Summary
사회적 위협-안전 테스트는 혐오적 조건 학습 및 사회적 위협-안전 차별 능력의 측정으로서 사회적 회피 발달을 동시에 평가할 수 있으며, 둘 다 만성적으로 사회적으로 패배한 수컷 쥐의 단일 그룹 내에서 스트레스에 취약하고 스트레스 탄력적인 개인을 식별하는 데 사용됩니다.
Abstract
사회적 스트레스는 정신 장애 발병의 주요 원인이다. 전임상 연구의 중개 가치를 높이려면 사회적 스트레스 경험과 마우스에 대한 행동 영향이 인간과 비슷해야 합니다. 만성 사회적 패배(CSD)는 신체적 공격과 감각적 위협을 수반하는 일종의 사회적 스트레스를 활용하여 인간의 정서 장애와 유사한 정신 기능 장애를 유발합니다. CSD의 심리사회적 요소를 강화하기 위해 10일 CSD 프로토콜을 적용했는데, 이 프로토콜은 매일의 신체적 공격을 3번의 10초 에피소드로 표준화한 후 24시간 감각 단계를 수행했습니다. 10번째 감각 단계 후, CSD 프로토콜은 사회적 위협-안전 테스트(STST)라고 하는 정교한 행동 분석이 뒤따릅니다. 스트레스 후 행동 분석은 사회적 스트레스 요인이 행동에 어떻게 그리고 어느 정도 영향을 미쳤는지 결정해야 합니다. STST는 만성적으로 사회적으로 패배한 수컷 마우스가 2개의 새로운 수컷 개체(사회적 표적)와 상호 작용할 수 있도록 합니다: 하나는 CSD 기간 동안 발생한 공격 균주의 사회적 표적이고 다른 하나는 새로운 균주의 사회적 표적입니다. 둘 다 3개의 챔버가 있는 테스트 경기장의 다른 구획에서 동시에 제공됩니다. 이 테스트를 통해 사회적 회피 발달을 동시에 평가하여 성공적인 혐오 조건 학습과 사회적 위협-안전 차별 능력을 측정할 수 있습니다. 두 균주에 대한 사회적 회피의 발달은 일반화된 혐오 반응을 반영하며, 따라서 스트레스 감수성의 측정을 반영합니다. 한편, 공격하는 변종에 대한 사회적 회피의 발달은 위협-안전 차별을 반영하며, 따라서 스트레스 회복력의 척도이다. 마지막으로, 공격하는 변종에 대한 사회적 회피의 부재는 손상된 혐오적 조건학습을 반영한다. 이 프로토콜은 만성적으로 사회적으로 패배한 동물의 단일 그룹을 회복력과 감수성 하위 그룹으로 분류하기 위해 번역 기준, 특히 위협-안전 차별 및 혐오적 반응 일반화를 포함하여 현재 사용되는 스트레스 감수성/회복력 마우스 모델을 개선하여 궁극적으로 미래의 번역 접근 방식을 발전시키는 것을 목표로 합니다.
Introduction
스트레스는 신체적 또는 심리적 자극에 의해 야기되는 항상성의 붕괴로 정의된다1. 스트레스는 외상 후 스트레스 장애, 우울증 및 불안과 같은 정신 장애 발병의 주요 위험 요인으로 잘 알려져 있습니다 2,3. 특히 사회적 스트레스는 스트레스 관련 정신질환 발병의 주요 위험인자로 꼽힌다4. 연구에서 특히 중요시되고 있는 사회적 스트레스의 한 유형은 사회적 종속 스트레스(social subordination stress)5이다. 생쥐는 인간과 마찬가지로 다양한사회적 행동6을 할 수 있어 사회적 스트레스와 관련된 연구에 적합하다. 실험실 환경에서 성인 쥐가 집단 수용 될 때, 그들은 랭크7의 형성과 관련된 사회 구조를 확립합니다. 따라서, 콜로니 모델은 생쥐의 혼성 집단에서 자연적으로 확립된 사회적 위계의 효과를 연구하기 위해 고안되었다8. 수년에 걸쳐 사회적 종속 스트레스를 활용하기 위해 동성 그룹 모델, 사회적 불안정 모델 및 침입자-식민지 모델을 포함한 식민지 모델의 변형이 개발되었습니다. 그러나 최근 몇 년 동안 남성 거주자-침입자 모델로 알려진 특정 변형이 문헌에서 대중화되어 사회적 복잡성을 거주자와 침입자라는 두 마리의 쥐로 단순화했습니다. 침입자로 알려진 관심 동물은 거주자 또는 침략자로 알려진 더 크고 나이가 많고 은퇴 한 사육자의 케이지에 배치됩니다. 그런 다음 거주자는 대결의 방법으로 침입자를 물리적으로 공격하여 거주자가 지배적이고 침입자가 종속되는 사회적 위계를 설정합니다. 대립이 일회성 사건일 때 "급성"("급성 사회적 패배 모델")으로 분류되는 반면, 며칠(보통 10일)에 걸쳐 반복되는 대립은 "만성"("만성적 사회적 패배 모델")으로 알려져 있습니다. 만성 사회적 패배(CSD) 모델에서 공격은 간헐적이며 일반적으로 물리적 단계라고 하는 5-10분9의 기간으로 제한됩니다. 물리적 단계 이후, 침입자와 거주자는 같은 우리에서 하룻밤을 보내고, 그물망 벽으로 반으로 분리되어 신체적 접촉을 제외한 모든 형태의 상호 작용이 허용된다. 감각 단계(sensory phase)로 알려진 이 구성은 직접적인 물리적 대결 대신 위협의 지속적인 출현을 통해 스트레스를 유발한다. 2018년, van der Kooji와 동료들은 신체적 단계10을 표준화하고 엄격하게 제한함으로써 모델의 심리사회적 요소에 초점을 맞추기 위해 수정된 만성 사회적 패배 치료법을 도입했습니다. 수정된 모델은 신체적 공격을 감각 단계의 에피소드 간 15분 간격으로 발생하는 서로 다른 거주자와의 10초 에피소드 3회로 제한합니다. 세 번째 신체 에피소드 이후, 감각 단계는 밤새 지속됩니다. 이 주기는 에피소드당 새로운 거주자와 함께 10일 연속으로 반복됩니다. 수정된 치료법은 침입자의 신체적 피해가 최소화되고 물리적 공격의 차등 기간으로 인한 결과 변동성이 감소함에 따라 만성적인 사회적 패배 모델의 번역적 타당성을 향상시킵니다.
CSD 모델은 스트레스 관련 질병(예: 우울증, 불안, 외상 후 스트레스 장애)을 연구하는 데 활용되기 때문에 공격성, 기억 및 무쾌감증의 행동 분석을 포함하되 이에 국한되지 않는 행동 후 분석이 선택됩니다. 최근 몇 년 동안, 생쥐를 대상으로 한 CSD 후 행동 분석은 종종 사회성이 어떻게 그리고 어느 정도 영향을 받는지를 평가한다9. 사교성은 사회적으로 동종 관계를 피하기보다는 사회적으로 상호 작용하려는 쥐의 타고난 선호로 정의됩니다. 사교성은 스트레스 효과의 영향을 받기 때문에 사회적 회피 발달만을 평가하는 분석법이 확립되었습니다. 스트레스로 인한 사회적 회피는 인간의 사회적 불안과 우울증의 주요 행동 증상 중 하나이기 때문에 번역적 관련성이 있다11. 인간과 마찬가지로 모든 쥐가 CSD 치료 후 사회적 회피를 발달시키는 것은 아니며, 이는 스트레스 반응에 개별성이 있음을 시사합니다. Cohen과 동료들은 개별성의 신경생물학을 연구하기 위한 유망한 접근법으로 컷오프 행동 기준을 제안했다12. 행동에 기초한 동물 선택은 집단 분열을 초래하며, 이는 유전자 환경 연구의 기초를 강조합니다. 그 후, 상이한 하위집단은 종종 특정 유전적 변이/변형의 뚜렷한 농축을 보여주며, 이는 차례로 상이한 환경 조건 하에서 조사될 수 있다13. 따라서, 사회적 회피 발달의 개성은 만성적으로 사회적으로 패배한 수컷 쥐의 단일 그룹을 스트레스 감수성(사회적으로 회피형)과 스트레스 탄력성(사회적으로 회피적이지 않음)의 두 하위 그룹으로 나누기 위해 활용되었습니다 9,14. 그러나 마우스의 사회적 회피 표현형을 부적응 또는 적응 행동으로 해석하는 것은 치료(여기서는 CSD) 및 치료 후 행동 분석의 전반적인 맥락에서 고려되어야 합니다. 또한, 치료 후 행동 분석은 사회적 회피 발달뿐만 아니라 사교성의 다른 측면을 이상적으로 평가할 수 있습니다. 우리의 최근 연구는 CSD로 인한 사회적 회피에 조건학습이 관여한다는 것을 밝혔다15. 구체적으로, CSD에 의한 사회적 회피는 무조건 자극에 대한 조건 자극, 즉 거주자의 공격으로 작용하는 거주자 긴장의 특성에 대한 혐오적 조건 반응입니다. 더욱이, 사회적으로 회피하는 하위 그룹 내에서 일부 개인은 혐오적인 거주자 균주의 특성과 다른 안전한 새로운 균주의 특성을 구별할 수 있는 반면, 다른 개인은 두 균주 모두에 대해 일반화된 사회적 회피를 보입니다. 여기서 우리는 CSD 이후 정교한 행동 분석인 사회적 위협-안전 테스트(STST)15를 제안합니다. 다른 사회적 상호작용 테스트9와 달리, STST는 올바른 혐오적 조건화 반응(즉, 성공적인 조건학습)과 사회적 위협-안전 차별 능력의 측정으로서 사회적 회피 발달을 동시에 평가할 수 있으며, 이 두 가지 모두 만성적으로 사회적으로 패배한 수컷 쥐의 단일 그룹 내에서 스트레스에 취약하고 스트레스 탄력적인 개인을 식별하는 데 활용된다. 사회적 위협-안전 차별 대 혐오적 대응 일반화에 대한 평가는 만성적으로 사회적으로 패배한 동물의 단일 그룹을 회복력 있고 감수성이 있는 하위 그룹으로 분류하는 데 사용되는 번역 기준을 확장합니다.
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Protocol
모든 절차는 실험 절차를 위한 동물의 관리 및 사용에 관한 유럽 공동체 이사회 지침에 따라 수행되었으며 지역 당국(Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz)의 승인을 받았습니다. 그림 1 은 도식 타임라인을 나타냅니다.
1. 시술
- 관심 동물: 생후 7주에 C57BL6/J 수컷 마우스를 확보하고, 도착 시 12시간 연한 주기(점등: 8:00, 소등: 20:00, 23°C, 습도 38%)로 온도 및 습도 조절 시설의 단독주택에서 음식과 물을 즉시 섭취합니다.
- 만성적인 사회적 패배(CSD)
- 치료군
- 1주일 동안 습관화한 후, CD-1 균주를 레지던트 균주로 사용하여 10일 연속으로 CSD 치료를 시행한다(자세한 프로토콜은 만성 사회적 패배 치료9 및 수정된 만성 사회적 패배 치료10 참조).
- C57BL6/J 마우스를 CD-1 마우스의 케이지에 넣고 10초의 물리적 공격을 계산합니다. 각각 다른 CD-1 마우스를 사용하여 이 에피소드를 세 번 반복하고 에피소드 간 간격을 15분씩 분리합니다.
- 이 간격 동안 C57BL6/J 마우스와 CD-1 마우스 사이에 메쉬 벽을 배치하여 감각 접촉만 허용합니다. 세 번째 에피소드 이후, C57BL6/J 마우스를 CD-1 마우스의 케이지에 밤새 가두고, 둘 다 그물망 벽으로 분리한다. 10일 동안 반복합니다.
알림: CD-1 마우스 번호 = C57BL6/J 마우스 번호 + 1. C57BL6/J 처리 마우스의 수가 10개 미만인 경우, 치료 10일 동안 매일 마지막 감각 단계(밤새 지속)가 새 CD-1 마우스와 함께 하도록 하기 위해 최소 10개의 CD-1 마우스가 여전히 필요합니다. - 10일 동안 동물의 신체적 웰빙을 주의 깊게 평가합니다. 동물이 심각한 부상을 입은 경우 윤리적, 과학적(치료 후 테스트 중 이동성/활동성)을 이유로 실험에서 제외합니다. 표 1 은 웰빙 체크리스트를 제공합니다.
- 대조군
- 도착 시 치료 그룹과 동일한 조건에서 같은 연령의 마우스를 유지합니다.
- 1주일 동안 습관화한 후 빈 케이지에 90초 동안 대조군을 투입한 다음 치료군에 사용된 것과 동일한 메쉬 벽으로 반으로 분리된 개별 케이지(단일 사육)로 되돌립니다. 10일의 치료일과 병행하여 매일 이 작업을 수행하십시오.
알림: 대조군과 치료군은 서로 다른 방에 보관하는 것이 좋습니다.
- 치료군
- 마지막(10번째) 감각 단계가 끝나면 모든 쥐를 도착 시 설명된 것과 유사한 조건의 새 케이지에 한 마리씩 가두고 하룻밤 동안 휴식을 취하도록 합니다.
알림: 마지막 감각 단계는 24시간 동안 지속되어야 하며 동물은 단일 주택입니다.
2. 치료 후 검사: 사회적 위협-안전성 검사(그림 2)
- CSD 처리 후, 모든 마우스(치료군 및 대조군)를 도착 시 설명된 것과 유사한 조건의 새 케이지에 단일 사육하고 하룻밤 동안 휴식을 취하도록 둡니다.
- 아침 시간(8:00-13:30)에는 3개의 챔버가 있는 경기장(총 크기 60cm x 40cm의 직사각형 모양, 투명 아크릴 벽과 매끄러운 바닥으로 제작)을 5% 에탄올로 청소하고 37lux의 조명 조건에서 카메라 아래에 놓습니다. 전체 경기장이 보이는지 확인합니다.
- 메쉬 인클로저(금속 또는 아크릴로 만든 케이지 모양)를 5% 에탄올로 청소하고 그림 1A의 모서리에 표시된 대로 배치합니다.
- 적응 단계: 관심 동물을 경기장 중앙에 배치하고 6분 동안 탐색한 다음 집으로 돌려보냅니다.
- 새로운(알 수 없는) CD-1 소셜 타겟(conspecific)을 하나의 메시 엔클로저 아래에 배치하고 새로운 129/Sv 소셜 타겟을 다른 메시 엔클로저 아래에 배치하십시오.
참고: 친숙성 편향을 피하기 위해 알 수 없는 129/Sv 동종어를 사용하는 것이 중요합니다. 경기장 당 4 개의 메쉬 인클로저가 바람직합니다 : 2 개는 습관화 단계에, 2 개는 테스트 단계에 기인합니다. - 실험 단계: 관심 동물을 경기장 중앙에 즉시 다시 배치하고 6분 동안 탐험을 허용합니다.
- 모든 동물을 집으로 돌려보냅니다. 다른 동물의 실험 사이에 5% 에탄올로 경기장과 메쉬 인클로저를 청소하되 동일한 동물을 관찰하는 동안, 즉 습관화와 실험 단계 사이에는 절대 청소하지 마십시오.
- 가능한 위치 우선 편향을 제어하기 위해 동물 간에 메시 인클로저의 위치를 번갈아 가며 사용합니다(동일한 동물 내의 두 단계 사이에는 절대 안 됨).
3. 채점 및 분석
알림: 스트레스 후 치료 테스트, 즉 STST만 점수가 매겨지고 분석됩니다(CSD 스트레스 치료는 제외).
- 상호 작용 영역을 메쉬 인클로저 경계 둘레의 2cm로 정의합니다.
- 동물의 코가 상호 작용 영역 내에 있을 때 습관화 단계 동안 메쉬 인클로저를 탐색하는 데 소요된 시간을 채점합니다.
- 동물의 코가 상호 작용 영역 내에 있을 때 테스트 단계에서 사회적 대상과 상호 작용하는 데 소요된 시간을 채점합니다.
알림: 감지는 수동으로(수동 채점을 위해 타이머 또는 소프트웨어 사용) 또는 자동으로 수행할 수 있습니다. 감지 방법에 관계없이 탐색 및 사회적 상호 작용 측정을 위해 코 지점을 취하고 활동 관련 측정(예: 이동 거리)을 위해 신체의 중심점을 사용합니다. - 테스트 단계에서 각 소셜 대상을 탐색하는 데 소요된 시간/습관화 단계에서 두 개의 빈 메시 인클로저를 탐색하는 데 소요된 평균 시간과 같이 사회적 상호 작용 지수를 계산합니다(그림 2B).
- 치료군을 다음과 같이 3개의 하위 그룹으로 나눈다: 사회적 상호작용 지수가 ≥1이고 CD-1 사회적 목표가 있는 동물은 회피하지 않는 동물이고, 사회적 상호작용 지수가 <1이고 사회적 목표가 모두 있는 동물은 무차별 회피자이고, 사회적 상호작용 지수가 129/Sv인 동물은 사회적 상호작용 ≥지수가 129/Sv인 동물이 차별적 회피자이다(그림 2C-D).
참고: 3개의 하위 그룹 각각에 속하는 동물의 수는 서로 다른 동물 배치 간에 다를 수 있습니다(CSD 처리를 받는 모든 동물의 약 1/3은 3개의 하위 그룹 중 하나의 표현형 특성을 나타냄). - 처리군과 대조군 간의 CD-1 사회적 목표와의 사회적 상호작용 지수를 통계적으로 분석하여 스트레스 효과를 평가합니다(모수적 2표본 t-검정 또는 비모수적 Mann-Whitney 검정).
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Representative Results
혐오적 조건 반응의 척도로서의 사회적 상호 작용 지수
사회적 상호 작용 지수 ≥1은 빈 메쉬 인클로저의 탐색과 비교하여 각 사회적 대상과의 더 큰 사회적 상호 작용을 반영합니다. 특정 균주의 특성화 형질에 대한 식욕 또는 혐오 경험이 없는 것으로 정의된 기준선 조건(여기서는 대조군에 대한 사회적 목표와 치료 그룹에 대한 129/Sv 사회적 목표 모두)에서 온전한 사교성 수준은 동일한 균주를 가진 사회적 상호 작용 지수≥1)에 반영됩니다. 한편, 특정 균주(여기서는 거주자의 균주, 즉 CD-1 균주)를 사용한 사회적으로 혐오적인 조건화 경험(여기서는 CSD 치료)에 이어 그 특성이 조건 자극으로 작용하는 특성과 함께, 올바른 혐오적 조건 반응의 측정으로서의 사회적 회피 발달은 동일한 균주를 가진 사회적 상호작용 지수<1)에 반영됩니다. CSD 스트레스 효과는 전체 치료 그룹 수준에서 가장 먼저 평가됩니다(프로토콜의 3.6단계 참조). 구체적으로, 스트레스 효과는 CD-1 균주에 대한 사회적 회피 발달의 척도로서 CD-1 사회적 목표와 사회적 상호작용 지수 <1을 갖는 치료군에 반영된다. 한편, 대조군의 온전한 기준 사교성 수준은 동일한 사회적 목표를 가진 사회적 상호작용 지수≥1)를 갖는 데 반영됩니다. 그 결과 두 그룹 간의 CD-1 사회적 대상과의 사회적 상호 작용 지수에서 상당한 차이(p < 0.05)가 발생합니다(그림 2C).
사회적 위협-안전성 테스트를 통해 만성적으로 사회적으로 패배한 단일 그룹 내에서 3개의 뚜렷한 표현형 하위 그룹 식별
프로토콜의 3.4 단계와 3.5 단계에서 설명한 바와 같이 사회적 상호 작용 지수를 기반으로 동물을 나눈 후, 두 사회적 대상 간의 단일 하위 그룹 내 지수의 유의미한 차이(p < 0.05)는 차별 회피자 하위 그룹 내에서만 발견됩니다(그림 2D, E). 차별 회피자 하위 그룹과 무차별 회피자 하위 그룹은 CD-1 사회적 목표와 사회적 상호 작용 지수<1, 조건 자극(CD-1 균주)에 대한 사회적 회피 발달의 척도를 가지며, 따라서 올바른 혐오 조건 반응의 발달과 성공적인 혐오 조건 학습의 발달을 반영합니다. 대조적으로, 비회피자 하위 그룹의 사회적 상호 작용 지수(≥1)는 동일한 사회적 목표(CD-1 균주)를 가진 손상된 혐오 조건 학습을 반영합니다. 한편, 위협-안전 차별 능력은 안전/중립적 자극(129/Sv 긴장)에 대한 온전한 사교성 수준의 척도로 사회적 상호작용 지수 ≥1과 129/Sv 사회적 목표를 갖는 차별-회피자 하위 그룹에 반영됩니다. 대조적으로, 무차별 회피자 하위 그룹의 혐오적 반응 일반화는 사회적 회피 측정과 동일한 사회적 목표를 가진 사회적 상호 작용 지수 <1을 갖는 데 반영되며, 따라서 안전/중립 자극에 대한 혐오적 조건 반응이 반영됩니다. 각 하위 그룹 내 마우스의 비율은 약 33%입니다. 그러나 일부 동물 배치는 각 하위 그룹에 더 많거나 적기 때문에 예측할 수 없습니다. 마지막으로, 잠재적 교란 요인으로서의 사회적 선호 편향의 부재는 통제 집단 내의 두 사회적 대상과의 사회적 상호작용 지수 ≥1(즉, p>0.05)에 반영됩니다.
사회적 위협-안전 테스트 결과의 해석
위협 관련 단서에 대한 성공적인 조건학습과 위협-안전 차별을 포함한 차별-회피자 하위집단의 특성은 스트레스 회복탄력성 개인의 특성으로 논의된다 16,17,18,19,20,21,22. 이와는 대조적으로, 무차별 회피자 하위집단에서 볼 수 있듯이 외상 사건 후 일반화된 혐오적 조건 반응은 외상 후 스트레스 장애 및 불안 장애와 같은 스트레스 관련 정신 장애의 주요 증상이다 16,17,23,24,25,26 따라서 스트레스에 취약한 개인의 특징입니다. 마지막으로, 회피하지 않는 하위 그룹은 학습 장애의 표현형을 나타낸다16.
그림 1: 도식 타임라인. 시설에 도착하면 모든 마우스를 7일 동안 단일 사육한 다음 CSD 스트레스 치료군 또는 취급 대조군 치료군으로 지정합니다. 치료는 10일 동안 지속되며, 그 후 동물은 1일 동안 단일 사육됩니다. STST를 수행할 경기장을 설정합니다(1일까지 동물을 한 마리로 사육한 후 진행). 6분 동안 습관화 단계부터 시작합니다. 습관화 단계를 즉시 수행하고 테스트 단계를 6분 더 진행합니다. 마지막으로, 동물들을 집으로 돌려보낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 사회적 위협-안전성 테스트. (A) 테스트 설계. 이 실험은 3개의 방이 있는 경기장에서 수행되며, 구멍이 있는 투명한 벽으로 분리된 3개의 동일한 부분으로 나뉘어 관심 동물(C57BL6/J, 검은색)이 그 사이를 이동할 수 있습니다. 각 원주에 하나의 메쉬 인클로저가 배치됩니다. 한 인클로저에는 CSD 치료 중 이전에 발생한 거주자의 균주에서 새로운 사회적 표적이 포함되어 있습니다(CD-1, 흰색). 다른 하나는 나이, 크기 및 성별이 일치하는 새로운 변종에서 거주자의 변종에서 새로운 모피 색상(129/Sv, 갈색)이 다른 새로운 쥐에 대한 새로운 사회적 표적을 포함합니다. 두 사회적 표적 모두 관심 동물보다 나이가 많고 몸집이 크다. 관심 동물은 경기장 중앙에 소개되며 메쉬 인클로저가 비었을 때 습관화 단계에서 6분 동안 투기장을 탐험할 수 있으며, 그림과 같이 사회적 표적이 메쉬 인클로저 안에 배치되는 테스트 단계에서 다시 한 번 투기장을 탐험할 수 있습니다. (B) 사회적 상호 작용 지수. 동물의 코가 상호 작용 영역(메쉬 인클로저 경계 둘레 2cm) 내에 있을 때 습관화 단계에서 메쉬 인클로저를 탐색하는 데 소요된 시간을 점수화합니다. 그런 다음 코가 상호 작용 영역 내에 있을 때 테스트 단계에서 사회적 대상과 상호 작용하는 데 소요된 시간을 채점합니다. 그림과 같이 사회적 상호 작용 지수를 계산합니다. (C) 만성적인 사회적 패배 스트레스 효과: 치료군은 CD-1 균주에 대한 사회적 회피 발달의 척도로서 CD-1 사회적 목표와 함께 사회적 상호작용 지수 <1을 가지고 있다. 한편, 대조군의 온전한 기준 사교성 수준은 동일한 사회적 목표를 가진 사회적 상호작용 지수≥1)를 갖는 데 반영됩니다. 그 결과 두 그룹 간의 CD-1 사회적 대상과의 사회적 상호 작용 지수에서 유의한 차이(p < 0.05)가 발생합니다. 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM), 그룹당 n=16, Mann-Whitney 검정으로 표시된 결과. (D) 만성적인 사회적 패배 치료 후 사회적 위협-안전성 검사 대표 결과. 치료 그룹은 사회적 대상과 동물의 사회적 상호 작용 지수에 따라 세 개의 하위 그룹으로 나뉩니다. CD-1 사회적 목표와 사회적 상호작용 지수가 ≥1인 마우스는 비회피자, 사회적 상호작용 지수가 <1이고 사회적 목표가 모두 있는 마우스는 무차별 회피자, 사회적 상호작용 지수가 129/Sv인 사회적 상호작용 지수≥1인 마우스는 차별적 회피자라고 합니다. 대조군은 두 사회적 대상과 유사한 지수를 가지고 있습니다. 결과는 SEM± 평균으로 표시되며, 하위 그룹/그룹당 n = 55입니다. (E) STST의 테스트 단계 동안 각 하위/그룹의 대표 히트맵. 어두운 색상은 해당 지역에서 더 많은 시간을 보냈음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 만성적인 사회적 패배 절차에 대한 중단 기준. 이 표는 총 4개의 관측치 군을 나타내며, 각 군에는 여러 개의 하위 관측치(27)가 있다. 각 관측치에는 점수가 있습니다. 점수의 합에 따라 취해야 할 조치가 표시됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 행동 프로토콜은 CSD 치료 후 단일 그룹을 세 개의 다른 하위 그룹으로 나누는 데 사용되는 사회적 위협-안전 테스트를 설명하며, 스트레스 감수성 및 회복력의 기본 생물학을 조사하고 잠재적인 치료법을 테스트하는 방법 역할을 합니다. 철저한 실험 설계를 안내하기 위해 생물학적 맥락과 기술적 세부 사항을 신중하게 고려해야 합니다.
다양한 주거 환경에 따라 공격성 사교성 수준이 달라질 수 있으며, 이는 치료 후 검사에서 얻은 결과에 영향을 미칠 수 있습니다28,29,30. 이러한 조건에는 도착 시 및 치료 후 테스트 24시간 전에 모든 동물을 단일 수용하는 것과 치료 10일 동안 대조군을 단일 수용하는 것이 포함됩니다. 더욱이, CSD 스트레스 효과는 대조군이 우발적으로 스트레스를 받는 경우 손상될 수 있습니다. 이는 치료 10일 동안 대조군과 치료를 목격한 대조군의 스트레스로 인한 냄새와 발성에 노출되어 발생할 수 있습니다31. 따라서 대조군과 치료군은 서로 다른 방에 보관하는 것이 좋습니다. 또한 조건 학습의 참여로 인해15, 특정 단계는 여기에 설명된 것과 유사한 치료 후 테스트 결과를 얻는 데 중요합니다. 여기에는 10일 동안 젊은 성인에게 치료를 수행하고 휴식 후 24시간 후에 치료 후 테스트를 수행하는 것이 포함됩니다(프로토콜의 2.1단계 참조). 조건 학습은 더 어린(또는 더 오래된) 쥐에서 다를 수 있습니다. 유사하게, 10일 이상 또는 미만 동안 치료를 수행하는 것은 각각 동물의 컨디셔닝을 어느 정도 의미합니다. 처리 기간의 변화로 인해 부분군 크기가 달라질 수 있습니다. 또한, 동일한 실험 내에서 동일한 실험자가 모든 동물에 대해 처리 및 처리 후 시험을 수행하거나, 처리를 수행하는 실험자와 모든 동물에서 유사한 처리 후 시험을 수행하는 실험자 사이에 분리가 있는 것이 좋습니다. 이는 실험자가 동물에 대한 전반적인 조건화(CSD 치료) 및 테스트(사회적 위협-안전 치료 후 테스트) 맥락의 일부를 나타내기 때문입니다. 따라서 동일한 실험에 참여한 모든 동물은 실험 전반에 걸쳐 동일한 맥락에 노출되어야 합니다. 또한 처리 후 테스트 중 동물의 행동은 냄새 신호에 의해 혼동될 수 있습니다32. 동물 사이에 5% 에탄올로 청소하면 냄새 단서가 표준화됩니다. 그러나 동일한 동물을 대상으로 한 처리 후 테스트(습관화 및 테스트)의 두 단계 사이에 청소하지 마십시오. 이는 습관화 단계가 부분적으로 동물이 경기장에 익숙해지도록 의도되어 테스트 단계에서 동물의 행동이 주로 새로운 사회적 대상의 새로운 존재에 의해 주도되기 때문입니다. 따라서 두 단계 사이의 청소는 습관화 단계에서 동물이 표시하는 냄새 신호를 손상시켜 처리 후 테스트의 테스트 단계에서 경기장을 덜 친숙하게 만들 수 있습니다33. 더욱이, 경기장 당 4 개의 메쉬 인클로저를 갖는 것이 바람직하며, 그 중 2 개는 습관화 단계 (항상 비어 있음)에 기인하고 2 개는 테스트 단계 (항상 사회적 대상과 함께 사용됨)에 기인하여 테스트 단계에서 습관화 단계까지 메쉬 인클로저의 잠재적 인 잔류 냄새를 소멸시킵니다. 메쉬 인클로저의 잔류 냄새를 제거하는 것은 습관화 단계에서 동물의 메쉬 인클로저 탐색에 영향을 미쳐 사회적 상호 작용 지수 결과를 변경하여 치료 그룹을 세 개의 하위 그룹으로 나눌 수 있기 때문에 중요합니다33. 마찬가지로, 치료 후 검사에 대한 특정 사회적 목표를 부여하고 사용하지 않을 때는 유사한 조건에서 유지하는 것이 좋습니다. 이는 다른 처리 및 테스트에 하나의 사회적 대상을 포함하면 처리 후 테스트 중에 메쉬 인클로저에서 각 대상의 동작에 영향을 줄 수 있기 때문입니다. 예를 들어, 다른 실험에서 CD-1 사회적 표적을 CSD 치료를 위한 레지던트로 사용하면 사회적 위협-안전 치료 후 테스트에 사용될 때 129/Sv에 대한 공격성 수준을 변경할 수 있습니다. 공격성 수준의 차이는 치료 후 테스트 중에 관심 동물에게 다른 신호를 보낼 수 있으며, 치료 10일 동안의 조건 학습에 기인하지 않는 선호 편향을 생성할 수 있습니다. 따라서 치료 후 테스트에서 사용하기 전에 유사한 경험을 가진 두 사회적 대상은 메쉬 인클로저에 있는 동안 둘 다의 행동과 신호를 표준화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특혜 편향의 의미를 피하기 위한 또 다른 조치에는 관심 동물보다 더 오래되고 더 큰 사회적 표적을 사용하는 것이 포함됩니다15, 주요 단서를 연령이나 크기가 아닌 균주의 특성으로 확인합니다. 이를 위해 치료 후 테스트는 CD-1 및 C57BL6/J 균주를 대조하기 위해 129/Sv 균주를 사용합니다. 129/Sv 균주는 둘 다와 다른 모피 색상을 가지고 있습니다. 다양한 모피 색상의 다양한 균주를 테스트하고 치료 후 테스트의 결과가 어떻게 영향을 받는지 확인하는 것이 흥미로울 것입니다15.
만성 사회적 패배는 외상 후 스트레스 장애, 우울증 및 기타 스트레스 관련 질병에 대한 가장 강력한 모델 중 하나이다34. 그것은 우수한 병인학적-35, 예측적, 판별적-, 약리학적- 및 얼굴 타당도 8,36을 가지고 있습니다. 여기에서, 유발된 스트레스의 심리사회적 요소를 강화하는 것을 목표로 하는 van Der Kooji와 동료들에 의해 도입된 수컷 마우스의 수정된 CSD 프로토콜이 기술되어 있다10. 사회적 회피 표현형은 견고하고 신뢰할 수 있으며 쉽게 테스트할 수 있으며 행동학적 관련성과 강력한 얼굴 타당성을 가지고 있습니다34. 다른 사회적 상호작용 검사9와 달리, STST는 사회적 회피 발달과 사회적 위협-안전 차별 능력16을 동시에 평가할 수 있다. STST의 결과는 만성적으로 사회적으로 패배한 쥐의 단일 그룹 내에서 스트레스에 민감하고 스트레스 탄력적인 하위 그룹을 식별하는 데 활용되며, 이는 위협-안전 차별을 가진 회복력 있는 개인과 혐오적 반응 일반화를 가진 감수성 개인을 특징짓는 인간의 증거와 일치한다16. 이러한 분류는 스트레스 회복력과 감수성의 신경학적 기초를 밝히는 데 도움이 되는 실험적 조작이 뒤따를 수 있으며, 위협-안전 차별과 혐오적 반응 일반화에 특화될 수 있다16,37. 수십 년에 걸친 연구와 치료법의 특정 개선에도 불구하고 스트레스 관련 정신 장애는 여전히 인간에게 널리 퍼져 있습니다. 그러나 동일한 스트레스 요인에 대응하여 서로 다른 개인에 걸친 이질성에 초점을 맞추면 질병 중심의 연구만 수행하는 것에서 질병 중심의 연구와 건강 중심의 연구를 동시에 수행하는 것으로 패러다임이 전환되고 있습니다. 이러한 패러다임의 변화는 새로운 예방38,39 접근법을 개발하고 개선된 표적 치료 전략을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 모델의 한계는 남성만 조사했다는 것입니다. STST는 네이처(40)에서 수컷 마우스의 행동을 기반으로 개발된 CSD 모델을 기반으로 하기 때문에 테스트는 암컷 마우스와의 호환성에 대해 평가되지 않았습니다. 암컷 쥐와의 호환 가능한 테스트는 남녀 또는 암컷에게만 만들어진 스트레스 치료를 따르는 테스트입니다. 보고된 이러한 발견을 수컷에서 암컷 쥐로 확장하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 또한, 여기에 보고된 예상 결과는 젊은 성인 마우스에서 나온 것입니다. 다른 연대를 사용하여 발견이 어떻게 변하는지 아는 것은 우리의 이해에 도움이 될 것입니다. 주목할 만한 점은, 최근 연구에 따르면 CSD에 따른 사회적 회피 행동은 다른 연령대의 쥐 사이에서 유사하다는 것을 발견했다41. 마찬가지로, 고려해야 할 다른 변수는 치료 기간(10일과 다른 경우)과 행동 분석 시간(휴식 후 24시간 이상 수행된 경우)입니다. 전반적으로, 이 모델은 현재 사용되는 스트레스 감수성/회복력에 대한 마우스 모델을 실질적으로 개선하고 미래의 중개 접근법을 발전시키는 데 기여합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 독일 국립 연구 재단(SFB1193, 회복력 신경생물학)과 베링거 인겔하임 재단(라이프니츠 회복력 연구 및 개별 표현형 및 고해상도 자동 행동 분석 연구소 보조금)이 자금을 지원하는 공동 연구 센터 1193, 하위 프로젝트 Z02의 지원을 받습니다. 기술적인 도움을 주신 Dr. Konstantin Radyushkin과 Mrs. Sandra Reichel, 그리고 영어 지원을 해주신 Mrs. Hanna Kim에게 감사드립니다. 자금 출처는 모델 설계에 관여하지 않았습니다. 데이터 수집, 분석 및 해석; 의정서 작성; 그리고 출판을 위해 프로토콜을 제출하기로 결정했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arenas | Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x 40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors |
| Camera for video recording | Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg |
ace Classic acA1300-60gc |
If using automatic detection program, make sure cameras are compatible |
| Camera objective | KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv |
Part-No. 10504 | |
| Detection program/Timer | Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/ethovision-xt | Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically |
| Housing cages | ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel |
3010010 | Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C |
| Mesh enclosures | Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol) |
| Mesh wall | selfmade | N/A | Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact |
| Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders | Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl |
Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl | CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice |
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