Summary
Det sociala hot-säkerhetstestet möjliggör en samtidig bedömning av social undvikandeutveckling som ett mått på aversiv betingad inlärning och social hot-säkerhetsdiskrimineringsförmåga, båda används för att identifiera stresskänsliga och stresståliga individer inom en enda grupp av kroniskt socialt besegrade hanmöss.
Abstract
Social stress är en viktig orsak till utvecklingen av psykiska störningar. För att öka det translationella värdet av prekliniska studier bör upplevelsen av social stress och dess beteendemässiga påverkan på möss vara jämförbar med den hos människor. Chronic Social Defeat (CSD) använder en typ av social stress som involverar fysiska attacker och sensoriska hot för att framkalla mentala dysfunktioner som liknar mänskliga affektiva störningar. För att stärka den psykosociala komponenten av CSD tillämpades ett 10-dagars CSD-protokoll där dagliga fysiska attacker standardiseras till tre 10-sekundersepisoder följt av en 24-timmars sensorisk fas. Efter den 10:e sensoriska fasen följs CSD-protokollet av en förfinad beteendeanalys som kallas social threat-safety test (STST). Beteendeanalyser efter stress måste fastställa hur och i vilken utsträckning den sociala stressfaktorn har påverkat beteendet. STST gör det möjligt för kroniskt socialt besegrade hanmöss att interagera med 2 nya hanindivider (sociala mål): ett socialt mål från den attackerande stammen som påträffades under CSD-dagarna och det andra från en ny stam. Båda presenteras samtidigt i olika fack i en testarena med tre kammare. Testet möjliggör en samtidig bedömning av social undvikande utveckling för att mäta framgångsrik aversiv betingad inlärning och social hot-säkerhetsdiskrimineringsförmåga. Utvecklingen av socialt undvikande mot båda stammarna återspeglar en generaliserad aversiv respons och därmed ett mått på stresskänslighet. Samtidigt återspeglar utvecklingen av socialt undvikande mot endast den attackerande stammen diskriminering av hot och säkerhet och därmed ett mått på stresstålighet. Slutligen återspeglar frånvaron av socialt undvikande mot den attackerande stammen försämrad aversiv betingad inlärning. Protokollet syftar till att förfina de musmodeller som för närvarande används för stresskänslighet/resiliens genom att inkludera translationella kriterier, särskilt hot-säkerhetsdiskriminering och generalisering av aversiv respons, för att kategorisera en enda grupp av kroniskt socialt besegrade djur i motståndskraftiga och mottagliga undergrupper, vilket så småningom främjar framtida translationella metoder.
Introduction
Stress definieras som störning av homeostas orsakad av fysiska eller psykologiska stimuli1. Stress är en välkänd stor riskfaktor för utveckling av psykiska störningar som posttraumatiskt stressyndrom, depression och ångest 2,3. I synnerhet anses social stress vara en viktig riskfaktor för utveckling av stressrelaterade psykiska störningar4. En typ av social stress som har fått särskild betydelse i forskningen är social underordningsstress5. Möss, precis som människor, är kapabla till en rik uppsättning sociala beteenden6, vilket gör dem lämpliga för undersökningar som involverar social stress. I laboratoriemiljön, när vuxna möss hålls i grupp, etablerar de en social struktur som involverar bildandet av rang7. Följaktligen utformades kolonimodellen för att studera effekterna av naturligt etablerade sociala hierarkier i könsblandade grupper av möss8. Under årens lopp har varianter av kolonimodellen utvecklats för att utnyttja social underordningsstress, inklusive samkönade gruppmodeller, modellen för social instabilitet och inkräktarkolonimodellen. Under de senaste åren har dock en särskild variant som kallas den manliga inkräktarmodellen populariserats i litteraturen, vilket förenklar den sociala komplexiteten till två möss: en inneboende och en inkräktare. Djuret av intresse, känt som inkräktaren, placeras i buren hos en större, äldre och pensionerad uppfödare, känd som den boende eller angriparen. Den boende attackerar sedan fysiskt inkräktaren som en konfrontationsmetod, och etablerar en social hierarki där den boende är dominant och inkräktaren är underordnad. När konfrontationer är engångshändelser klassificeras de som "akuta" ("akuta sociala nederlagsmodellen"), medan upprepade konfrontationer som varar över flera dagar (vanligtvis 10) är kända som "kroniska" (den "kroniska sociala nederlagsmodellen"). I modellen för kroniskt socialt nederlag (CSD) är attackerna intermittenta och vanligtvis begränsade till en period på 5-10 minuter9, kallad den fysiska fasen. Efter den fysiska fasen hålls inkräktaren och den boende över natten i samma bur, separerade på mitten med en nätvägg, vilket möjliggör alla former av interaktion utom fysisk kontakt. Denna konfiguration, känd som den sensoriska fasen, inducerar stress genom det kontinuerliga utseendet av hot istället för direkt fysisk konfrontation. År 2018 introducerade van der Kooji och kollegor en modifierad behandling av kroniska sociala nederlag för att fokusera på den psykosociala komponenten i modellen genom att standardisera och strikt begränsa den fysiska fas10. Den modifierade modellen begränsar fysiska attacker till tre 10-sekundersepisoder med olika invånare, som inträffar i 15 minuters mellanrum mellan episoderna i den sensoriska fasen. Efter den tredje fysiska episoden varar den sensoriska fasen över natten. Denna cykel upprepas i 10 dagar i följd med nya invånare per avsnitt. Den modifierade behandlingen förbättrar den translationella validiteten av den kroniska sociala nederlagsmodellen eftersom den fysiska skadan på inkräktaren minimeras och utfallsvariabiliteten från olika varaktigheter av fysiska attacker minskar.
Eftersom CSD-modellen används för att studera stressrelaterad sjukdom (t.ex. depression, ångest, posttraumatiskt stressyndrom) väljs post-beteendeanalyser, inklusive, men inte begränsat till, beteendeanalyser av aggression, minne och anhedonia. Under de senaste åren har beteendeanalyser efter CSD på möss ofta utvärderat hur och i vilken utsträckning sällskaplighetenpåverkas. Sällskaplighet definieras som mössens medfödda preferens att interagera socialt snarare än att socialt undvika en artfränder. Eftersom sällskaplighet är föremål för stresseffekter etablerades analyser som enbart bedömer social undvikande utveckling. Stressinducerat socialt undvikande har en translationell relevans eftersom det representerar ett av de viktigaste beteendemässiga symtomen på social ångest och depression hos människor11. I likhet med människor utvecklar inte alla möss socialt undvikande efter CSD-behandling, vilket tyder på att det finns individualitet i stressresponsen. Cohen och kollegor har föreslagit att cut-off beteendekriterier är ett lovande tillvägagångssätt för att studera neurobiologin hos individualitet12. Urval av djur baserat på beteende resulterar i gruppindelning, vilket understryker grunden för gen-miljöstudier. Därefter uppvisar olika undergrupper ofta en tydlig anrikning av specifika genetiska varianter/modifieringar, som i sin tur kan undersökas under olika miljöförhållanden13. Följaktligen användes individualitet i utvecklingen av socialt undvikande för att dela in den enda gruppen av kroniskt socialt besegrade hanmöss i två undergrupper: stressmottagliga (socialt undvikande) och stresståliga (socialt icke-undvikande 9,14). Tolkningen av fenotypen socialt undvikande hos möss som ett maladaptivt eller adaptivt beteende bör dock övervägas i det övergripande sammanhanget för både behandlingen (här CSD) och beteendeanalysen efter behandlingen. Dessutom skulle den valda beteendeanalysen efter behandlingen helst bedöma andra aspekter av sällskaplighet och inte enbart social undvikande utveckling. Vårt senaste arbete avslöjade att betingad inlärning är involverad i CSD-inducerat socialt undvikande15. Specifikt är CSD-inducerat socialt undvikande en aversiv betingad respons på de karakteristiska dragen hos de boendes belastning som fungerar som den betingade stimulansen till den obetingade stimulansen, nämligen attackerna från de boende. Dessutom, inom den socialt undvikande undergruppen, kan vissa individer skilja mellan egenskaperna hos de aversiva invånarnas stam och de hos andra säkra nya stammar, medan andra individer visar generaliserat socialt undvikande av båda stammarna. Vi föreslår här en förfinad beteendeanalys efter CSD: Social Threat-Safety Test (STST)15. Till skillnad från andra sociala interaktionstester9 möjliggör STST en samtidig bedömning av social undvikande utveckling som ett mått på den korrekta aversiva betingade responsen (dvs. framgångsrik betingad inlärning) och social hot-säkerhetsdiskrimineringsförmåga, som båda används för att identifiera stressmottagliga och stresståliga individer inom en enda grupp av kroniskt socialt besegrade hanmöss. Bedömningen av social hot-säkerhetsdiskriminering kontra generalisering av aversiv respons utvidgar de translationella kriterierna som används för att klassificera den enda gruppen av kroniskt socialt besegrade djur i motståndskraftiga och mottagliga undergrupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv om skötsel och användning av djur för försök och godkändes av lokala myndigheter (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). Figur 1 visar en schematisk tidslinje.
1. Behandling
- Djur av intresse: Skaffa C57BL6/J-hanmöss vid 7 veckors ålder, och vid ankomsten, enkelhus i en temperatur- och luftfuktighetskontrollerad anläggning på en 12 timmars ljus-mörkercykel (lamporna på: 8:00; lamporna släckta: 20:00; 23 °C; 38 % luftfuktighet) med mat och vatten ad libitum.
- Kroniskt socialt nederlag (CSD)
- Behandlingsgrupp
- Efter 1 veckas tillvänjning, utför CSD-behandling i 10 dagar i följd med CD-1-stammen som den boendes stam (för ett detaljerat protokoll, se Chronic Social Defeat9 och Modified Chronic Social Defeat Treatment10).
- För in C57BL6/J-musen i CD-1-musens bur och räkna till 10 s fysisk attack. Upprepa avsnittet tre gånger, var och en med olika CD-1-mus, och separera det med 15 minuters mellanrum.
- Placera en nätvägg mellan C57BL6/J-musen och CD-1-musen under dessa intervaller, så att endast sensorisk kontakt tillåts. Efter den tredje episoden ska C57BL6/J-mössen övernatta i CD-1-mössens burar, åtskilda av båda med en nätvägg. Upprepa i 10 dagar.
OBS: CD-1 musnummer = C57BL6/J musnummer + 1. Om antalet C57BL6/J-behandlade möss är under 10 behövs fortfarande minst 10 CD-1-möss för att säkerställa att den sista sensoriska fasen (som varar över natten) varje dag är med en ny CD-1-mus under de 10 behandlingsdagarna. - Bedöm noggrant djurens fysiska välbefinnande under de 10 dagarna. Om ett djur är allvarligt skadat ska det uteslutas från försöket av etiska och vetenskapliga skäl (rörlighet/aktivitet under efterbehandlingstestet). Tabell 1 innehåller en checklista för välbefinnande.
- Kontrollgrupp
- Vid ankomst ska möss i samma ålder hållas under samma förhållanden som behandlingsgruppen.
- Efter 1 veckas tillvänjning sätts kontrolldjuren in i 90 sekunder i en tom bur och återförs sedan till individuella burar (enhus) som är separerade på mitten med nätväggar som är identiska med dem som används för behandlingsgruppen. Utför detta dagligen parallellt med de 10 behandlingsdagarna.
OBS: Det är tillrådligt att hålla kontrollgruppen och behandlingsgruppen inrymda i olika rum.
- Behandlingsgrupp
- Efter den sista (10:e) sensoriska fasen, inhysa alla möss i nya burar i liknande förhållanden som de som beskrevs vid ankomsten och låt dem vila över natten.
OBS: Den sista sensoriska fasen ska vara i 24 timmar, sedan är djuren enhemshus.
2. Efterbehandlingstest: Test av social hotsäkerhet (figur 2)
- Efter CSD-behandling ska alla möss (behandlade grupper och kontrollgrupper) hållas i nya burar i liknande förhållanden som de som beskrevs vid ankomsten och låta dem vila över natten.
- Under morgontimmarna (8:00-13:30), rengör arenan med tre kammare (rektangel i form med en total storlek på 60 cm x 40 cm, gjord av transparenta akrylväggar och släta golv) med 5% etanol och placera den under kameran med ljusförhållanden på 37 lux. Se till att hela arenan är synlig.
- Rengör näthöljena (burliknande gjorda av metall eller akryl) med 5 % etanol och placera dem enligt bilden i hörnen i figur 1A.
- Tillvänjningsfas: Introducera djuret av intresse i mitten av arenan, låt det utforska i 6 minuter och sätt sedan tillbaka det i sin hembur.
- Placera det nya (okända) CD-1 sociala målet (artfränder) under ett näthölje och det nya 129/Sv sociala målet under det andra näthöljet.
OBS: Det är viktigt att använda en okänd 129/Sv-artfrände för att undvika förtrogenhetsbias. Ha helst 4 nätinhägnader per arena: 2 tillskrivs tillvänjningsfasen och 2 till testfasen. - Testfas: Återintroducera omedelbart djuret av intresse i mitten av arenan och låt utforskningen ske i 6 minuter.
- Lämna tillbaka alla djur till sina hem. Rengör arenan och nätutrymmena med 5 % etanol mellan tester av olika djur, men aldrig under observation av samma djur, dvs. aldrig mellan tillvänjnings- och testfaserna.
- Växla placeringen av nätutrymmena mellan djuren (och aldrig mellan de två faserna inom samma djur) för att kontrollera eventuell placeringsföreträdesbias.
3. Poängsättning och analys
OBS: Endast testet efter stressbehandling, dvs. STST, poängsätts och analyseras (och inte CSD-stressbehandlingen).
- Definiera interaktionszonen som 2 cm runt näthägnadernas gränser.
- Poängsätt hur lång tid det tar att utforska nätinhägnaderna under tillvänjningsfasen när djurets nos befinner sig inom interaktionszonen.
- Poängsätt hur länge du interagerar med de sociala målen under testfasen när djurets nos är inom interaktionszonen.
OBS: Detektering kan uppnås antingen manuellt (med hjälp av en timer eller programvara för manuell poängsättning) eller automatiskt. Oavsett detektionsmetod, ta näspunkten för utforskning och mätningar av social interaktion och kroppens mittpunkt för aktivitetsrelaterade mätningar (t.ex. flyttad sträcka). - Beräkna indexet för social interaktion enligt följande: tid som ägnas åt att utforska varje socialt mål under testfasen/genomsnittlig tid som ägnas åt att utforska de två tomma näthöljena under tillvänjningsfasen (figur 2B).
- Dela in behandlingsgruppen i 3 undergrupper enligt följande: Djur med ett socialt interaktionsindex ≥1 med det sociala målet CD-1 är icke-undvikande, djur med ett socialt interaktionsindex <1 med båda sociala målen är urskillningslösa-undvikare, djur med ett socialt interaktionsindex ≥1 endast med det sociala målet 129/Sv är diskriminerande-undvikare (Figur 2C-D).
OBS: Antalet djur inom var och en av de tre undergrupperna kan skilja sig åt mellan olika djurpartier (cirka 1/3 av alla djur som genomgår CSD-behandlingen kommer att uppvisa de fenotypiska egenskaperna hos en av de tre undergrupperna). - Bedöm stresseffekten genom att statistiskt analysera indexet för social interaktion med det sociala målet CD-1 mellan behandlings- och kontrollgrupperna (antingen parametriskt t-test med två urval eller icke-parametriskt Mann-Whitney-test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Index för social interaktion som ett mått på aversiv betingad respons
Ett index för social interaktion ≥1 återspeglar större social interaktion med respektive socialt mål jämfört med utforskningen av de tomma näthägnaderna. Under baslinjeförhållanden, som här definieras som att de varken har aptitlig eller motbjudande erfarenhet av de karakteristiska egenskaperna hos en specifik stam (här både sociala mål till kontrollgruppen och 129/Sv sociala mål till behandlingsgruppen), återspeglas intakta socialitetsnivåer i ett socialt interaktionsindex ≥1 med samma stam. Samtidigt, efter en socialt motbjudande betingningsupplevelse (här CSD-behandling) med en specifik stam (här den boendes stam, dvs. CD-1-stam) och därmed med dess karakteristiska egenskaper som fungerar som ett betingat stimulus, återspeglas social undvikandeutveckling som ett mått på en korrekt aversiv betingad respons i ett socialt interaktionsindex <1 med samma stam. CSD:s stresseffekt är den första som utvärderas och på en övergripande behandlingsgruppsnivå (se steg 3.6 i protokollet). Specifikt återspeglas stresseffekten i att behandlingsgruppen har ett socialt interaktionsindex <1 med det sociala målet CD-1 som ett mått på social undvikande utveckling mot CD-1-stammen. Samtidigt återspeglas kontrollgruppens intakta sociala grundnivåer i att ha ett socialt interaktionsindex ≥1 med samma sociala mål. Detta resulterar i en signifikant skillnad (p < 0,05) i indexet för social interaktion med det sociala målet CD-1 mellan de båda grupperna (Figur 2C).
Identifiering av tre distinkta fenotypiska undergrupper inom en enda kroniskt socialt besegrad grupp genom det sociala hot-säkerhetstestet
Efter att ha delat upp djuren baserat på deras index för social interaktion, som förklaras i steg 3.4 och 3.5 i protokollet, kommer en signifikant skillnad (p < 0,05) i indexet inom en enda undergrupp mellan de båda sociala målen, endast att hittas inom undergruppen diskriminerande-undvikare (figur 2D,E). Undergruppen diskriminerande-undvikande och undergruppen urskillningslösa-undvikare har ett socialt interaktionsindex <1 med CD-1 socialt mål, ett mått på social undvikande utveckling mot det betingade stimulus (CD-1-stam), vilket återspeglar utvecklingen av en korrekt aversiv betingad respons och framgångsrik aversiv betingad inlärning. Däremot återspeglar indexet för social interaktion (≥1) för undergruppen icke-undvikande personer nedsatt aversiv betingad inlärning med samma sociala mål (CD-1-stam). Samtidigt återspeglas förmågan att urskilja hot och säkerhet i att undergruppen diskriminerande-undvikande har ett socialt interaktionsindex ≥1 med det sociala målet 129/Sv som ett mått på intakta sociala nivåer mot en säker/neutral stimulans (129/Sv-stam). Däremot återspeglas generaliseringen av den aversiva responsgeneraliseringen av undergruppen urskillningslösa-undvikare i att ha ett socialt interaktionsindex <1 med samma sociala mål som ett mått på socialt undvikande och därmed en aversiv betingad respons mot en säker/neutral stimulus. Andelen möss inom varje undergrupp är cirka 33 %; Detta är dock oförutsägbart eftersom vissa djurpartier har mer eller mindre i varje undergrupp. Slutligen återspeglas frånvaron av social preferens som en potentiell förväxlingsfaktor i sociala interaktionsindex på ≥1 (dvs. p>0,05) med båda sociala målen inom kontrollgruppen.
Tolkning av testresultaten för det sociala hotet
Karaktärsdragen hos undergruppen diskriminerande-undvikare, inklusive framgångsrik betingad inlärning av hotassocierade signaler och hot-säkerhetsdiskriminering, diskuteras som egenskaper hos stresståliga individer 16,17,18,19,20,21,22 . Däremot är generaliserade aversiva betingade reaktioner efter traumatiska händelser, som ses av undergruppen Urskillningslösa-undvikare, ett nyckelsymptom på stressrelaterade psykiska störningar som posttraumatiskt stressyndrom och ångestsyndrom 16,17,23,24,25,26 och är därför karakteristiska för stresskänsliga individer. Slutligen representerar undergruppen icke-undvikande en fenotyp av nedsatt inlärning16.
Figur 1: Schematisk tidslinje. Vid ankomsten till anläggningen, enhusa alla möss i 7 dagar och utse sedan till behandlingarna: CSD stressbehandlad grupp eller hanterad kontrollbehandlad grupp. Behandlingarna pågår i 10 dagar, varefter djuren hålls i enrum i 1 dag. Sätt upp arenorna för att utföra STST (som äger rum efter att djuren har hållits med 1 dag). Börja med tillvänjningsfasen i 6 minuter. Följ tillvänjningsfasen omedelbart med testfasen i ytterligare 6 minuter. Slutligen ska du sätta tillbaka djuren i sina hemburar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Testning av sociala hot. A) Provningens utformning. Testet utförs i en arena med tre kammare som är uppdelad i tre lika stora delar åtskilda av genomskinliga väggar med öppningar, vilket gör att djuret i fråga (C57BL6/J, svart) kan röra sig däremellan. Vid var och en av periferierna placeras ett näthölje. En inhägnad innehåller ett nytt socialt mål från de boendes belastning som påträffats tidigare under CSD-behandlingen (CD-1, vit); den andra innehåller ett nytt socialt mål från en ny stam som matchas i ålder, storlek och kön med den nya musen från de boendes stam men med annan pälsfärg (129/Sv, brun). Båda de sociala måltavlorna är äldre och större än djuret i fråga. Djuret av intresse introduceras i mitten av arenan och får utforska arenan i 6 minuter under tillvänjningsfasen när nätinhägnaderna är tomma och igen under testfasen när de sociala målen placeras inuti nätinhägnaderna enligt bilden. (B) Index för social interaktion. Poängsätt den tid som ägnats åt att utforska nätinhägnaderna under tillvänjningsfasen när djurets nos befinner sig inom interaktionszonen (2 cm runt näthägnadernas gränser). Poängsätt sedan den tid som ägnas åt att interagera med de sociala målen under testfasen när näsan är inom interaktionszonen. Beräkna indexet för social interaktion enligt bilden. (C) Kronisk stresseffekt av social nederlag: Behandlingsgruppen har ett socialt interaktionsindex <1 med det sociala målet CD-1 som ett mått på utvecklingen av socialt undvikande mot CD-1-stammen. Samtidigt återspeglas kontrollgruppens intakta sociala grundnivåer i att ha ett socialt interaktionsindex ≥1 med samma sociala mål. Detta resulterar i en signifikant skillnad (p < 0,05) i indexet för social interaktion med CD-1 socialt mål mellan båda grupperna. Resultaten presenteras som medelvärde ± medelvärde (SEM), n=16 per grupp, Mann-Whitney-testet. D) Representativa resultat från test av sociala hot och säkerhet efter behandling av kronisk social förlust. Behandlingsgruppen är indelad i tre undergrupper baserat på djurens sociala interaktionsindex med de sociala målen. Möss med ett socialt interaktionsindex ≥1 med CD-1 socialt mål betecknas som icke-undvikande, möss med ett socialt interaktionsindex <1 med båda sociala målen betecknas som urskillningslösa undvikare, och möss med ett socialt interaktionsindex ≥1 endast med det sociala målet 129/Sv betecknas som diskriminerande-undvikare. Kontrollgruppen har liknande index med båda de sociala målen. Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM, n = 55 per sub/grupp. E) Representativa värmekartor för varje undergrupp/grupp under testfasen av STST. Mörkare färger indikerar mer tid i området. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Avbrottskriterier för förfarandet för kronisk social förlust. I tabellen presenteras totalt fyra observationsfamiljer, var och en med flera delobservationer27. Varje observation har en poäng. Beroende på summan av poängen anges åtgärder som ska vidtas. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beteendeprotokollet här beskriver Social Threat-Safety Test, som används för att dela upp en enda grupp efter CSD-behandling i tre olika undergrupper, och fungerar som en metod för att undersöka den underliggande biologin för stresskänslighet och motståndskraft och för att testa potentiella terapier. Det biologiska sammanhanget och de tekniska detaljerna måste övervägas noggrant för att vägleda en grundlig experimentell design.
Olika inhysningsförhållanden kan förändra aggressionens sällskaplighetsnivåer, vilket kan påverka resultaten från testet efter behandlingen28,29,30. Sådana villkor omfattar att alla djur hålls i en enda djurgrupp vid ankomst och 24 timmar före testet efter behandlingen samt att kontrollgruppen hålls i en enda djurgrupp under de 10 dagar som behandlingen pågår. Dessutom kan CSD-stresseffekten äventyras om kontrollgruppen oavsiktligt stressas. Detta kan bero på att kontrollgruppen utsätts för stressinducerade lukter och vokaliseringar från behandlingsgruppen under de 10 behandlingsdagarna samt att kontrollgruppen bevittnar behandlingen31. Därför är det lämpligt att hålla kontrollgruppen och behandlingsgruppen inrymda i olika rum. På grund av involveringen av betingad inlärning15är vissa steg avgörande för att få testresultat efter behandling som liknar dem som beskrivs här. Detta inkluderar att utföra behandlingen på unga vuxna i 10 dagar samt att utföra efterbehandlingstestet 24 timmar efter vila (se steg 2.1 i protokollet). Betingad inlärning kan vara annorlunda hos yngre (eller äldre) möss. På samma sätt innebär att behandlingen utförs i mer eller mindre än 10 dagar mer eller mindre konditionering av djuret. Förändringar i behandlingstiden kan resultera i olika subgruppsstorlekar. Dessutom är det tillrådligt att det inom samma försök antingen är samma försöksledare som utför behandlingen och efterbehandlingstestet på alla djur eller att det finns en åtskillnad mellan försöksledare som utför behandlingen och de som utför efterbehandlingstestet som är likartat på alla djur. Detta beror på att försöksledaren eller försöksledarna utgör en del av den övergripande konditioneringen (CSD-behandling) och testningen (socialt hot-säkerhetstest efter behandling) för djuret. Således bör alla djur i samma försök exponeras för samma sammanhang under hela försöket. Dessutom kan djurens beteende under efterbehandlingstestet förväxlas av luktsignaler32. Rengöring med 5 % etanol mellan djuren standardiserar luktsignalerna. Undvik dock rengöring mellan de två faserna av efterbehandlingstestet (tillvänjning och testning) hos samma djur. Detta beror på att tillvänjningsfasen delvis är avsedd att göra djuret bekant med arenan så att djurets beteende under testfasen huvudsakligen drivs av den nya närvaron av de nya sociala målen. Rengöring mellan de två faserna kan alltså äventyra de luktsignaler som djuret markerat under tillvänjningsfasen, vilket gör arenan mindre bekant under testfasen av efterbehandlingstestet33. Dessutom är det att föredra att ha fyra näthöljen per arena, varav två hänförs till tillvänjningsfasen (används alltid tomma) och två till testfasen (används alltid med de sociala målen), för att släcka den potentiella kvarvarande lukten från de sociala målen CD-1 och 129/Sv i näthöljena från testfasen till tillvänjningsfasen. Eliminering av kvarvarande lukt i nätinhägnaden är avgörande eftersom det kan påverka djurets utforskning av nätinhägnaderna under tillvänjningsfasen, vilket förändrar resultaten av indexet för social interaktion och därmed uppdelningen av behandlingsgruppen i tre undergrupper33. På samma sätt är det tillrådligt att tilldela specifika sociala mål för efterbehandlingstestet och hålla dem under liknande förhållanden när de inte används. Detta beror på att involvering av ett socialt mål i andra behandlingar och tester kan påverka beteendet hos respektive mål i näthöljet under efterbehandlingstestet. Till exempel, att använda det sociala målet CD-1 i andra experiment som boende för CSD-behandling kan ändra dess aggressionsnivåer i förhållande till 129/Sv när det används i det sociala hot-säkerhetstestet efter behandling. Skillnader i aggressionsnivåer kan signalera olika signaler till djuret av intresse under testet efter behandlingen, vilket skapar en preferentiell bias som inte tillskrivs betingad inlärning från de 10 dagarnas behandling. Således kan båda sociala mål som har liknande erfarenheter före användning i efterbehandlingstestet hjälpa till att standardisera beteendet och signalerna för båda när de befinner sig i näthöljet. En annan åtgärd för att undvika implikationer av en preferens är att använda äldre och större sociala mål än djuret i fråga15, som bekräftar huvudsignalen som de karakteristiska egenskaperna hos stammen, inte åldern eller storleken. För detta ändamål används 129/Sv-stammen för att kontrastera CD-1- och C57BL6/J-stammarna i efterbehandlingstestet. 129/Sv-stammen har en annan pälsfärg än båda. Det skulle vara av intresse att testa olika stammar av olika pälsfärger och se hur resultaten i efterbehandlingstestet påverkas15.
Kroniskt socialt nederlag är en av de mest robusta modellerna för posttraumatiskt stressyndrom, depression och andra stressrelateradesjukdomar. Den har utmärkt etiologisk-35, prediktiv-, diskriminativ-, farmakologisk- och ansiktsvaliditet 8,36. Härbeskrivs ett modifierat CSD-protokoll i hanmöss som introducerades av van Der Kooji och kollegor och som syftar till att stärka den psykosociala komponenten av den inducerade stressen. Fenotypen för socialt undvikande är robust, tillförlitlig och lätt testbar och har etologisk relevans och stark ansiktsvaliditet34. Till skillnad från andra tester för social interaktion9 möjliggör STST samtidig bedömning av social undvikandeutveckling och social hot-säkerhetsdiskrimineringsförmåga16. Resultaten från STST används för att identifiera stresskänsliga och stresståliga undergrupper inom en enda grupp av kroniskt socialt besegrade möss, vilket är i linje med bevisen hos människor som karakteriserar motståndskraftiga individer med hot-säkerhetsdiskriminering och mottagliga individer med aversiv responsgeneralisering16. Denna klassificering kan följas av experimentella manipulationer för att hjälpa till att reda ut den neurala grunden för stresstålighet och känslighet i allmänhet och specifikt för hot-säkerhetsdiskriminering kontra generalisering av aversiv respons16,37. Trots årtionden av forskning och vissa förbättringar i behandlingen är stressrelaterade psykiska störningar fortfarande vanliga hos människor. Men genom att fokusera på heterogenitet mellan olika individer som svar på samma stressfaktor sker ett paradigmskifte från att bedriva enbart sjukdomsorienterad forskning till att bedriva sjukdoms- och hälsoinriktad forskning samtidigt. Detta paradigmskifte kan bidra till att utveckla nya förebyggande38,39 metoder och identifiera förbättrade riktade behandlingsstrategier.
En begränsning med modellen är att endast hanar undersöktes. Eftersom STST är baserad på CSD-modellen, som utvecklades baserat på hanmössens beteende i naturen40, bedömdes inte testet för dess kompatibilitet med honmöss. Ett kompatibelt test med honmöss skulle vara ett som följer en stressbehandling som skapats antingen på båda könen eller endast på honor. Ytterligare studier behövs för att utvidga dessa rapporterade fynd från han- till honmöss. Dessutom är de förväntade resultaten som rapporteras här från unga vuxna möss. Det skulle öka vår förståelse att veta hur (om) resultaten förändras genom att använda olika åldrar. Värt att notera är att en nyligen genomförd studie fann att socialt undvikande beteende efter CSD är likartat mellan möss i olika åldersgrupper41. På samma sätt är andra variabler som ska beaktas behandlingstiden, om den skiljer sig från 10 dagar, och tiden för beteendeanalys, om den utförs mer än 24 timmar efter vila. Sammantaget förfinar modellen avsevärt de musmodeller som för närvarande används för stresskänslighet/resiliens och bidrar till att främja framtida translationella metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Collaborative Research Center 1193, delprojekt Z02, finansierat av den tyska nationella forskningsstiftelsen (SFB1193, Neurobiology of Resilience) och Boehringer Ingelheim Foundation (anslag till Leibniz Institute for Resilience Research and Individual Phenotyping and High-Resolution Automated Behavioural Analysis). Vi vill tacka Dr. Konstantin Radyushkin och Mrs. Sandra Reichel för deras tekniska assistans samt Mrs. Hanna Kim för hennes engelska språkstöd. Finansiärerna var inte inblandade i utformningen av modellen. insamling, analys och tolkning av data; vid utarbetandet av protokollet. och i beslutet att överlämna protokollet för offentliggörande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arenas | Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x 40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors |
| Camera for video recording | Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg |
ace Classic acA1300-60gc |
If using automatic detection program, make sure cameras are compatible |
| Camera objective | KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv |
Part-No. 10504 | |
| Detection program/Timer | Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/ethovision-xt | Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically |
| Housing cages | ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel |
3010010 | Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C |
| Mesh enclosures | Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol) |
| Mesh wall | selfmade | N/A | Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact |
| Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders | Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl |
Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl | CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice |
References
- Hyman, S. E. How mice cope with stressful social situations. Cell. 131 (2), 232-234 (2007).
- Kessler, R. C. The effects of stressful life events on depression. Annual Review of Psychology. 48 (1), 191-214 (1997).
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 301 acute and chronic diseases and injuries in 188 countries, 1990-2013: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study, 2013. The Lancet. 386 (9995), 743-800 (2015).
- Björkqvist, K. Social defeat as a stressor in humans. Physiology & Behavior. 73 (3), 435-442 (2001).
- Blanchard, R. J., McKittrick, C. R., Blanchard, D. C. Animal models of social stress: effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiology & Behavior. 73 (3), 261-271 (2001).
- Singleton, G. R., Krebs, C. J. Chapter 3- The Secret World of Wild Mice. The Mouse in Biomedical Research. American College of Laboratory Animal Medicine. The Mouse in Biomedical Research (Second Edition). 1, Academic Press. 25-51 (2007).
- Kondrakiewicz, K., Kostecki, M., Szadzińska, W., Knapska, E. Ecological validity of social interaction tests in rats and mice. Genes, Brain, and Behavior. 18 (1), e12525 (2019).
- Martinez, M., Calvo-Torrent, A., Pico-Alfonso, M. A. Social defeat and subordination as models of social stress in laboratory rodents: a review. Aggressive Behavior: Official Journal of the International Society for Research on Aggression. 24 (4), 241-256 (1998).
- Golden, S. A., Covington III, H. E., Berton, O., Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nature Protocols. 6 (8), 1183 (2011).
- van der Kooij, M. A., et al. Chronic social stress-induced hyperglycemia in mice couples individual stress susceptibility to impaired spatial memory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), E10187-E10196 (2018).
- Chartier, M. J., Walker, J. R., Stein, M. B.
- Cohen, H., Zohar, J., Matar, M. A., Kaplan, Z., Geva, A. B. Unsupervised fuzzy clustering analysis supports behavioral cutoff criteria in an animal model of post-traumatic stress disorder. Biological Psychiatry. 58 (8), 640-650 (2005).
- Scharf, S. H., Schmidt, M. V. Animal models of stress vulnerability and resilience in translational research. Current Psychiatry Reports. 14 (2), 159-165 (2012).
- Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
- Ayash, S., Schmitt, U., Müller, M. B. Chronic social defeat-induced social avoidance as a proxy of stress resilience in mice involves conditioned learning. Journal of Psychiatric Research. 120, 64-71 (2020).
- Ayash, S., et al. Fear circuit-based neurobehavioural signatures mirror resilience to chronic social stress in mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (17), e2205576120 (2023).
- Duits, P., et al. Updated meta-analysis of classical fear conditioning in the anxiety disorders. Depression and Anxiety. 32 (4), 239-253 (2015).
- Coifman, K. G., Bonanno, G. A., Rafaeli, E. Affect dynamics, bereavement, and resilience to loss. Journal of Happiness Studies. 8 (3), 371-392 (2007).
- Waugh, C. E., Thompson, R. J., Gotlib, I. H. Flexible emotional responsiveness in trait resilience. Emotion. 11 (5), 1059 (2011).
- Bonanno, G. A. Loss, trauma, and human resilience: Have we underestimated the human capacity to thrive after extremely aversive events. American Psychologist. 59 (1), 20 (2004).
- Bonanno, G. A.
- Yehuda, R., Flory, J. D., Southwick, S., Charney, D. S. Developing an agenda for translational studies of resilience and vulnerability following trauma exposure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1071 (1), 379-396 (2006).
- Grillon, C., Morgan III, C. A. Fear-potentiated startle conditioning to explicit and contextual cues in Gulf War veterans with post-traumatic stress disorder. Journal of Abnormal Psychology. 108 (1), 134 (1999).
- Brewin, C. R. A cognitive neuroscience account of post-traumatic stress disorder and its treatment. Behaviour Research and Therapy. 39 (4), 373-393 (2001).
- Milad, M. R., Rauch, S. L., Pitman, R. K., Quirk, G. J. Fear extinction in rats: implications for human brain imaging and anxiety disorders. Biological Psychology. 73 (1), 61-71 (2006).
- Jovanovic, T., Norrholm, S. D. Neural mechanisms of impaired fear inhibition in post-traumatic stress disorder. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 5, 44 (2011).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. The Veterinary Record. 116 (6), 431-436 (1985).
- Goldsmith, J. F., Brain, P. F., Benton, D. Effects of the duration of individual or group housing on behavioural and adrenocortical reactivity in male mice. Physiology & Behavior. 21 (5), 757-760 (1978).
- Cairns, R. B., Hood, K. E., Midlam, J. On fighting in mice: Is there a sensitive period for isolation effects. Animal Behaviour. 33 (1), 166-180 (1985).
- Varlinskaya, E. I., Spear, L. P., Spear, N. E. Social behavior and social motivation in adolescent rats: role of housing conditions and partner's activity. Physiology & Behavior. 67 (4), 475-482 (1999).
- Sial, O. K., Warren, B. L., Alcantara, L. F., Parise, E. M., Bolaños-Guzmán, C. A. Vicarious social defeat stress: Bridging the gap between physical and emotional stress. Journal of Neuroscience Methods. 258, 94-103 (2016).
- Brown, R. E. The rodents II. Suborder Myomorpha. [In: Social Odours in Mammals]. Brown, R. E., Macdonald, D. W. 1, Oxford University Press. Oxford. (1985).
- Haney, M., Miczek, K. A. Ultrasounds during agonistic interactions between female rats (Rattus norvegicus). Journal of Comparative Psychology. 107 (4), 373 (1993).
- Warren, B. L., et al. Neurobiological sequelae of witnessing stressful events in adult mice. Biological Psychiatry. 73 (1), 7-14 (2013).
- Malatynska, E., Knapp, R. J. Dominant-submissive behavior as models of mania and depression. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 715-737 (2005).
- Avgustinovich, D. F., Kovalenko, I. L., Kudryavtseva, N. N. A model of anxious depression: persistence of behavioral pathology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 35 (9), 917-924 (2005).
- Vennin, C., et al. A resilience related glial-neurovascular network is transcriptionally activated after chronic social defeat in male mice. Cells. 11 (21), 3405 (2022).
- Ayash, S., Schmitt, U., Lyons, D. M., Müller, M. B. Stress inoculation in mice induces global resilience. Translational Psychiatry. 10 (1), 200 (2020).
- Yuan, R., et al. Long-term effects of intermittent early life stress on primate prefrontal-subcortical functional connectivity. Neuropsychopharmacology. 46 (7), 1348-1356 (2021).
- Lyons, D. M., Ayash, S., Schatzberg, A. F., Müller, M. B. Ecological validity of social defeat stressors in mouse models of vulnerability and resilience. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 145, 105032 (2023).
- Oizumi, H., et al. Influence of aging on the behavioral phenotypes of C57BL/6J mice after social defeat. PLoS One. 14 (9), e0222076 (2019).
