-Protokoll angewendet, bei dem die täglichen körperlichen Attacken auf drei 10-Sekunden-Episoden standardisiert werden, gefolgt von einer 24-stündigen sensorischen Phase. Nach der 10. sensorischen Phase folgt auf das CSD-Protokoll ein verfeinerter Verhaltenstest, der als Social Threat-Safety Test (STST) bezeichnet wird. Post-Stress-Verhaltenstests müssen bestimmen, wie und in welchem Ausmaß der soziale Stressor das Verhalten beeinflusst hat. Der STST ermöglicht es chronisch sozial besiegten männlichen Mäusen, mit 2 neuen männlichen Individuen (sozialen Zielen) zu interagieren: einem sozialen Ziel aus dem angreifenden Stamm, der während der CSD-Tage aufgetreten ist, und dem anderen aus einem neuartigen Stamm. Beide werden gleichzeitig in verschiedenen Kammern einer dreikammerigen Testarena präsentiert. Der Test ermöglicht eine gleichzeitige Beurteilung der Entwicklung sozialer Vermeidung, um erfolgreiches aversives konditioniertes Lernen und die Fähigkeit zur Unterscheidung sozialer Bedrohungen und Sicherheit zu messen. Die Entwicklung der sozialen Vermeidung gegenüber beiden Stämmen spiegelt eine generalisierte aversive Reaktion und damit eine Messung der Stressanfälligkeit wider. Währenddessen spiegelt die Entwicklung der sozialen Vermeidung gegenüber dem angreifenden Stamm eine Bedrohungs-Sicherheits-Diskriminierung und damit ein Maß für die Stressresilienz wider. Schließlich spiegelt das Fehlen einer sozialen Vermeidung gegenüber dem angreifenden Stamm ein beeinträchtigtes aversives konditioniertes Lernen wider. Das Protokoll zielt darauf ab, die derzeit verwendeten Mausmodelle der Stressanfälligkeit/Resilienz zu verfeinern, indem translationale Kriterien, insbesondere Bedrohungs-Sicherheits-Diskriminierung und aversive Reaktionsgeneralisierung, einbezogen werden, um eine einzelne Gruppe von chronisch sozial besiegten Tieren in resiliente und anfällige Untergruppen zu kategorisieren und schließlich zukünftige translationale Ansätze voranzutreiben.
Introduction
Stress ist definiert als die Störung der Homöostase durch physische oder psychische Reize1. Stress ist ein bekannter Hauptrisikofaktor für die Entwicklung psychischer Störungen wie posttraumatische Belastungsstörungen, Depressionen und Angstzustände 2,3. Insbesondere sozialer Stress gilt als wesentlicher Risikofaktor für die Entstehung stressbedingter psychischer Störungen4. Eine Art von sozialem Stress, der in der Forschung besonders an Bedeutung gewonnen hat, ist der soziale Unterordnungsstress5. Mäuse sind wie Menschen zu einem reichhaltigen Sozialverhalten fähig6, was sie für Untersuchungen mit sozialem Stress geeignet macht. Wenn erwachsene Mäuse im Labor in Gruppen untergebracht werden, etablieren sie eine soziale Struktur, die die Bildung von Rängen7 beinhaltet. Dementsprechend wurde das Koloniemodell entwickelt, um die Auswirkungen von natürlich etablierten sozialen Hierarchien in gemischtgeschlechtlichen Gruppen von Mäusen zu untersuchen8. Im Laufe der Jahre wurden Variationen des Koloniemodells entwickelt, um sozialen Unterordnungsstress zu nutzen, darunter gleichgeschlechtliche Gruppenmodelle, das Modell der sozialen Instabilität und das Eindringlingskoloniemodell. In den letzten Jahren wurde jedoch eine bestimmte Variante, die als männliches Bewohner-Eindringlings-Modell bekannt ist, in der Literatur populär gemacht, da sie die soziale Komplexität auf zwei Mäuse vereinfacht: einen Bewohner und einen Eindringling. Das Tier von Interesse, bekannt als Eindringling, wird in den Käfig eines größeren, älteren und pensionierten Züchters gesetzt, der als Bewohner oder Aggressor bekannt ist. Der Bewohner greift den Eindringling dann als Konfrontationsmethode körperlich an und etabliert eine soziale Hierarchie, in der der Bewohner dominant und der Eindringling untergeordnet ist. Wenn es sich bei Konfrontationen um einmalige Ereignisse handelt, werden sie als "akut" klassifiziert (das "akute soziale Niederlagenmodell"), während wiederholte Konfrontationen, die sich über mehrere Tage (in der Regel 10) erstrecken, als "chronisch" bezeichnet werden (das "chronische soziale Niederlagenmodell"). Im Modell der chronischen sozialen Niederlage (CSD) sind die Attacken intermittent und in der Regel auf einen Zeitraum von 5-10 Minuten9 beschränkt, der als körperliche Phase bezeichnet wird. Nach der physischen Phase werden der Eindringling und der Bewohner über Nacht im selben Käfig gehalten, der durch eine Netzwand in zwei Hälften getrennt ist, so dass alle Formen der Interaktion außer Körperkontakt möglich sind. Diese Konfiguration, die als sensorische Phase bezeichnet wird, induziert Stress durch das kontinuierliche Auftreten von Bedrohung anstelle einer direkten körperlichen Konfrontation. Im Jahr 2018 führten van der Kooji und Kollegen eine modifizierte Behandlung chronischer sozialer Niederlagen ein, um sich auf die psychosoziale Komponente des Modells zu konzentrieren, indem die körperliche Phase standardisiert und streng begrenztwird 10. Das modifizierte Modell begrenzt die körperlichen Angriffe auf drei 10-Sekunden-Episoden mit verschiedenen Bewohnern, die in 15-minütigen Intervallen zwischen den Episoden der sensorischen Phase auftreten. Nach der dritten körperlichen Episode dauert die sensorische Phase über Nacht. Dieser Zyklus wiederholt sich an 10 aufeinanderfolgenden Tagen mit neuen Bewohnern pro Episode. Die modifizierte Behandlung erhöht die translationale Validität des Modells der chronischen sozialen Niederlage, da der physische Schaden des Eindringlings minimiert wird und die Ergebnisvariabilität aufgrund der unterschiedlichen Dauer der körperlichen Angriffe reduziert wird.
Da das CSD-Modell zur Untersuchung stressbedingter Krankheiten (z. B. Depressionen, Angstzustände, posttraumatische Belastungsstörungen) verwendet wird, werden post-behaviorale Assays gewählt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Verhaltensassays zu Aggression, Gedächtnis und Anhedonie. In den letzten Jahren wurde in Post-CSD-Verhaltenstests an Mäusen häufig untersucht, wie und in welchem Ausmaß die Geselligkeit beeinträchtigt wird9. Geselligkeit ist definiert als die angeborene Vorliebe von Mäusen, sozial zu interagieren, anstatt einen Artgenossen sozial zu meiden. Da die Geselligkeit Stresseffekten unterliegt, wurden Assays etabliert, die ausschließlich die Entwicklung sozialer Vermeidung erfassen. Stressinduzierte soziale Vermeidung hat eine translationale Relevanz, da sie eines der Hauptverhaltenssymptome von sozialer Angst und Depression beim Menschen darstellt11. Ähnlich wie beim Menschen entwickeln nicht alle Mäuse nach einer CSD-Behandlung eine soziale Vermeidung, was auf das Vorhandensein von Individualität in der Stressreaktion hindeutet. Cohen und Kollegen haben Cut-off-Verhaltenskriterien als vielversprechenden Ansatz für die Untersuchung der Neurobiologie der Individualität vorgeschlagen12. Die Selektion der Tiere auf der Grundlage des Verhaltens führt zu einer Gruppeneinteilung, was die Grundlage für Gen-Umwelt-Studien unterstreicht. In der Folge zeigen verschiedene Untergruppen oft eine deutliche Anreicherung spezifischer genetischer Varianten/Modifikationen, die wiederum unter verschiedenen Umweltbedingungen untersucht werden können13. Dementsprechend wurde die Individualität in der Entwicklung der sozialen Vermeidung genutzt, um die einzelne Gruppe der chronisch sozial besiegten männlichen Mäuse in zwei Untergruppen zu unterteilen: stressanfällig (sozial vermeidend) und stressresilient (sozial nicht vermeidend 9,14). Die Interpretation des Phänotyps der sozialen Vermeidung bei Mäusen als maladaptives oder adaptives Verhalten sollte jedoch sowohl im Gesamtkontext der Behandlung (hier CSD) als auch des Verhaltenstests nach der Behandlung betrachtet werden. Darüber hinaus würde der Verhaltenstest nach der Behandlung idealerweise andere Facetten der Geselligkeit und nicht nur die Entwicklung sozialer Vermeidung bewerten. Unsere jüngsten Arbeiten zeigten die Beteiligung von konditioniertem Lernen an CSD-induzierter sozialer Vermeidung15. Konkret handelt es sich bei der CSD-induzierten sozialen Vermeidung um eine aversive konditionierte Reaktion auf die charakterisierenden Merkmale des Bewohnerstamms, die als konditionierter Stimulus für den unkonditionierten Stimulus dienen, nämlich die Angriffe der Bewohner. Darüber hinaus können einige Individuen innerhalb der sozial vermeidenden Untergruppe zwischen den Merkmalen des aversiven Residentenstamms und denen anderer sicherer neuer Stämme unterscheiden, während andere Individuen eine generalisierte soziale Vermeidung beider Stämme zeigen. Wir schlagen hier einen verfeinerten Verhaltenstest nach dem CSD vor: den Social Threat-Safety Test (STST)15. Im Gegensatz zu anderen sozialen Interaktionstests9 ermöglicht der STST eine gleichzeitige Bewertung der Entwicklung sozialer Vermeidung als Messung der korrekten aversiven konditionierten Reaktion (d. h. des erfolgreichen konditionierten Lernens) und der Fähigkeit zur Unterscheidung sozialer Bedrohungen und Sicherheit, die beide verwendet werden, um stressanfällige und stressresistente Individuen innerhalb einer einzigen Gruppe von chronisch sozial besiegten männlichen Mäusen zu identifizieren. Die Bewertung der sozialen Bedrohungs-Sicherheits-Diskriminierung im Vergleich zur aversiven Verallgemeinerung erweitert die translationalen Kriterien, die zur Klassifizierung der einzelnen Gruppe chronisch sozial besiegter Tiere in widerstandsfähige und empfängliche Untergruppen verwendet werden.
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Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften über die Pflege und Verwendung von Tieren für Versuchsverfahren durchgeführt und vom Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz genehmigt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Zeitleiste.
1. Behandlung
- Tiere von Interesse: Besorgen Sie männliche C57BL6/J-Mäuse im Alter von 7 Wochen und bei der Ankunft in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Licht an: 8:00 Uhr; Licht aus: 20:00 Uhr; 23 °C; 38 % Luftfeuchtigkeit) mit Futter und Wasser nach Belieben.
- Chronische soziale Niederlage (CSD)
- Behandlungsgruppe
- Führen Sie nach 1 Woche der Gewöhnung an 10 aufeinanderfolgenden Tagen eine CSD-Behandlung mit dem CD-1-Stamm als Stamm des Bewohners durch (für ein detailliertes Protokoll siehe chronische soziale Niederlage9 und die modifizierte Behandlung chronischer sozialer Niederlagen10).
- Setze die C57BL6/J-Maus in den Käfig der CD-1-Maus ein und zähle 10 Sekunden physischen Angriff. Wiederholen Sie diese Episode dreimal, jeweils mit einer anderen CD-1-Maus, und trennen Sie sie in 15-minütigen Abständen zwischen den Episoden.
- Platzieren Sie während dieser Intervalle eine Netzwand zwischen der C57BL6/J-Maus und der CD-1-Maus, die nur sensorischen Kontakt zulässt. Nach der dritten Episode werden die C57BL6/J-Mäuse über Nacht in den Käfigen der CD-1-Mäuse untergebracht, wobei beide durch eine Netzwand getrennt sind. Wiederholen Sie dies 10 Tage lang.
HINWEIS: CD-1-Mausnummer = C57BL6/J-Mausnummer + 1. Wenn die Anzahl der mit C57BL6/J behandelten Mäuse unter 10 liegt, sind immer noch mindestens 10 CD-1-Mäuse erforderlich, um sicherzustellen, dass jeden Tag die letzte sensorische Phase (die über Nacht dauert) mit einer neuen CD-1-Maus während der 10-tägigen Behandlung stattfindet. - Beurteilen Sie sorgfältig das körperliche Wohlbefinden der Tiere während der 10 Tage. Wenn ein Tier schwer verwundet ist, schließen Sie es aus ethischen und wissenschaftlichen Gründen (Mobilität/Aktivität während des Nachbehandlungstests) vom Versuch aus. Tabelle 1 enthält eine Checkliste für das Wohlbefinden.
- Kontrollgruppe
- Halten Sie Mäuse gleichen Alters bei der Ankunft unter den gleichen Bedingungen wie die Behandlungsgruppe.
- Nach 1 Woche der Gewöhnung werden die Kontrolltiere für 90 Sekunden in einen leeren Käfig gesetzt und dann in Einzelkäfige (Einzelkäfige) zurückgebracht, die durch Netzwände in zwei Hälften getrennt sind, die mit denen der Behandlungsgruppe identisch sind. Führen Sie dies täglich parallel zu den 10 Behandlungstagen durch.
HINWEIS: Es ist ratsam, die Kontrollgruppe und die Behandlungsgruppe in verschiedenen Räumen unterzubringen.
- Behandlungsgruppe
- Nach der letzten (10.) sensorischen Phase werden alle Mäuse in neuen Käfigen unter ähnlichen Bedingungen wie bei der Ankunft beschrieben und über Nacht ruhen gelassen.
HINWEIS: Die letzte sensorische Phase sollte 24 h dauern, danach werden die Tiere in Einzelhaltung gehalten.
2. Test nach der Behandlung: Test zur Sicherheit der sozialen Bedrohung (Abbildung 2)
- Nach der CSD-Behandlung werden alle Mäuse (behandelte und Kontrollgruppen) in neuen Käfigen unter ähnlichen Bedingungen wie bei der Ankunft beschrieben und über Nacht ruhen gelassen.
- In den Morgenstunden (8:00-13:30 Uhr) wird die Dreikammerarena (rechteckige Form mit einer Gesamtgröße von 60 cm x 40 cm, aus transparenten Acrylwänden und glatten Böden) mit 5% Ethanol gereinigt und bei Lichtverhältnissen von 37 Lux unter die Kamera gestellt. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Arena sichtbar ist.
- Reinigen Sie die Gittergehäuse (käfigartig aus Metall oder Acryl) mit 5 % Ethanol und positionieren Sie sie wie in den Ecken in Abbildung 1A gezeigt.
- Eingewöhnungsphase: Stellen Sie das Tier in der Mitte der Arena vor, lassen Sie es 6 Minuten lang erkunden und bringen Sie es dann in seinen Heimatkäfig zurück.
- Platzieren Sie das neue (unbekannte) soziale Ziel CD-1 (Artgenosse) unter einem Maschengehege und das neue soziale Ziel 129/Sv unter dem anderen Netzgehege.
HINWEIS: Es ist wichtig, einen unbekannten 129/Sv-Artgenossen zu verwenden, um eine Vertrautheitsverzerrung zu vermeiden. Vorzugsweise 4 Gittergehäuse pro Arena: 2 für die Gewöhnungsphase und 2 für die Testphase. - Testphase: Setzen Sie das Tier von Interesse sofort wieder in der Mitte der Arena ein und lassen Sie es 6 Minuten lang erkunden.
- Bringen Sie alle Tiere in ihr Zuhause zurück. Reinigen Sie die Arena und die Gittergehege mit 5 % Ethanol zwischen den Versuchen mit verschiedenen Tieren, aber niemals während der Beobachtung desselben Tieres, d. h. niemals zwischen der Gewöhnungs- und der Testphase.
- Wechseln Sie die Position der Netzgehege zwischen den Tieren (und niemals zwischen den beiden Phasen innerhalb desselben Tieres), um mögliche Standortpräferenzen zu kontrollieren.
3. Scoring und Analyse
HINWEIS: Nur der Test nach der Stressbehandlung, d. h. der STST, wird bewertet und analysiert (und nicht die CSD-Stressbehandlung).
- Definieren Sie die Interaktionszone als 2 cm um die Grenzen der Netzgehäuse.
- Bewerten Sie die Zeit, die Sie mit der Erkundung der Netzgehege während der Gewöhnungsphase verbracht haben, wenn sich die Nase des Tieres innerhalb der Interaktionszone befindet.
- Bewerten Sie die Zeit, die Sie während der Testphase mit den sozialen Zielen verbracht haben, wenn sich die Nase des Tieres innerhalb der Interaktionszone befindet.
HINWEIS: Die Erkennung kann entweder manuell (mit einem Timer oder einer Software für die manuelle Bewertung) oder automatisch erfolgen. Unabhängig von der Nachweismethode ist der Nasenpunkt für Explorations- und soziale Interaktionsmessungen und der Mittelpunkt des Körpers für aktivitätsbezogene Messungen (z. B. zurückgelegte Strecke) zu nehmen. - Berechnen Sie den Index für soziale Interaktion wie folgt: Zeit, die für die Erkundung jedes sozialen Ziels während der Testphase aufgewendet wurde, / durchschnittliche Zeit, die für die Erkundung der beiden leeren Netzgehege während der Gewöhnungsphase aufgewendet wurde (Abbildung 2B).
- Unterteilen Sie die Behandlungsgruppe wie folgt in 3 Untergruppen: Tiere mit einem sozialen Interaktionsindex ≥1 mit dem sozialen Ziel CD-1 sind Nicht-Vermeider, Tiere mit einem sozialen Interaktionsindex <1 mit beiden sozialen Zielen sind wahllose Vermeider, Tiere mit einem sozialen Interaktionsindex ≥1 nur mit dem sozialen Ziel 129/Sv sind diskriminierende Vermeider (Abbildung 2C-D).
HINWEIS: Die Anzahl der Tiere innerhalb jeder der drei Untergruppen kann zwischen verschiedenen Tierchargen variieren (etwa 1/3 aller Tiere, die der CSD-Behandlung unterzogen werden, weisen die phänotypischen Merkmale einer der drei Untergruppen auf). - Beurteilen Sie den Stresseffekt, indem Sie den sozialen Interaktionsindex mit dem sozialen CD-1-Ziel zwischen der Behandlungs- und der Kontrollgruppe statistisch analysieren (entweder parametrischer Zwei-Stichproben-t-Test oder nichtparametrischer Mann-Whitney-Test).
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Representative Results
Sozialer Interaktionsindex als Maß für aversive konditionierte Reaktionen
Ein sozialer Interaktionsindex ≥1 spiegelt eine größere soziale Interaktion mit dem jeweiligen sozialen Ziel im Vergleich zur Erkundung der leeren Gittergehege wider. Unter Ausgangsbedingungen, die hier so definiert sind, dass sie weder appetitive noch aversive Erfahrungen mit den charakteristischen Merkmalen eines bestimmten Stammes haben (hier sowohl soziale Ziele für die Kontrollgruppe als auch das soziale Ziel 129/Sv für die Behandlungsgruppe), spiegeln sich intakte Geselligkeitsniveaus in einem sozialen Interaktionsindex ≥1 mit demselben Stamm wider. In der Zwischenzeit spiegelt sich nach einer sozial aversiven Konditionierungserfahrung (hier CSD-Behandlung) mit einem bestimmten Stamm (hier dem Stamm des Bewohners, d.h. dem CD-1-Stamm) und somit mit seinen charakterisierenden Merkmalen, die als konditionierter Stimulus dienen, die Entwicklung sozialer Vermeidung als Maß für eine korrekte aversive konditionierte Reaktion in einem sozialen Interaktionsindex <1 mit demselben Stamm wider. Die CSD-Stresswirkung ist die erste, die auf der Ebene der gesamten Behandlungsgruppe bewertet wird (siehe Schritt 3.6 im Protokoll). Insbesondere spiegelt sich der Stresseffekt in der Behandlungsgruppe wider, die einen sozialen Interaktionsindex <1 mit dem sozialen Ziel CD-1 als Maß für die Entwicklung der sozialen Vermeidung gegenüber dem CD-1-Stamm aufweist. In der Zwischenzeit spiegelt sich das intakte Ausgangsniveau der Geselligkeit der Kontrollgruppe in einem sozialen Interaktionsindex ≥1 mit dem gleichen sozialen Ziel wider. Dies führt zu einem signifikanten Unterschied (p < 0,05) im sozialen Interaktionsindex mit dem sozialen Ziel CD-1 zwischen beiden Gruppen (Abbildung 2C).
Identifizierung von drei unterschiedlichen phänotypischen Untergruppen innerhalb einer einzigen chronisch sozial besiegten Gruppe durch den Social Threat-Safety-Test
Nach der Einteilung der Tiere auf der Grundlage ihres sozialen Interaktionsindex, wie in den Schritten 3.4 und 3.5 des Protokolls erläutert, wird ein signifikanter Unterschied (p < 0,05) im Index innerhalb einer einzigen Untergruppe zwischen beiden sozialen Zielen nur innerhalb der Untergruppe der Diskriminierenden gefunden (Abbildung 2D,E). Die Untergruppe der Diskriminierenden und die Untergruppe der Untergruppe der Diskriminierenden haben einen sozialen Interaktionsindex <1 mit dem sozialen Ziel CD-1, ein Maß für die Entwicklung der sozialen Vermeidung gegenüber dem konditionierten Reiz (CD-1-Stamm), der die Entwicklung einer korrekten aversiven konditionierten Reaktion und des erfolgreichen aversiven konditionierten Lernens widerspiegelt. Im Gegensatz dazu spiegelt der soziale Interaktionsindex (≥1) der Untergruppe der Nicht-Vermeider ein beeinträchtigtes aversives konditioniertes Lernen mit dem gleichen sozialen Ziel (CD-1-Stamm) wider. In der Zwischenzeit spiegelt sich die Fähigkeit zur Unterscheidung von Bedrohung und Sicherheit in der Untergruppe der Diskriminierenden wider, die einen sozialen Interaktionsindex ≥1 mit dem sozialen Ziel 129/Sv als Maß für intakte Geselligkeitsniveaus gegenüber einem sicheren/neutralen Stimulus (129/Sv-Stamm) aufweist. Im Gegensatz dazu spiegelt sich die aversive Reaktionsverallgemeinerung der Untergruppe der Untergruppe der Untergruppe der Untergruppe der Unterscheidungsvermeider in einem sozialen Interaktionsindex <1 mit dem gleichen sozialen Ziel wie eine Messung der sozialen Vermeidung und damit in einer aversiven konditionierten Reaktion auf einen sicheren/neutralen Stimulus wider. Der prozentuale Anteil der Mäuse in jeder Untergruppe beträgt etwa 33 %; Dies ist jedoch unvorhersehbar, da einige Chargen von Tieren mehr oder weniger in jeder Untergruppe haben. Schließlich spiegelt sich das Fehlen von sozialem Präferenzbias als potenzieller Störfaktor in sozialen Interaktionsindizes von ≥1 (d.h. p>0,05) mit beiden sozialen Zielen innerhalb der Kontrollgruppe wider.
Interpretation der Ergebnisse des Tests zur sozialen Bedrohungssicherheit
Die Charakteristika der Untergruppe der Diskriminierenden, einschließlich des erfolgreichen konditionierten Lernens von Bedrohungs-assoziierten Hinweisen und der Bedrohungs-Sicherheits-Untergruppe, werden als Merkmale stressresilienter Individuen diskutiert 16,17,18,19,20,21,22. Im Gegensatz dazu sind generalisierte aversive konditionierte Reaktionen nach traumatischen Ereignissen, wie sie von der Untergruppe der Untergruppe der Unterwähler beobachtet werden, ein Schlüsselsymptom für stressbedingte psychische Störungen wie posttraumatische Belastungsstörungen und Angststörungen 16,17,23,24,25,26 und sind daher charakteristisch für stressanfällige Individuen. Schließlich stellt die Untergruppe der Nicht-Vermeider einen Phänotyp der Lernstörungdar 16.
Abbildung 1: Schematische Zeitleiste. Nach der Ankunft in der Einrichtung werden alle Mäuse 7 Tage lang in einem einzigen Stall gehalten und dann für die Behandlungen bestimmt: CSD-Stress-behandelte Gruppe oder behandelte Kontrollgruppe. Die Behandlungen dauern 10 Tage, danach werden die Tiere 1 Tag lang im Einzelstall untergebracht. Richten Sie die Arenen ein, um die STST durchzuführen (die nach der Einstallung der Tiere um 1 Tag stattfindet). Beginnen Sie mit der Gewöhnungsphase für 6 Minuten. Nach der Gewöhnungsphase folgt sofort die Testphase für weitere 6 Minuten. Zum Schluss bringen Sie die Tiere in ihre Heimatkäfige zurück. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Sicherheitstest für soziale Bedrohungen. (A) Versuchsdesign. Der Test wird in einer dreikammerigen Arena durchgeführt, die in drei gleiche Teile unterteilt ist, die durch transparente Wände mit Öffnungen getrennt sind, so dass sich das Tier von Interesse (C57BL6/J, schwarz) dazwischen bewegen kann. An jeder der Peripherien wird ein Mesh-Gehäuse platziert. Ein Gehege enthält ein neues soziales Ziel aus dem Stamm der Bewohner, der zuvor während der CSD-Behandlung aufgetreten ist (CD-1, weiß); die andere enthält ein neuartiges soziales Ziel aus einem neuartigen Stamm, der in Alter, Größe und Geschlecht mit der neuen Maus aus dem Stamm der Bewohner übereinstimmt, aber eine andere Fellfarbe hat (129/Sv, braun). Beide sozialen Ziele sind älter und größer als das Tier von Interesse. Das Tier von Interesse wird in der Mitte der Arena vorgestellt und darf die Arena während der Eingewöhnungsphase, wenn die Netzgehege leer sind, und während der Testphase, wenn die sozialen Ziele wie abgebildet in den Netzgehegen platziert werden, 6 Minuten lang erkunden. (B) Index der sozialen Interaktion. Bewerten Sie die Zeit, die während der Eingewöhnungsphase mit der Erkundung der Netzgehege verbracht wurde, wenn sich die Nase des Tieres innerhalb der Interaktionszone befindet (2 cm um die Grenzen der Netzgehege). Bewerten Sie anschließend die Zeit, die Sie während der Testphase mit den sozialen Zielen verbracht haben, wenn sich die Nase innerhalb der Interaktionszone befindet. Berechnen Sie den Index für soziale Interaktion wie gezeigt. (C) Chronischer sozialer Niederlagen-Stress-Effekt: Die Behandlungsgruppe hat einen sozialen Interaktionsindex <1 mit dem sozialen Ziel CD-1 als Maß für die Entwicklung der sozialen Vermeidung gegenüber dem CD-1-Stamm. In der Zwischenzeit spiegelt sich das intakte Ausgangsniveau der Geselligkeit der Kontrollgruppe in einem sozialen Interaktionsindex ≥1 mit dem gleichen sozialen Ziel wider. Daraus ergibt sich ein signifikanter Unterschied (p < 0,05) im sozialen Interaktionsindex mit dem sozialen CD-1-Ziel zwischen beiden Gruppen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt, n=16 pro Gruppe, Mann-Whitney-Test. (D) Repräsentative Ergebnisse des Tests zur sozialen Bedrohungssicherheit nach der Behandlung chronischer sozialer Niederlagen. Die Behandlungsgruppe wird in drei Untergruppen unterteilt, die auf den sozialen Interaktionsindizes der Tiere mit den sozialen Zielen basieren. Mäuse mit einem sozialen Interaktionsindex ≥1 mit dem sozialen Ziel CD-1 werden als Nicht-Vermeider bezeichnet, Mäuse mit einem sozialen Interaktionsindex <1 mit beiden sozialen Zielen werden als unterschiedslose Vermeider bezeichnet, und Mäuse mit einem sozialen Interaktionsindex ≥1 nur mit dem sozialen Ziel 129/Sv werden als diskriminierende Vermeider bezeichnet. Die Kontrollgruppe weist ähnliche Indizes mit beiden sozialen Zielen auf. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, n = 55 pro Sub/Gruppe. (E) Repräsentative Heatmaps jeder Unter-/Gruppe während der Testphase von STST. Dunklere Farben weisen darauf hin, dass mehr Zeit in dem Bereich verbracht wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Abbruchkriterien für das Verfahren der chronischen sozialen Niederlage. Die Tabelle enthält insgesamt vier Beobachtungsfamilien mit jeweils mehreren Unterbeobachtungen27. Jede Beobachtung hat eine Punktzahl. Abhängig von der Summe der Punktzahl werden Maßnahmen angezeigt, die zu ergreifen sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Das Verhaltensprotokoll beschreibt hier den Social Threat-Safety Test, der verwendet wird, um eine einzelne Gruppe nach einer CSD-Behandlung in drei verschiedene Untergruppen zu unterteilen, um die zugrunde liegende Biologie der Stressanfälligkeit und Resilienz zu untersuchen und mögliche Therapien zu testen. Der biologische Kontext und die technischen Details müssen sorgfältig berücksichtigt werden, um ein gründliches Versuchsdesign zu leiten.
Unterschiedliche Haltungsbedingungen können die Geselligkeit der Aggression verändern und möglicherweise die Ergebnisse des Nachbehandlungstests beeinflussen28,29,30. Zu diesen Bedingungen gehören die Einstallung aller Tiere bei der Ankunft und 24 Stunden vor dem Nachbehandlungstest sowie die Einstallung der Kontrollgruppe während der 10-tägigen Behandlung. Darüber hinaus kann der CSD-Stresseffekt beeinträchtigt werden, wenn die Kontrollgruppe versehentlich gestresst wird. Dies kann dadurch entstehen, dass die Kontrollgruppe während der 10-tägigen Behandlung stressinduzierten Gerüchen und Lautäußerungen der Behandlungsgruppe ausgesetzt wird, sowie der Kontrollgruppe, die Zeuge der Behandlung wird31. Daher ist es ratsam, die Kontrollgruppe und die Behandlungsgruppe in verschiedenen Räumen unterzubringen. Darüber hinaus ist aufgrund der Einbeziehung des konditionierten Lernens15sind bestimmte Schritte entscheidend, um Testergebnisse nach der Behandlung zu erhalten, die den hier beschriebenen ähneln. Dies umfasst die Durchführung der Behandlung junger Erwachsener für 10 Tage sowie die Durchführung des Nachbehandlungstests 24 Stunden nach der Ruhephase (siehe Schritt 2.1 im Protokoll). Konditioniertes Lernen kann bei jüngeren (oder älteren) Mäusen unterschiedlich sein. In ähnlicher Weise bedeutet die Durchführung der Behandlung für mehr oder weniger als 10 Tage mehr bzw. weniger Konditionierung des Tieres. Veränderungen in der Behandlungsdauer können zu unterschiedlichen Subgruppengrößen führen. Darüber hinaus ist es ratsam, dass innerhalb desselben Versuchs entweder derselbe Versuchsleiter die Behandlung und den Nachbehandlungstest an allen Tieren durchführt oder dass es eine Trennung zwischen den Versuchsleitern, die die Behandlung durchführen, und denen, die den Nachbehandlungstest durchführen, gibt, die bei allen Tieren ähnlich ist. Dies liegt daran, dass der/die Versuchsleiter/die Versuchsleiter einen Teil des Gesamtkontexts der Konditionierung (CSD-Behandlung) und des Testkontexts (soziale Bedrohung, Sicherheit nach der Behandlung) für das Tier darstellt. Daher sollten alle Tiere innerhalb desselben Experiments während des gesamten Versuchs dem gleichen Kontext ausgesetzt werden. Darüber hinaus kann das Verhalten der Tiere während des Nachbehandlungstests durch Geruchsreize verfälscht werden32. Die Reinigung mit 5 % Ethanol zwischen den Tieren standardisiert die Geruchsreize. Vermeiden Sie jedoch die Reinigung zwischen den beiden Phasen des Nachbehandlungstests (Gewöhnung und Testung) bei ein und demselben Tier. Dies liegt daran, dass die Gewöhnungsphase teilweise dazu dient, das Tier mit der Arena vertraut zu machen, so dass das Verhalten des Tieres während der Testphase hauptsächlich durch die neue Präsenz der neuen sozialen Ziele bestimmt wird. So kann die Reinigung zwischen den beiden Phasen die vom Tier während der Gewöhnungsphase markierten Geruchsreize beeinträchtigen, wodurch die Arena während der Testphase des Nachbehandlungstests weniger vertraut wird33. Darüber hinaus ist es vorzuziehen, vier Gittergehege pro Arena zu haben, von denen zwei der Gewöhnungsphase (immer leer verwendet) und zwei der Testphase (immer mit den sozialen Zielen verwendet) zugeordnet werden, um den potenziellen Restgeruch der sozialen Ziele CD-1 und 129/Sv in den Netzgehegen von der Testphase bis zur Gewöhnungsphase zu löschen. Die Eliminierung von Restgeruch in den Netzgehegen ist von entscheidender Bedeutung, da sie die Erkundung der Netzgehege durch das Tier während der Eingewöhnungsphase beeinflussen und die Ergebnisse des sozialen Interaktionsindex und damit die Einteilung der Behandlungsgruppe in drei Untergruppen verändern kann33. Ebenso ist es ratsam, dem Nachbehandlungstest spezifische soziale Ziele zuzuweisen und sie bei Nichtgebrauch unter ähnlichen Bedingungen zu halten. Dies liegt daran, dass die Einbeziehung eines sozialen Ziels in andere Behandlungen und Tests das Verhalten des jeweiligen Ziels im Netzgehege während des Nachbehandlungstests beeinflussen kann. Zum Beispiel kann die Verwendung des sozialen Ziels CD-1 in anderen Experimenten als Bewohner für die CSD-Behandlung das Aggressionsniveau im Vergleich zu 129/Sv verändern, wenn es im Test zur sozialen Bedrohungssicherheit nach der Behandlung verwendet wird. Unterschiede im Aggressionsniveau können dem Tier von Interesse während des Tests nach der Behandlung unterschiedliche Hinweise signalisieren, was zu einer bevorzugten Verzerrung führt, die nicht auf konditioniertes Lernen aus den 10 Tagen der Behandlung zurückzuführen ist. So können beide sozialen Ziele, die vor der Verwendung im Nachbehandlungstest ähnliche Erfahrungen gemacht haben, dazu beitragen, das Verhalten und die Signale beider zu standardisieren, während sie sich im Netzgehege befinden. Eine weitere Maßnahme, um die Implikation einer bevorzugten Verzerrung zu vermeiden, ist die Verwendung älterer und größerer sozialer Ziele als das Tier von Interesse15, wobei das Hauptmerkmal als charakteristisches Merkmal der Sorte bestätigt wird, nicht das Alter oder die Größe. Zu diesem Zweck wird im Nachbehandlungstest der Stamm 129/Sv verwendet, um die Stämme CD-1 und C57BL6/J zu kontrastieren. Die 129/Sv-Sorte hat eine andere Fellfarbe als beide. Es wäre von Interesse, verschiedene Stämme mit unterschiedlichen Fellfarben zu testen und zu sehen, wie die Ergebnisse im Nachbehandlungstest beeinflusst werden15.
Chronic Social Defeat ist eines der robustesten Modelle für posttraumatische Belastungsstörungen, Depressionen und andere stressbedingte Erkrankungen34. Es hat eine ausgezeichnete ätiologische-35, prädiktive-, diskriminierende-, pharmakologische- und Gesichtsvalidität 8,36. Hier wird ein modifiziertes CSD-Protokoll in männlichen Mäusen beschrieben, das von van Der Kooji und Kollegen eingeführt wurde und darauf abzielt, die psychosoziale Komponente des induzierten Stresses zu stärken10. Der Phänotyp der sozialen Vermeidung ist robust, zuverlässig und leicht testbar und besitzt ethologische Relevanz und eine starke Gesichtsvalidität34. Im Gegensatz zu anderen sozialen Interaktionstests9 ermöglicht der STST die gleichzeitige Bewertung der Entwicklung sozialer Vermeidung und der Fähigkeit zur Unterscheidung sozialer Bedrohungenund Sicherheit 16. Die Ergebnisse des STST werden verwendet, um stressanfällige und stressresiliente Untergruppen innerhalb einer einzigen Gruppe von chronisch sozial besiegten Mäusen zu identifizieren, was mit der Evidenz beim Menschen übereinstimmt, die resiliente Individuen mit Bedrohungs-Sicherheits-Diskriminierung und anfällige Individuen mit aversiver Reaktionsgeneralisierung charakterisieren16. Dieser Klassifikation können experimentelle Manipulationen folgen, um die neuronalen Grundlagen von Stressresilienz und -anfälligkeit im Allgemeinen und spezifisch für die Bedrohungs-Sicherheits-Unterscheidung im Vergleich zur aversiven Reaktionsgeneralisierung zu enträtseln16,37. Trotz jahrzehntelanger Forschung und gewisser Verbesserungen in der Behandlung sind stressbedingte psychische Störungen beim Menschen nach wie vor weit verbreitet. Durch die Fokussierung auf die Heterogenität verschiedener Individuen als Reaktion auf denselben Stressor kommt es jedoch zu einem Paradigmenwechsel von der reinen krankheitsorientierten Forschung hin zur gleichzeitigen Durchführung von krankheits- und gesundheitsorientierter Forschung. Dieser Paradigmenwechsel könnte dazu beitragen, neue Präventionsansätzezu entwickeln 38,39 und verbesserte zielgerichtete Behandlungsstrategien zu identifizieren.
Eine Einschränkung des Modells besteht darin, dass nur Männer untersucht wurden. Da der STST auf dem CSD-Modell basiert, das auf der Grundlage des Verhaltens männlicher Mäuse in der Natur40 entwickelt wurde, wurde der Test nicht auf seine Verträglichkeit mit weiblichen Mäusen untersucht. Ein kompatibler Test mit weiblichen Mäusen wäre einer, der einer Stressbehandlung folgt, die entweder bei beiden Geschlechtern oder nur bei Weibchen durchgeführt wird. Weitere Studien sind erforderlich, um diese Ergebnisse von männlichen auf weibliche Mäuse auszuweiten. Darüber hinaus stammen die hier erwarteten Ergebnisse von jungen erwachsenen Mäusen. Es würde zu unserem Verständnis beitragen, zu wissen, wie (ob) sich die Ergebnisse durch die Verwendung verschiedener Altersstufen ändern. Bemerkenswert ist, dass eine kürzlich durchgeführte Studie ergab, dass das soziale Vermeidungsverhalten nach CSD bei Mäusen verschiedener Altersgruppen ähnlich ist41. In ähnlicher Weise sind andere zu berücksichtigende Variablen die Behandlungsdauer, wenn sie nicht 10 Tage beträgt, und die Zeit des Verhaltenstests, wenn sie mehr als 24 Stunden nach der Pause durchgeführt wird. Insgesamt verfeinert das Modell die derzeit verwendeten Mäusemodelle der Stressanfälligkeit/Resilienz erheblich und trägt dazu bei, zukünftige translationale Ansätze voranzutreiben.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wird durch den Sonderforschungsbereich 1193, Teilprojekt Z02, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1193, Neurobiologie der Resilienz) und die Boehringer Ingelheim Stiftung gefördert (Förderung an Leibniz-Institut für Resilienzforschung und individuelle Phänotypisierung und hochauflösende automatisierte Verhaltensanalyse). Wir bedanken uns bei Dr. Konstantin Radyushkin und Frau Sandra Reichel für ihre fachliche Unterstützung sowie bei Frau Hanna Kim für ihre Unterstützung in englischer Sprache. Die Geldgeber waren nicht an der Modellgestaltung beteiligt; Erhebung, Analyse und Interpretation von Daten; bei der Abfassung des Protokolls; und bei der Entscheidung, das Protokoll zur Veröffentlichung vorzulegen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arenas | Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x 40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors |
| Camera for video recording | Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg |
ace Classic acA1300-60gc |
If using automatic detection program, make sure cameras are compatible |
| Camera objective | KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv |
Part-No. 10504 | |
| Detection program/Timer | Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/ethovision-xt | Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically |
| Housing cages | ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel |
3010010 | Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C |
| Mesh enclosures | Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol) |
| Mesh wall | selfmade | N/A | Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact |
| Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders | Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl |
Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl | CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice |
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