Summary
De sociale dreiging-veiligheidstest maakt een gelijktijdige beoordeling van de ontwikkeling van sociale vermijding mogelijk als een meting van aversief geconditioneerd leren en het vermogen om sociale dreiging en veiligheid te discrimineren, beide gebruikt om stressgevoelige en stressbestendige individuen te identificeren binnen een enkele groep chronisch sociaal verslagen mannelijke muizen.
Abstract
Sociale stress is een belangrijke oorzaak van de ontwikkeling van psychische stoornissen. Om de translationele waarde van preklinische studies te vergroten, moeten de ervaring met sociale stress en de gedragsimpact ervan op muizen vergelijkbaar zijn met die van mensen. Chronische sociale nederlaag (CSD) maakt gebruik van een soort sociale stress met fysieke aanvallen en zintuiglijke bedreigingen om mentale disfuncties te veroorzaken die lijken op menselijke affectieve stoornissen. Om de psychosociale component van CSD te versterken, werd een 10-daags CSD-protocol toegepast waarin dagelijkse fysieke aanvallen worden gestandaardiseerd op drie 10 s-episodes, gevolgd door een 24-uurs sensorische fase. Na de 10esensorische fase wordt het CSD-protocol gevolgd door een verfijnde gedragstest die de sociale dreiging-veiligheidstest (STST) wordt genoemd. Post-stress gedragstesten moeten bepalen hoe en in welke mate de sociale stressor het gedrag heeft beïnvloed. De STST stelt chronisch sociaal verslagen mannelijke muizen in staat om te communiceren met 2 nieuwe mannelijke individuen (sociale doelen): een sociaal doelwit van de aanvallende stam die tijdens de CSD-dagen wordt aangetroffen en het andere van een nieuwe stam. Beide worden gelijktijdig gepresenteerd in verschillende compartimenten van een testarena met drie kamers. De test maakt een gelijktijdige beoordeling van de ontwikkeling van sociale vermijding mogelijk om succesvol aversief geconditioneerd leren en het vermogen tot discriminatie op het gebied van sociale dreiging en veiligheid te meten. De ontwikkeling van sociale vermijding ten opzichte van beide stammen weerspiegelt een gegeneraliseerde aversieve respons en dus een meting van stressgevoeligheid. Ondertussen weerspiegelt de ontwikkeling van sociale vermijding in de richting van alleen de aanvallende stam een weerspiegeling van discriminatie op het gebied van dreiging en veiligheid en dus een meting van stressbestendigheid. Ten slotte weerspiegelt de afwezigheid van sociale vermijding ten opzichte van de aanvallende soort een verminderd aversief geconditioneerd leren. Het protocol heeft tot doel de momenteel gebruikte muismodellen van stressgevoeligheid/veerkracht te verfijnen door translationele criteria op te nemen, met name dreiging-veiligheidsdiscriminatie en generalisatie van aversieve reacties, om een enkele groep chronisch sociaal verslagen dieren te categoriseren in veerkrachtige en vatbare subgroepen, en uiteindelijk toekomstige translationele benaderingen te bevorderen.
Introduction
Stress wordt gedefinieerd als de verstoring van de homeostase veroorzaakt door fysieke of psychologische prikkels1. Stress is een bekende belangrijke risicofactor voor de ontwikkeling van psychische stoornissen zoals posttraumatische stressstoornis, depressie en angst 2,3. Met name sociale stress wordt beschouwd als een belangrijke risicofactor voor de ontwikkeling van stressgerelateerde psychische stoornissen4. Een vorm van sociale stress die in het onderzoek bijzonder belangrijk is geworden, is sociale ondergeschiktheidsstress5. Muizen zijn, net als mensen, in staat tot een rijke reeks sociaal gedrag6, waardoor ze geschikt zijn voor onderzoeken met sociale stress. In de laboratoriumomgeving, wanneer volwassen muizen in groepen worden gehuisvest, vestigen ze een sociale structuur met de vorming van rangen7. Dienovereenkomstig werd het koloniemodel ontworpen om de effecten van natuurlijk gevestigde sociale hiërarchieën in muizengroepen van gemengd geslacht te bestuderen8. In de loop der jaren zijn variaties van het koloniemodel ontwikkeld om gebruik te maken van sociale ondergeschiktheidsstress, waaronder groepsmodellen van hetzelfde geslacht, het sociale instabiliteitsmodel en het indringer-koloniemodel. In de afgelopen jaren is echter een bepaalde variant die bekend staat als het mannelijke indringermodel gepopulariseerd in de literatuur, waardoor de sociale complexiteit wordt vereenvoudigd tot twee muizen: een bewoner en een indringer. Het dier van belang, bekend als de indringer, wordt in de kooi geplaatst van een grotere, oudere en gepensioneerde fokker, bekend als de bewoner of agressor. De bewoner valt de indringer vervolgens fysiek aan als een methode van confrontatie, waarbij een sociale hiërarchie ontstaat waarin de bewoner dominant is en de indringer ondergeschikt. Wanneer confrontaties eenmalige gebeurtenissen zijn, classificeren ze als "acuut" (het "acute sociale nederlaagmodel"), terwijl herhaalde confrontaties die meerdere dagen duren (meestal 10) bekend staan als "chronisch" (het "chronische sociale nederlaagmodel"). In het model van chronische sociale nederlaag (CSD) zijn aanvallen intermitterend en meestal beperkt tot een periode van 5-10 minuten9, de fysieke fase genoemd. Na de fysieke fase worden de indringer en de bewoner 's nachts in dezelfde kooi gehouden, in tweeën gescheiden met een gaaswand, waardoor alle vormen van interactie mogelijk zijn, behalve fysiek contact. Deze configuratie, bekend als de sensorische fase, veroorzaakt stress door de voortdurende verschijning van dreiging in plaats van directe fysieke confrontatie. In 2018 introduceerden Van der Kooji en collega's een aangepaste chronische sociale nederlaagbehandeling om zich te concentreren op de psychosociale component van het model door de fysieke fase10 te standaardiseren en strikt te beperken. Het aangepaste model beperkt fysieke aanvallen tot drie episodes van 10 s met verschillende bewoners, die plaatsvinden in intervallen van 15 minuten tussen de episodes van de sensorische fase. Na de derde fysieke episode duurt de sensorische fase 's nachts. Deze cyclus herhaalt zich gedurende 10 opeenvolgende dagen met nieuwe bewoners per aflevering. De aangepaste behandeling verbetert de translationele validiteit van het chronische sociale nederlaagmodel, aangezien fysieke schade van de indringer wordt geminimaliseerd en de variabiliteit van de uitkomst door de differentiële duur van fysieke aanvallen wordt verminderd.
Aangezien het CSD-model wordt gebruikt om stressgerelateerde ziekten te bestuderen (bijv. depressie, angst, posttraumatische stressstoornis), worden post-gedragstesten gekozen, waaronder, maar niet beperkt tot, gedragstesten van agressie, geheugen en anhedonie. In de afgelopen jaren evalueren post-CSD-gedragstesten bij muizen vaak hoe en in welke mate de sociabiliteit wordt beïnvloed9. Sociabiliteit wordt gedefinieerd als de aangeboren voorkeur van muizen om sociaal te interageren in plaats van een soortgenoot sociaal te vermijden. Aangezien sociabiliteit onderhevig is aan stresseffecten, werden tests opgesteld die uitsluitend de ontwikkeling van sociale vermijding beoordelen. Door stress veroorzaakte sociale vermijding heeft een translationele relevantie, aangezien het een van de belangrijkste gedragssymptomen van sociale angst en depressie bij mensen vertegenwoordigt11. Net als bij mensen ontwikkelen niet alle muizen sociale vermijding na CSD-behandeling, wat wijst op de aanwezigheid van individualiteit in stressresponsiviteit. Cohen en collega's hebben afgesneden gedragscriteria voorgesteld als een veelbelovende benadering voor het bestuderen van de neurobiologie van individualiteit12. Selectie van dieren op basis van gedrag resulteert in groepsdeling, wat de basis onderstreept voor gen-omgevingsstudies. Vervolgens vertonen verschillende subgroepen vaak een duidelijke verrijking van specifieke genetische varianten/modificaties, die op hun beurt kunnen worden onderzocht onder verschillende omgevingsomstandigheden13. Dienovereenkomstig werd individualiteit in de ontwikkeling van sociale vermijding gebruikt om de enkele groep chronisch sociaal verslagen mannelijke muizen in twee subgroepen te verdelen: stressgevoelig (sociaal vermijdend) en stressbestendig (sociaal niet-vermijdend 9,14). De interpretatie van het fenotype van sociale vermijding bij muizen als een onaangepast of adaptief gedrag moet echter worden overwogen in de algemene context van zowel de behandeling (hier CSD) als de gedragstest na de behandeling. Bovendien zou de gedragstest na de behandeling idealiter andere facetten van sociabiliteit beoordelen en niet alleen de ontwikkeling van sociale vermijding. Ons recente werk onthulde de betrokkenheid van geconditioneerd leren bij CSD-geïnduceerde sociale vermijding15. In het bijzonder is CSD-geïnduceerde sociale vermijding een aversieve geconditioneerde reactie op de kenmerkende eigenschappen van de stam van de bewoners die dienen als de geconditioneerde stimulus voor de ongeconditioneerde stimulus, namelijk de aanvallen door de bewoners. Bovendien kunnen sommige individuen binnen de sociaal vermijdende subgroep onderscheid maken tussen de eigenschappen van de aversieve bewonersstam en die van andere veilige nieuwe stammen, terwijl andere individuen gegeneraliseerde sociale vermijding van beide stammen vertonen. We stellen hier een verfijnde gedragsmatige post-CSD-test voor: de Social Threat-Safety Test (STST)15. In tegenstelling tot andere sociale interactietests9, maakt de STST een gelijktijdige beoordeling van de ontwikkeling van sociale vermijding mogelijk als een meting van de juiste aversieve geconditioneerde respons (d.w.z. succesvol geconditioneerd leren) en het vermogen tot discriminatie op het gebied van sociale dreiging en veiligheid, die beide worden gebruikt om stressgevoelige en stressbestendige individuen te identificeren binnen een enkele groep chronisch sociaal verslagen mannelijke muizen. De beoordeling van sociale dreiging-veiligheidsdiscriminatie versus generalisatie van aversieve respons breidt de translationele criteria uit die worden gebruikt om de enkele groep chronisch sociaal verslagen dieren te classificeren in veerkrachtige en vatbare subgroepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen betreffende de verzorging en het gebruik van dieren voor experimentele procedures en werden goedgekeurd door de lokale autoriteiten (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). Figuur 1 geeft een schematische tijdlijn weer.
1. Behandeling
- Dieren van belang: Verkrijg C57BL6/J mannelijke muizen op de leeftijd van 7 weken en bij aankomst een eenpersoonskamer in een temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde faciliteit op een licht-donkercyclus van 12 uur (lichten aan: 8:00; lichten uit: 20:00; 23 °C; 38% luchtvochtigheid) met voedsel en water ad libitum.
- Chronische sociale nederlaag (CSD)
- Behandelgroep
- Voer na 1 week gewenning een CSD-behandeling uit gedurende 10 opeenvolgende dagen met behulp van de CD-1-stam als stam van de bewoner (zie voor een gedetailleerd protocol chronische sociale nederlaag9 en de gewijzigde chronische sociale nederlaagbehandeling10).
- Introduceer de C57BL6/J-muis in de kooi van de CD-1-muis en tel 10 seconden fysieke aanval. Herhaal deze aflevering drie keer, elk met een andere CD-1-muis, en gescheiden door intervallen van 15 minuten tussen de afleveringen.
- Plaats tijdens deze intervallen een gaaswand tussen de C57BL6/J-muis en de CD-1-muis, zodat alleen sensorisch contact mogelijk is. Na de derde aflevering huisvest je de C57BL6/J-muizen 's nachts in de kooien van de CD-1-muizen, waarbij je beide scheidt door een gaaswand. Herhaal dit gedurende 10 dagen.
OPMERKING: CD-1 muizen aantal = C57BL6/J muizen aantal + 1. Als het aantal met C57BL6/J behandelde muizen lager is dan 10, zijn er nog steeds minimaal 10 CD-1-muizen nodig om ervoor te zorgen dat elke dag de laatste sensorische fase (die 's nachts duurt) met een nieuwe CD-1-muis is gedurende de 10 dagen van de behandeling. - Beoordeel zorgvuldig het fysieke welzijn van de dieren gedurende de 10 dagen. Als een dier ernstig gewond is, sluit het dan uit van het experiment om ethische en wetenschappelijke redenen (mobiliteit/activiteit tijdens de test na de behandeling). Tabel 1 geeft een welzijnschecklist.
- Controlegroep
- Houd bij aankomst muizen van dezelfde leeftijd in dezelfde omstandigheden als de behandelingsgroep.
- Na 1 week gewenning worden de controledieren gedurende 90 seconden in een lege kooi geïntroduceerd en vervolgens teruggebracht naar individuele kooien (eenpersoonskamers) die in tweeën worden gescheiden door gaaswanden die identiek zijn aan die welke voor de behandelingsgroep worden gebruikt. Voer dit dagelijks parallel aan de 10 behandeldagen uit.
OPMERKING: Het is raadzaam om de controlegroep en de behandelingsgroep in verschillende kamers te huisvesten.
- Behandelgroep
- Na de laatste (10e) sensorische fase, alle muizen in één keer in nieuwe kooien huisvesten in vergelijkbare omstandigheden als beschreven bij aankomst en ze een nacht laten rusten.
OPMERKING: De laatste sensorische fase moet 24 uur duren, daarna worden de dieren in één keer gehuisvest.
2. Test na de behandeling: sociale dreiging-veiligheidstest (figuur 2)
- Na de CSD-behandeling worden alle muizen (behandelde en controlegroepen) in nieuwe kooien ondergebracht in vergelijkbare omstandigheden als beschreven bij aankomst en een nacht laten rusten.
- Reinig tijdens de ochtenduren (8:00-13:30 uur) de arena met drie kamers (rechthoek van vorm met een totale afmeting van 60 cm x 40 cm, gemaakt van transparante acrylwanden en gladde vloeren) met 5% ethanol en plaats deze onder de camera met lichtomstandigheden van 37 lux. Zorg ervoor dat de hele arena zichtbaar is.
- Reinig de gaasbehuizingen (kooiachtig gemaakt van metaal of acryl) met 5% ethanol en plaats ze zoals weergegeven in de hoeken in afbeelding 1A.
- Gewenningsfase: Introduceer het dier van belang in het midden van de arena, laat het 6 minuten verkennen en breng het dan terug naar hun thuiskooi.
- Plaats het nieuwe (onbekende) sociale doel CD-1 (soortgenoot) onder de ene mesh-behuizing en het nieuwe 129/Sv sociale doel onder de andere mesh-behuizing.
OPMERKING: Het is belangrijk om een onbekende 129/Sv-soortgenoot te gebruiken om een vertrouwdheidsbias te voorkomen. Zorg bij voorkeur voor 4 gaasomheiningen per arena: 2 toegeschreven aan de gewenningsfase en 2 aan de testfase. - Testfase: Introduceer het dier van belang onmiddellijk opnieuw in het midden van de arena en laat verkenning gedurende 6 minuten toe.
- Breng alle dieren terug naar hun huis. Reinig de arena en de gaasverblijven met 5% ethanol tussen het testen van verschillende dieren, maar nooit tijdens de observatie van hetzelfde dier, d.w.z. nooit tussen de gewennings- en testfasen.
- Wissel de locatie van de gaasomheiningen af tussen dieren (en nooit tussen de twee fasen binnen hetzelfde dier) om te controleren op mogelijke voorkeursvertekening van de locatie.
3. Scoring en analyse
OPMERKING: Alleen de post-stressbehandelingstest, d.w.z. de STST, wordt gescoord en geanalyseerd (en niet de CSD-stressbehandeling).
- Definieer de interactiezone als 2 cm rond de grenzen van de gaasbehuizingen.
- Scoor de duur die wordt besteed aan het verkennen van de gaasverblijven tijdens de gewenningsfase wanneer de neus van het dier zich binnen de interactiezone bevindt.
- Scoor de duur van de interactie met de sociale doelen tijdens de testfase wanneer de neus van het dier zich binnen de interactiezone bevindt.
OPMERKING: Detectie kan handmatig (met behulp van een timer of software voor handmatig scoren) of automatisch worden bereikt. Ongeacht de detectiemethode, neem het neuspunt voor verkennings- en sociale interactiemetingen en het middelpunt van het lichaam voor activiteitsgerelateerde metingen (bijv. verplaatste afstand). - Bereken de index van de sociale interactie als volgt: de tijd die wordt besteed aan het verkennen van elk sociaal doelwit tijdens de testfase / de gemiddelde tijd die wordt besteed aan het verkennen van de twee lege mesh-omheiningen tijdens de gewenningsfase (figuur 2B).
- Verdeel de behandelingsgroep als volgt in 3 subgroepen: Dieren met een sociale interactie-index ≥1 met het CD-1 sociale doel zijn niet-vermijders, dieren met een sociale interactie-index <1 met beide sociale doelen zijn niet-onderscheidende vermijders, dieren met een sociale interactie-index ≥1 alleen met het sociale doel 129/Sv zijn discriminerende vermijders (Figuur 2C-D).
OPMERKING: Het aantal dieren binnen elk van de drie subgroepen kan verschillen tussen verschillende dierpartijen (ongeveer 1/3 van alle dieren die de CSD-behandeling ondergaan, zal de fenotypische kenmerken van een van de drie subgroepen vertonen). - Beoordeel het stresseffect door statistisch de sociale interactie-index te analyseren met het CD-1 sociale doel tussen de behandelings- en controlegroepen (ofwel parametrische t-test met twee steekproeven of niet-parametrische Mann-Whitney-test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sociale interactie-index als een meting van aversieve geconditioneerde respons
Een sociale interactie-index ≥1 weerspiegelt een grotere sociale interactie met het respectieve sociale doel in vergelijking met de verkenning van de lege mesh-behuizingen. Onder basiscondities, hier gedefinieerd als het hebben van geen appetitieve of aversieve ervaring met de kenmerkende eigenschappen van een specifieke stam (hier zowel sociale doelen voor de controlegroep als de 129/Sv sociale doelgroep voor de behandelingsgroep), worden intacte sociabiliteitsniveaus weerspiegeld in een sociale interactie-index ≥1 met diezelfde stam. Ondertussen, na een sociaal aversieve conditioneringservaring (hier CSD-behandeling) met een specifieke stam (hier de stam van de bewoner, d.w.z. CD-1-stam) en dus, met zijn kenmerkende eigenschappen die dienen als een geconditioneerde stimulus, wordt de ontwikkeling van sociale vermijding als een meting van een correcte aversieve geconditioneerde respons weerspiegeld in een sociale interactie-index <1 met diezelfde stam. Het CSD-stresseffect is het eerste dat wordt beoordeeld en op het niveau van een algemene behandelingsgroep (zie stap 3.6 in het protocol). In het bijzonder wordt het stresseffect weerspiegeld in het feit dat de behandelingsgroep een sociale interactie-index <1 heeft met het sociale doel van CD-1 als maatstaf voor de ontwikkeling van sociale vermijding ten opzichte van de CD-1-stam. Ondertussen worden intacte basisniveaus van sociabiliteit van de controlegroep weerspiegeld in het hebben van een sociale interactie-index ≥1 met hetzelfde sociale doel. Dit resulteert in een significant verschil (p < 0,05) in de sociale interactie-index met de CD-1 sociale doelstelling tussen beide groepen (Figuur 2C).
Identificatie van drie verschillende fenotypische subgroepen binnen een enkele chronisch sociaal verslagen groep door de sociale dreiging-veiligheidstest
Na het delen van de dieren op basis van hun sociale interactie-index, zoals uitgelegd in stap 3.4 en 3.5 in het protocol, zal een significant verschil (p < 0,05) in de index binnen een enkele subgroep tussen beide sociale doelen, alleen worden gevonden binnen de subgroep van discriminerende vermijders (Figuur 2D,E). De subgroep discriminerende-vermijders en de niet-discriminerende-vermijders-subgroep hebben een sociale interactie-index <1 met de CD-1 sociale doelstelling, een meting van de ontwikkeling van sociale vermijding ten opzichte van de geconditioneerde stimulus (CD-1-stam), en weerspiegelt daarmee de ontwikkeling van een correcte aversieve geconditioneerde respons en van succesvol aversief geconditioneerd leren. Daarentegen weerspiegelt de sociale interactie-index (≥1) van de subgroep niet-vermijders een verminderd aversief geconditioneerd leren met hetzelfde sociale doel (CD-1-stam). Ondertussen wordt het vermogen om discriminatie op het gebied van dreiging en veiligheid weerspiegeld in de subgroep van discriminerende vermijders met een sociale interactie-index ≥1 met de sociale doelstelling van 129/Sv als maatstaf voor intacte sociabiliteitsniveaus ten opzichte van een veilige/neutrale stimulus (129/Sv-stam). Daarentegen wordt de generalisatie van de aversieve respons van de subgroep van niet-discriminerende vermijders weerspiegeld in het hebben van een sociale interactie-index <1 met hetzelfde sociale doel als een meting van sociale vermijding en dus een aversieve geconditioneerde respons op een veilige/neutrale stimulus. Het percentage muizen binnen elke subgroep is ongeveer 33%; Dit is echter onvoorspelbaar omdat sommige partijen dieren min of meer in elke subgroep zitten. Ten slotte wordt de afwezigheid van sociale voorkeursbias als potentiële verstorende factor weerspiegeld in sociale interactie-indices van ≥1 (d.w.z. p>0,05) met beide sociale doelen binnen de controlegroep.
Interpretatie van de resultaten van de sociale dreiging-veiligheidstest
De kenmerken van de subgroep van discriminerende vermijders, waaronder succesvol geconditioneerd leren van dreigingsgerelateerde signalen en discriminatie op het gebied van dreigingsveiligheid, worden besproken als kenmerken van stressbestendige individuen 16,17,18,19,20,21,22 . Daarentegen zijn gegeneraliseerde aversieve geconditioneerde reacties na traumatische gebeurtenissen, zoals gezien door de subgroep Ongedifferentieerde vermijders, een belangrijk symptoom van stressgerelateerde psychische stoornissen zoals posttraumatische stressstoornis en angststoornissen 16,17,23,24,25,26 en zijn dus kenmerkend voor stressgevoelige personen. Ten slotte vertegenwoordigt de subgroep niet-vermijders een fenotype van verminderd leervermogen16.
Figuur 1: Schematische tijdlijn. Bij aankomst in de faciliteit, alle muizen gedurende 7 dagen in één huis huisvesten en vervolgens de behandelingen aanwijzen: CSD-stressbehandelde groep of behandelde controlegroep. De behandelingen duren 10 dagen, waarna de dieren 1 dag in één huis worden gehouden. Zet de arena's op om de STST uit te voeren (die plaatsvindt na de enkelvoudige huisvesting van de dieren met 1 dag). Begin met de gewenningsfase gedurende 6 minuten. Volg de gewenningsfase onmiddellijk met de testfase gedurende nog eens 6 minuten. Breng ten slotte de dieren terug naar hun thuiskooien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Sociale dreiging-veiligheidstest. (A) Opzet van de test. De test wordt uitgevoerd in een arena met drie kamers die in drie gelijke delen is verdeeld, gescheiden door transparante wanden met openingen, waardoor het dier van belang (C57BL6/J, zwart) zich ertussen kan bewegen. Aan elk van de periferieën is één gaasbehuizing geplaatst. Eén omheining bevat een nieuw sociaal doelwit van de stam van de bewoners die eerder tijdens de CSD-behandeling werd aangetroffen (CD-1, wit); de andere bevat een nieuw sociaal doelwit van een nieuwe stam die qua leeftijd, grootte en geslacht overeenkomt met de nieuwe muis van de stam van de bewoners, maar met een andere vachtkleur (129/Sv, bruin). Beide sociale doelwitten zijn ouder en groter dan het dier in kwestie. Het dier van belang wordt geïntroduceerd in het midden van de arena en mag de arena gedurende 6 minuten verkennen tijdens de gewenningsfase wanneer de gaasverblijven leeg zijn en opnieuw tijdens de testfase wanneer de sociale doelen in de gaasverblijven worden geplaatst zoals afgebeeld. (B) Index van sociale interactie. Scoor de tijd die is besteed aan het verkennen van de gaasverblijven tijdens de gewenningsfase wanneer de neus van het dier zich binnen de interactiezone bevindt (2 cm rond de grenzen van de gaasverblijven). Scoor vervolgens de tijd die wordt besteed aan interactie met de sociale doelen tijdens de testfase wanneer de neus zich binnen de interactiezone bevindt. Bereken de index voor sociale interactie zoals weergegeven. (C) Chronisch stresseffect bij sociale nederlaag: De behandelingsgroep heeft een sociale interactie-index <1 met het sociale doel van CD-1 als maatstaf voor de ontwikkeling van sociale vermijding ten opzichte van de CD-1-stam. Ondertussen worden intacte basisniveaus van sociabiliteit van de controlegroep weerspiegeld in het hebben van een sociale interactie-index ≥1 met hetzelfde sociale doel. Dit resulteert in een significant verschil (p < 0,05) in de sociale interactie-index met de CD-1 sociale doelstelling tussen beide groepen. Resultaten gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM), n=16 per groep, Mann-Whitney-test. (D) Representatieve resultaten van de sociale dreigings-veiligheidstest na behandeling van chronische sociale nederlaag. De behandelingsgroep is verdeeld in drie subgroepen op basis van de sociale interactie-indices van de dieren met de sociale doelen. Muizen met een sociale interactie-index ≥1 met het sociale doel CD-1 worden niet-vermijders genoemd, muizen met een sociale interactie-index <1 met beide sociale doelen worden niet-onderscheidende vermijders genoemd en muizen met een sociale interactie-index ≥1 alleen met het sociale doel 129/Sv worden discriminerende vermijders genoemd. De controlegroep heeft vergelijkbare indices met beide sociale doelen. Resultaten gepresenteerd als gemiddelde ± SEM, n = 55 per sub/groep. (E) Representatieve heatmaps van elke sub/groep tijdens de testfase van STST. Donkere kleuren duiden op meer tijd doorgebracht in het gebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Criteria voor het afbreken van een chronische sociale nederlaagprocedure. De tabel presenteert in totaal vier families van waarnemingen, elk met verschillende deelwaarnemingen27. Elke waarneming heeft een score. Afhankelijk van de som van de score worden de te nemen maatregelen aangegeven. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gedragsprotocol hier beschrijft de Social Threat-Safety Test, die wordt gebruikt om een enkele groep post-CSD-behandeling in drie verschillende subgroepen te verdelen, die dient als een methode om de onderliggende biologie van stressgevoeligheid en veerkracht te onderzoeken en om potentiële therapieën te testen. De biologische context en technische details moeten zorgvuldig worden overwogen om een grondig experimenteel ontwerp te sturen.
Verschillende huisvestingsomstandigheden kunnen de mate van agressie in de sociabiliteit veranderen, wat mogelijk van invloed is op de resultaten van de test na de behandeling28,29,30. Dergelijke voorwaarden omvatten het eenmalig huisvesten van alle dieren bij aankomst en 24 uur voorafgaand aan de test na de behandeling, evenals het enkelvoudig huisvesten van de controlegroep gedurende de 10 dagen van de behandeling. Bovendien kan het CSD-stresseffect in het gedrang komen als de controlegroep per ongeluk gestrest raakt. Dit kan het gevolg zijn van het blootstellen van de controlegroep aan stress-geïnduceerde geuren en vocalisaties van de behandelingsgroep gedurende de 10 dagen van de behandeling, evenals de controlegroep die getuige is van de behandeling31. Het is dus raadzaam om de controlegroep en de behandelgroep in verschillende kamers te huisvesten. Bovendien, door de betrokkenheid van geconditioneerd leren15, zijn bepaalde stappen van cruciaal belang voor het verkrijgen van testresultaten na de behandeling die vergelijkbaar zijn met de hier beschreven resultaten. Dit omvat het uitvoeren van de behandeling op jongvolwassenen gedurende 10 dagen en het uitvoeren van de nabehandelingstest 24 uur na rust (zie stap 2.1 in het protocol). Geconditioneerd leren kan anders zijn bij jongere (of oudere) muizen. Evenzo betekent het uitvoeren van de behandeling gedurende meer of minder dan 10 dagen respectievelijk meer of minder conditionering van het dier. Veranderingen in de duur van de behandeling kunnen leiden tot verschillende subgroepsgroottes. Bovendien is het raadzaam dat binnen hetzelfde experiment ofwel dezelfde onderzoeker de behandeling en de nabehandelingstest op alle dieren uitvoert, ofwel dat er een scheiding is tussen de onderzoekers die de behandeling uitvoeren en degenen die de nabehandelingstest uitvoeren die vergelijkbaar is met alle dieren. Dit komt omdat de experimentator(en) deel uitmaakt van de algemene context van conditionering (CSD-behandeling) en testen (sociale dreiging-veiligheid na de behandeling) voor het dier; Daarom moeten alle dieren in hetzelfde experiment gedurende het hele experiment aan dezelfde context worden blootgesteld. Bovendien kan het gedrag van dieren tijdens de nabehandelingstest worden verstoord door geursignalen32. Reiniging met 5% ethanol tussen dieren standaardiseert de geursignalen. Vermijd echter het schoonmaken tussen de twee fasen van de nabehandelingstest (gewenning en testen) bij hetzelfde dier. De gewenningsfase is namelijk deels bedoeld om het dier vertrouwd te maken met de arena, zodat tijdens de testfase het gedrag van het dier vooral wordt bepaald door de nieuwe aanwezigheid van de nieuwe sociale doelen. Reiniging tussen de twee fasen kan dus de geursignalen die door het dier worden gemarkeerd tijdens de gewenningsfase in gevaar brengen, waardoor de arena minder vertrouwd wordt tijdens de testfase van de nabehandelingstest33. Bovendien verdient het de voorkeur om vier mesh-behuizingen per arena te hebben, waarvan er twee worden toegeschreven aan de gewenningsfase (altijd leeg gebruikt) en twee aan de testfase (altijd gebruikt met de sociale doelen), om de potentiële restgeur van de sociale doelen CD-1 en 129/Sv in de mesh-behuizingen van de testfase tot de gewenningsfase te doven. De eliminatie van restgeur in de gaasverblijven is van cruciaal belang omdat dit de verkenning van de gaasverblijven door het dier tijdens de gewenningsfase kan beïnvloeden, waardoor de resultaten van de sociale interactie-index veranderen en dus de verdeling van de behandelingsgroep in drie subgroepen33. Evenzo is het raadzaam om specifieke sociale doelen toe te kennen aan de test na de behandeling en deze in vergelijkbare omstandigheden te houden wanneer ze niet worden gebruikt. Dit komt omdat het betrekken van één sociaal doelwit bij andere behandelingen en tests het gedrag van het respectieve doelwit in de gaasomhulling tijdens de test na de behandeling kan beïnvloeden. Het gebruik van het sociale doel CD-1 in andere experimenten als bewoner voor CSD-behandeling kan bijvoorbeeld de agressieniveaus ten opzichte van de 129/Sv veranderen bij gebruik in de sociale dreiging-veiligheid na de behandelingstest. Verschillen in agressieniveaus kunnen verschillende signalen signaleren voor het dier van belang tijdens de test na de behandeling, waardoor een voorkeursbias ontstaat die niet wordt toegeschreven aan geconditioneerd leren van de 10 dagen behandeling. Beide sociale doelen die vergelijkbare ervaringen hebben vóór gebruik in de test na de behandeling, kunnen dus helpen het gedrag en de signalen van beide te standaardiseren terwijl ze zich in de mesh-behuizing bevinden. Een andere maatregel om de implicatie van een voorkeursbias te voorkomen, is het gebruik van oudere en grotere sociale doelen dan het dier in kwestie15, waarbij de belangrijkste aanwijzing wordt bevestigd als de kenmerkende eigenschappen van de soort, niet de leeftijd of grootte. Voor dit doel wordt bij de nabehandelingstest de 129/Sv-stam gebruikt om de CD-1- en C57BL6/J-stammen te contrasteren. De 129/Sv-stam heeft een andere vachtkleur dan beide. Het zou interessant zijn om verschillende stammen van verschillende vachtkleuren te testen en te zien hoe de resultaten in de nabehandelingstest worden beïnvloed15.
Chronic Social Defeat is een van de meest robuuste modellen voor posttraumatische stressstoornis, depressie en andere stressgerelateerde ziekten. Het heeft een uitstekende etiologische-35, voorspellende-, discriminerende-, farmacologische- en gezichtsvaliditeit 8,36. Hier wordt een aangepast CSD-protocol bij mannelijke muizen beschreven, geïntroduceerd door Van Der Kooji en collega's dat tot doel heeft de psychosociale component van de geïnduceerde stress teversterken10. Het fenotype van sociale vermijding is robuust, betrouwbaar en gemakkelijk testbaar en bezit ethologische relevantie en sterke gezichtsvaliditeit34. In tegenstelling tot andere sociale interactietests9, maakt de STST gelijktijdige beoordeling mogelijk van de ontwikkeling van sociale vermijding en het vermogen tot discriminatie op het gebied van sociale dreigingen veiligheid 16. De resultaten van de STST worden gebruikt om stressgevoelige en stressbestendige subgroepen te identificeren binnen een enkele groep chronisch sociaal verslagen muizen, wat overeenkomt met het bewijs bij mensen dat veerkrachtige individuen karakteriseert met discriminatie op het gebied van dreiging en veiligheid en gevoelige individuen met generalisatie van aversieve respons16. Deze classificatie kan worden gevolgd door experimentele manipulaties om de neurale basis van stressbestendigheid en gevoeligheid in het algemeen en specifiek voor dreiging-veiligheidsdiscriminatie versus aversieve responsgeneralisatie te helpen ontrafelen16,37. Ondanks tientallen jaren van onderzoek en bepaalde verbeteringen in de behandeling, komen stressgerelateerde psychische stoornissen nog steeds veel voor bij mensen. Door zich echter te concentreren op heterogeniteit tussen verschillende individuen als reactie op dezelfde stressor, vindt er een paradigmaverschuiving plaats van het uitvoeren van alleen ziektegericht onderzoek naar het gelijktijdig uitvoeren van ziekte- en gezondheidsgericht onderzoek. Deze paradigmaverschuiving kan helpen bij het ontwikkelen van nieuwe preventiebenaderingen38,39 en het identificeren van verbeterde gerichte behandelingsstrategieën.
Een beperking van het model is dat alleen mannen werden onderzocht. Omdat de STST is gebaseerd op het CSD-model, dat is ontwikkeld op basis van het gedrag van mannelijke muizen in de natuur40, werd de test niet beoordeeld op compatibiliteit met vrouwelijke muizen. Een test die compatibel is met vrouwelijke muizen zou er een zijn die volgt op een stressbehandeling die is gemaakt op beide geslachten of alleen op vrouwtjes. Verdere studies zijn nodig om deze gerapporteerde bevindingen uit te breiden van mannelijke naar vrouwelijke muizen. Bovendien zijn de hier gerapporteerde verwachte resultaten afkomstig van jongvolwassen muizen. Het zou bijdragen aan ons begrip om te weten hoe (of) de bevindingen veranderen door verschillende leeftijden te gebruiken. Merk op dat een recente studie aantoonde dat sociaal vermijdingsgedrag na CSD vergelijkbaar is tussen muizen van verschillende leeftijdsgroepen41. Evenzo zijn andere variabelen waarmee rekening moet worden gehouden de duur van de behandeling, indien verschillend van 10 dagen, en het tijdstip van gedragsbepaling, indien uitgevoerd meer dan 24 uur na rust. Over het algemeen verfijnt het model de momenteel gebruikte muizenmodellen van stressgevoeligheid/veerkracht aanzienlijk en draagt het bij aan het bevorderen van toekomstige translationele benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt ondersteund door het Collaborative Research Center 1193, Subproject Z02, gefinancierd door de Duitse Nationale Onderzoeksstichting (SFB1193, Neurobiology of Resilience) en de Boehringer Ingelheim Foundation (subsidie aan Leibniz Institute for Resilience Research and Individual Phenotyping and High-Resolution Automated Behavioural Analysis). We willen Dr. Konstantin Radyushkin en mevrouw Sandra Reichel bedanken voor hun technische assistentie, evenals mevrouw Hanna Kim voor haar ondersteuning in de Engelse taal. De financieringsbronnen waren niet betrokken bij het modelontwerp; het verzamelen, analyseren en interpreteren van gegevens; bij het opstellen van het protocol; en in het besluit om het protocol ter publicatie voor te leggen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arenas | Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x 40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors |
| Camera for video recording | Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg |
ace Classic acA1300-60gc |
If using automatic detection program, make sure cameras are compatible |
| Camera objective | KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv |
Part-No. 10504 | |
| Detection program/Timer | Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/ethovision-xt | Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically |
| Housing cages | ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel |
3010010 | Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C |
| Mesh enclosures | Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol) |
| Mesh wall | selfmade | N/A | Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact |
| Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders | Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl |
Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl | CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice |
References
- Hyman, S. E. How mice cope with stressful social situations. Cell. 131 (2), 232-234 (2007).
- Kessler, R. C. The effects of stressful life events on depression. Annual Review of Psychology. 48 (1), 191-214 (1997).
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 301 acute and chronic diseases and injuries in 188 countries, 1990-2013: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study, 2013. The Lancet. 386 (9995), 743-800 (2015).
- Björkqvist, K. Social defeat as a stressor in humans. Physiology & Behavior. 73 (3), 435-442 (2001).
- Blanchard, R. J., McKittrick, C. R., Blanchard, D. C. Animal models of social stress: effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiology & Behavior. 73 (3), 261-271 (2001).
- Singleton, G. R., Krebs, C. J. Chapter 3- The Secret World of Wild Mice. The Mouse in Biomedical Research. American College of Laboratory Animal Medicine. The Mouse in Biomedical Research (Second Edition). 1, Academic Press. 25-51 (2007).
- Kondrakiewicz, K., Kostecki, M., Szadzińska, W., Knapska, E. Ecological validity of social interaction tests in rats and mice. Genes, Brain, and Behavior. 18 (1), e12525 (2019).
- Martinez, M., Calvo-Torrent, A., Pico-Alfonso, M. A. Social defeat and subordination as models of social stress in laboratory rodents: a review. Aggressive Behavior: Official Journal of the International Society for Research on Aggression. 24 (4), 241-256 (1998).
- Golden, S. A., Covington III, H. E., Berton, O., Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nature Protocols. 6 (8), 1183 (2011).
- van der Kooij, M. A., et al. Chronic social stress-induced hyperglycemia in mice couples individual stress susceptibility to impaired spatial memory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), E10187-E10196 (2018).
- Chartier, M. J., Walker, J. R., Stein, M. B.
- Cohen, H., Zohar, J., Matar, M. A., Kaplan, Z., Geva, A. B. Unsupervised fuzzy clustering analysis supports behavioral cutoff criteria in an animal model of post-traumatic stress disorder. Biological Psychiatry. 58 (8), 640-650 (2005).
- Scharf, S. H., Schmidt, M. V. Animal models of stress vulnerability and resilience in translational research. Current Psychiatry Reports. 14 (2), 159-165 (2012).
- Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
- Ayash, S., Schmitt, U., Müller, M. B. Chronic social defeat-induced social avoidance as a proxy of stress resilience in mice involves conditioned learning. Journal of Psychiatric Research. 120, 64-71 (2020).
- Ayash, S., et al. Fear circuit-based neurobehavioural signatures mirror resilience to chronic social stress in mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (17), e2205576120 (2023).
- Duits, P., et al. Updated meta-analysis of classical fear conditioning in the anxiety disorders. Depression and Anxiety. 32 (4), 239-253 (2015).
- Coifman, K. G., Bonanno, G. A., Rafaeli, E. Affect dynamics, bereavement, and resilience to loss. Journal of Happiness Studies. 8 (3), 371-392 (2007).
- Waugh, C. E., Thompson, R. J., Gotlib, I. H. Flexible emotional responsiveness in trait resilience. Emotion. 11 (5), 1059 (2011).
- Bonanno, G. A. Loss, trauma, and human resilience: Have we underestimated the human capacity to thrive after extremely aversive events. American Psychologist. 59 (1), 20 (2004).
- Bonanno, G. A.
- Yehuda, R., Flory, J. D., Southwick, S., Charney, D. S. Developing an agenda for translational studies of resilience and vulnerability following trauma exposure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1071 (1), 379-396 (2006).
- Grillon, C., Morgan III, C. A. Fear-potentiated startle conditioning to explicit and contextual cues in Gulf War veterans with post-traumatic stress disorder. Journal of Abnormal Psychology. 108 (1), 134 (1999).
- Brewin, C. R. A cognitive neuroscience account of post-traumatic stress disorder and its treatment. Behaviour Research and Therapy. 39 (4), 373-393 (2001).
- Milad, M. R., Rauch, S. L., Pitman, R. K., Quirk, G. J. Fear extinction in rats: implications for human brain imaging and anxiety disorders. Biological Psychology. 73 (1), 61-71 (2006).
- Jovanovic, T., Norrholm, S. D. Neural mechanisms of impaired fear inhibition in post-traumatic stress disorder. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 5, 44 (2011).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. The Veterinary Record. 116 (6), 431-436 (1985).
- Goldsmith, J. F., Brain, P. F., Benton, D. Effects of the duration of individual or group housing on behavioural and adrenocortical reactivity in male mice. Physiology & Behavior. 21 (5), 757-760 (1978).
- Cairns, R. B., Hood, K. E., Midlam, J. On fighting in mice: Is there a sensitive period for isolation effects. Animal Behaviour. 33 (1), 166-180 (1985).
- Varlinskaya, E. I., Spear, L. P., Spear, N. E. Social behavior and social motivation in adolescent rats: role of housing conditions and partner's activity. Physiology & Behavior. 67 (4), 475-482 (1999).
- Sial, O. K., Warren, B. L., Alcantara, L. F., Parise, E. M., Bolaños-Guzmán, C. A. Vicarious social defeat stress: Bridging the gap between physical and emotional stress. Journal of Neuroscience Methods. 258, 94-103 (2016).
- Brown, R. E. The rodents II. Suborder Myomorpha. [In: Social Odours in Mammals]. Brown, R. E., Macdonald, D. W. 1, Oxford University Press. Oxford. (1985).
- Haney, M., Miczek, K. A. Ultrasounds during agonistic interactions between female rats (Rattus norvegicus). Journal of Comparative Psychology. 107 (4), 373 (1993).
- Warren, B. L., et al. Neurobiological sequelae of witnessing stressful events in adult mice. Biological Psychiatry. 73 (1), 7-14 (2013).
- Malatynska, E., Knapp, R. J. Dominant-submissive behavior as models of mania and depression. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 715-737 (2005).
- Avgustinovich, D. F., Kovalenko, I. L., Kudryavtseva, N. N. A model of anxious depression: persistence of behavioral pathology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 35 (9), 917-924 (2005).
- Vennin, C., et al. A resilience related glial-neurovascular network is transcriptionally activated after chronic social defeat in male mice. Cells. 11 (21), 3405 (2022).
- Ayash, S., Schmitt, U., Lyons, D. M., Müller, M. B. Stress inoculation in mice induces global resilience. Translational Psychiatry. 10 (1), 200 (2020).
- Yuan, R., et al. Long-term effects of intermittent early life stress on primate prefrontal-subcortical functional connectivity. Neuropsychopharmacology. 46 (7), 1348-1356 (2021).
- Lyons, D. M., Ayash, S., Schatzberg, A. F., Müller, M. B. Ecological validity of social defeat stressors in mouse models of vulnerability and resilience. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 145, 105032 (2023).
- Oizumi, H., et al. Influence of aging on the behavioral phenotypes of C57BL/6J mice after social defeat. PLoS One. 14 (9), e0222076 (2019).
