Summary
La prueba de seguridad y amenaza social permite una evaluación simultánea del desarrollo de la evitación social como una medida del aprendizaje condicionado aversivo y la capacidad de discriminación de la seguridad y la amenaza social, ambas utilizadas para identificar individuos susceptibles al estrés y resistentes al estrés dentro de un solo grupo de ratones machos crónicamente derrotados socialmente.
Abstract
El estrés social es una de las principales causas del desarrollo de trastornos mentales. Para mejorar el valor traslacional de los estudios preclínicos, la experiencia de estrés social y su impacto conductual en ratones deben ser comparables a los humanos. La derrota social crónica (DCS) utiliza un tipo de estrés social que implica ataques físicos y amenazas sensoriales para inducir disfunciones mentales que se asemejan a los trastornos afectivos humanos. Para fortalecer el componente psicosocial de la DCS, se aplicó un protocolo de DCS de 10 días en el que se estandarizan las agresiones físicas diarias a tres episodios de 10 s seguidos de una fase sensorial de 24 h. Después de la10ª fase sensorial, el protocolo de CSD es seguido por un ensayo de comportamiento refinado llamado prueba de seguridad y amenaza social (STST). Los ensayos conductuales posteriores al estrés deben determinar cómo y en qué medida el factor de estrés social ha influido en el comportamiento. El STST permite a los ratones machos crónicamente derrotados socialmente interactuar con 2 nuevos individuos machos (objetivos sociales): un objetivo social de la cepa atacante encontrada durante los días de CSD y el otro de una nueva cepa. Ambos se presentan simultáneamente en diferentes compartimentos de un campo de pruebas de tres cámaras. La prueba permite una evaluación simultánea del desarrollo de la evitación social para medir el éxito del aprendizaje aversivo condicionado y la capacidad de discriminación social entre amenazas y seguridad. El desarrollo de la evitación social hacia ambas cepas refleja una respuesta aversiva generalizada y, por lo tanto, una medida de la susceptibilidad al estrés. Mientras tanto, el desarrollo de la evitación social hacia solo la cepa atacante refleja la discriminación entre amenazas y seguridad y, por lo tanto, una medida de la resiliencia al estrés. Por último, la ausencia de evitación social hacia la cepa atacante refleja un deterioro del aprendizaje aversivo condicionado. El protocolo tiene como objetivo refinar los modelos de susceptibilidad al estrés/resiliencia utilizados actualmente en ratones mediante la inclusión de criterios traslacionales, específicamente la discriminación de amenaza-seguridad y la generalización de la respuesta aversiva, para categorizar un solo grupo de animales crónicamente derrotados socialmente en subgrupos resilientes y susceptibles, avanzando eventualmente en futuros enfoques traslacionales.
Introduction
El estrés se define como la alteración de la homeostasis causada por estímulos físicos o psicológicos1. El estrés es un factor de riesgo importante bien conocido para el desarrollo de trastornos mentales como el trastorno de estrés postraumático, la depresión y la ansiedad 2,3. En particular, el estrés social se considera un factor de riesgo importante para el desarrollo de trastornos mentales relacionados con el estrés4. Un tipo de estrés social que ha cobrado especial importancia en la investigación es el estrés de subordinación social5. Los ratones, al igual que los humanos, son capaces de un rico conjuntode comportamientos sociales, lo que los hace adecuados para investigaciones relacionadas con el estrés social. En el laboratorio, cuando los ratones adultos se alojan en grupo, establecen una estructura social que implica la formación de rangos7. En consecuencia, el modelo de colonia fue diseñado para estudiar los efectos de las jerarquías sociales establecidas naturalmente en grupos de ratones mixtos8. A lo largo de los años, se han desarrollado variaciones del modelo de colonias para utilizar el estrés de subordinación social, incluidos los modelos de grupos del mismo sexo, el modelo de inestabilidad social y el modelo de colonias de intrusos. En los últimos años, sin embargo, se ha popularizado en la literatura una variante particular conocida como el modelo de residente-intruso macho, simplificando la complejidad social a dos ratones: un residente y un intruso. El animal de interés, conocido como intruso, se coloca en la jaula de un criador más grande, mayor y retirado, conocido como residente o agresor. Luego, el residente ataca físicamente al intruso como método de confrontación, estableciendo una jerarquía social en la que el residente es dominante y el intruso está subordinado. Cuando los enfrentamientos son eventos únicos, se clasifican como "agudos" (el "modelo de derrota social aguda"), mientras que los enfrentamientos repetidos que duran varios días (generalmente 10) se conocen como "crónicos" (el "modelo de derrota social crónica"). En el modelo de derrota social crónica (DCS), los ataques son intermitentes y, por lo general, se limitan a un período de 5 a 10 minutos9, denominado fase física. Después de la fase física, el intruso y el residente pasan la noche en la misma jaula, separados por la mitad con una pared de malla, lo que permite todas las formas de interacción excepto el contacto físico. Esta configuración, conocida como fase sensorial, induce estrés a través de la aparición continua de amenaza en lugar de la confrontación física directa. En 2018, van der Kooji y sus colegas introdujeron un tratamiento modificado de derrota social crónica para centrarse en el componente psicosocial del modelo mediante la estandarización y limitación estricta de la fase física10. El modelo modificado limita los ataques físicos a tres episodios de 10 s con diferentes residentes, que ocurren en intervalos de 15 minutos entre episodios de la fase sensorial. Después del tercer episodio físico, la fase sensorial dura toda la noche. Este ciclo se repite durante 10 días consecutivos con nuevos residentes por episodio. El tratamiento modificado mejora la validez traslacional del modelo de derrota social crónica, ya que se minimiza el daño físico del intruso y se reduce la variabilidad de los resultados a partir de las duraciones diferenciales de los ataques físicos.
Dado que el modelo CSD se utiliza para estudiar enfermedades relacionadas con el estrés (por ejemplo, depresión, ansiedad, trastorno de estrés postraumático), se eligen ensayos postconductuales, que incluyen, entre otros, ensayos conductuales de agresión, memoria y anhedonia. En los últimos años, los ensayos conductuales post-CSD en ratones a menudo evalúan cómo y en qué medida se ve afectada la sociabilidad9. La sociabilidad se define como la preferencia innata de los ratones por interactuar socialmente en lugar de evitar socialmente a un congéner. Dado que la sociabilidad está sujeta a los efectos del estrés, se establecieron ensayos que evalúan únicamente el desarrollo de la evitación social. La evitación social inducida por el estrés tiene una relevancia traslacional, ya que representa uno de los principales síntomas conductuales de la ansiedad social y la depresión en los seres humanos11. Al igual que los humanos, no todos los ratones desarrollan evitación social después del tratamiento con DCS, lo que sugiere la presencia de individualidad en la respuesta al estrés. Cohen y sus colegas han propuesto que los criterios conductuales de corte son un enfoque prometedor para el estudio de la neurobiología de la individualidad12. La selección de los animales basada en el comportamiento da lugar a la división del grupo, lo que subraya la base para los estudios gen-ambiente. Posteriormente, los diferentes subgrupos a menudo muestran un enriquecimiento distinto de variantes/modificaciones genéticas específicas, que a su vez pueden investigarse en diferentes condiciones ambientales13. En consecuencia, la individualidad en el desarrollo de la evitación social se utilizó para dividir el único grupo de ratones machos crónicamente derrotados socialmente en dos subgrupos: susceptibles al estrés (socialmente evitativos) y resistentes al estrés (socialmente no evitativos 9,14). Sin embargo, la interpretación del fenotipo de evitación social en ratones como un comportamiento desadaptativo o adaptativo debe considerarse en el contexto general tanto del tratamiento (en este caso, el CSD) como del ensayo conductual posterior al tratamiento. Además, el ensayo conductual de elección posterior al tratamiento evaluaría idealmente otras facetas de la sociabilidad y no solo el desarrollo de la evitación social. Nuestro trabajo reciente reveló la implicación del aprendizaje condicionado en la evitación social inducida por el DCS15. Específicamente, la evitación social inducida por CSD es una respuesta condicionada aversiva hacia los rasgos característicos de la cepa de los residentes que sirve como estímulo condicionado al estímulo incondicionado, es decir, los ataques de los residentes. Además, dentro del subgrupo de evitación social, algunos individuos pueden discriminar entre los rasgos de la cepa de residentes aversivos y los de otras cepas nuevas seguras, mientras que otros individuos muestran una evitación social generalizada a ambas cepas. Proponemos aquí un refinado ensayo conductual post-CSD: el Test de Seguridad y Amenaza Social (STST)15. A diferencia deotras pruebas de interacción social, el STST permite una evaluación simultánea del desarrollo de la evitación social como una medida de la respuesta condicionada aversiva correcta (es decir, el aprendizaje condicionado exitoso) y la capacidad de discriminación social de amenaza y seguridad, las cuales se utilizan para identificar individuos susceptibles al estrés y resistentes al estrés dentro de un solo grupo de ratones machos crónicamente derrotados socialmente. La evaluación de la discriminación entre amenazas sociales y seguridad frente a la generalización de la respuesta aversiva amplía los criterios traslacionales utilizados para clasificar el único grupo de animales crónicamente derrotados socialmente en subgrupos resilientes y susceptibles.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas relativa al cuidado y la utilización de animales para procedimientos experimentales y fueron aprobados por las autoridades locales (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). La figura 1 representa una línea de tiempo esquemática.
1. Tratamiento
- Animales de interés: Obtener ratones machos C57BL6/J a las 7 semanas de edad y, a su llegada, en una sola casa en una instalación con temperatura y humedad controladas en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (luces encendidas: 8:00; luces apagadas: 20:00; 23 °C; 38% de humedad) con comida y agua ad libitum.
- Derrota social crónica (CDS)
- Grupo de tratamiento
- Después de 1 semana de habituación, realice el tratamiento de la DCS durante 10 días consecutivos utilizando la cepa CD-1 como cepa del residente (para un protocolo detallado, consulte la derrota social crónica9 y el tratamiento de la derrota social crónicamodificada 10).
- Introduzca el ratón C57BL6/J en la jaula del ratón CD-1 y cuente 10 s de ataque físico. Repita este episodio tres veces, cada una con un ratón CD-1 diferente, y separe por intervalos de 15 minutos entre episodios.
- Coloque una pared de malla entre el ratón C57BL6/J y el ratón CD-1 durante estos intervalos, permitiendo solo el contacto sensorial. Después del tercer episodio, aloja a los ratones C57BL6/J durante la noche en las jaulas de los ratones CD-1, separándolos por una pared de malla. Repita durante 10 días.
NOTA: Número de ratones CD-1 = número de ratones C57BL6/J + 1. Si el número de ratones tratados con C57BL6/J es inferior a 10, se necesita un mínimo de 10 ratones CD-1 para garantizar que cada día la última fase sensorial (que dura toda la noche) sea con un nuevo ratón CD-1 durante los 10 días de tratamiento. - Evalúe cuidadosamente el bienestar físico de los animales a lo largo de los 10 días. Si un animal está gravemente herido, excluirlo del experimento por razones éticas y científicas (movilidad/actividad durante la prueba posterior al tratamiento). La Tabla 1 proporciona una lista de verificación del bienestar.
- Grupo de control
- A su llegada, mantenga a los ratones de la misma edad en las mismas condiciones que el grupo de tratamiento.
- Después de 1 semana de habituación, introducir a los animales de control durante 90 s en una jaula vacía y luego devolverlos a jaulas individuales (de un solo alojamiento) separadas por la mitad por paredes de malla idénticas a las utilizadas para el grupo de tratamiento. Realice esto diariamente en paralelo a los 10 días de tratamiento.
NOTA: Es recomendable mantener el grupo control y el grupo tratamiento alojados en habitaciones diferentes.
- Grupo de tratamiento
- Después de la última (10ª) fase sensorial, aloje a todos los ratones en jaulas nuevas en condiciones similares a las descritas a su llegada y déjelos descansar durante la noche.
NOTA: La última fase sensorial debe durar 24 h, luego los animales se alojan solos.
2. Prueba posterior al tratamiento: Prueba de seguridad y amenaza social (Figura 2)
- Después del tratamiento con CSD, aloje a todos los ratones (grupos tratados y de control) en jaulas nuevas en condiciones similares a las descritas a su llegada y déjelos reposar durante la noche.
- Durante las horas de la mañana (8:00-13:30), limpie la arena de tres cámaras (forma rectangular con un tamaño total de 60 cm x 40 cm, hecha de paredes acrílicas transparentes y pisos lisos) con etanol al 5% y colóquela debajo de la cámara con condiciones de luz de 37 lux. Asegúrese de que toda la arena esté visible.
- Limpie los recintos de malla (en forma de jaula hechos de metal o acrílico) con etanol al 5% y colóquelos como se muestra en las esquinas de la Figura 1A.
- Fase de habituación: Introduce al animal de interés en el centro de la arena, deja que lo explores durante 6 minutos y luego devuélvelo a su jaula de origen.
- Coloque el nuevo objetivo social CD-1 (desconocido) (conespecífico) debajo de un recinto de malla y el nuevo objetivo social 129/Sv bajo el otro recinto de malla.
NOTA: Es importante utilizar un conespecífico 129/Sv desconocido para evitar un sesgo de familiaridad. Preferiblemente tener 4 recintos de malla por arena: 2 atribuidos a la fase de habituación y 2 a la fase de prueba. - Fase de prueba: Vuelva a introducir inmediatamente el animal de interés en el centro de la arena y permita la exploración durante 6 minutos.
- Devolver a todos los animales a su hogar. Limpiar la arena y los recintos de malla con etanol al 5% entre las pruebas de diferentes animales, pero nunca durante la observación del mismo animal, es decir, nunca entre las fases de habituación y prueba.
- Alternar la ubicación de los recintos de malla entre animales (y nunca entre las dos fases dentro del mismo animal) para controlar el posible sesgo preferencial de ubicación.
3. Puntuación y análisis
NOTA: Solo se puntúa y analiza la prueba de tratamiento post-estrés, es decir, el STST (y no el tratamiento de estrés CSD).
- Defina la zona de interacción como 2 cm alrededor de los límites de los recintos de malla.
- Puntúa el tiempo dedicado a explorar los recintos de malla durante la fase de habituación cuando la nariz del animal está dentro de la zona de interacción.
- Puntúa el tiempo dedicado a interactuar con los objetivos sociales durante la fase de prueba cuando la nariz del animal está dentro de la zona de interacción.
NOTA: La detección se puede lograr manualmente (utilizando un temporizador o un software para la puntuación manual) o automáticamente. Independientemente del método de detección, tome el punto de la nariz para las mediciones de exploración e interacción social y el punto central del cuerpo para las mediciones relacionadas con la actividad (p. ej., distancia recorrida). - Calcule el índice de interacción social de la siguiente manera: tiempo dedicado a explorar cada objetivo social durante la fase de prueba / tiempo promedio dedicado a explorar los dos recintos de malla vacíos durante la fase de habituación (Figura 2B).
- Divida el grupo de tratamiento en 3 subgrupos de la siguiente manera: los animales con un índice de interacción social ≥1 con el objetivo social CD-1 son no evitadores, los animales con un índice de interacción social <1 con ambos objetivos sociales son evitadores indiscriminados, los animales con un índice de interacción social ≥1 solo con el objetivo social 129/Sv son discriminadores-evitadores (Figura 2C-D).
NOTA: El número de animales dentro de cada uno de los tres subgrupos puede diferir entre los diferentes lotes de animales (aproximadamente 1/3 de todos los animales que se someten al tratamiento con DCV mostrarán las características fenotípicas de uno de los tres subgrupos). - Evaluar el efecto del estrés mediante el análisis estadístico del índice de interacción social con el objetivo social CD-1 entre los grupos de tratamiento y control (prueba t paramétrica de dos muestras o prueba no paramétrica de Mann-Whitney).
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Representative Results
Índice de interacción social como medida de la respuesta aversiva condicionada
Un índice de interacción social ≥1 refleja una mayor interacción social con el objetivo social respectivo en comparación con la exploración de los recintos de malla vacíos. En condiciones basales, definidas aquí como no tener experiencia ni apetitiva ni aversiva con los rasgos característicos de una cepa específica (en este caso, tanto los objetivos sociales para el grupo de control como el objetivo social 129/Sv para el grupo de tratamiento), los niveles de sociabilidad intactos se reflejan en un índice de interacción social ≥1 con esa misma cepa. Mientras tanto, después de una experiencia de condicionamiento socialmente aversivo (en este caso, el tratamiento con DCS) con una cepa específica (en este caso, la cepa del residente, es decir, la cepa CD-1) y, por lo tanto, con sus rasgos característicos que sirven como estímulo condicionado, el desarrollo de la evitación social como medida de una respuesta condicionada aversiva correcta se refleja en un índice de interacción social <1 con esa misma cepa. El efecto del estrés de la DCS es el primero que se evalúa y a nivel de grupo de tratamiento global (véase el paso 3.6 del protocolo). Específicamente, el efecto del estrés se refleja en que el grupo de tratamiento tiene un índice de interacción social <1 con el objetivo social CD-1 como medida del desarrollo de evitación social hacia la cepa CD-1. Mientras tanto, los niveles de sociabilidad basales intactos del grupo de control se reflejan en tener un índice de interacción social ≥1 con el mismo objetivo social. Esto se traduce en una diferencia significativa (p < 0,05) en el índice de interacción social con el target social CD-1 entre ambos grupos (Figura 2C).
Identificación de tres subgrupos fenotípicos distintos dentro de un único grupo crónicamente derrotado socialmente mediante la prueba de amenaza social-seguridad
Después de dividir a los animales en función de su índice de interacción social, como se explica en los pasos 3.4 y 3.5 del protocolo, solo se encontrará una diferencia significativa (p < 0.05) en el índice dentro de un solo subgrupo entre ambos objetivos sociales, solo dentro del subgrupo discriminante-evitador (Figura 2D,E). El subgrupo de los que discriminan-evitan y el subgrupo de los que evitan indiscriminadamente tienen un índice de interacción social <1 con el objetivo social CD-1, una medida del desarrollo de la evitación social hacia el estímulo condicionado (cepa CD-1), lo que refleja el desarrollo de una respuesta condicionada aversiva correcta y de un aprendizaje condicionado aversivo exitoso. Por el contrario, el índice de interacción social (≥1) del subgrupo de no evitadores refleja un deterioro del aprendizaje condicionado aversivo con el mismo objetivo social (cepa CD-1). Por su parte, la capacidad de discriminación amenaza-seguridad se refleja en que el subgrupo discriminador-evitador tiene un índice de interacción social ≥1 con el objetivo social 129/Sv como medida de los niveles de sociabilidad intactos hacia un estímulo seguro/neutro (cepa 129/Sv). Por el contrario, la generalización de la respuesta aversiva del subgrupo de evitadores indiscriminados se refleja en tener un índice de interacción social <1 con el mismo objetivo social como medida de evitación social y, por lo tanto, una respuesta aversiva condicionada hacia un estímulo seguro/neutro. El porcentaje de ratones dentro de cada subgrupo es de aproximadamente el 33%; Sin embargo, esto es impredecible ya que algunos lotes de animales tienen más o menos en cada subgrupo. Por último, la ausencia de sesgo preferencial social como posible factor de confusión se refleja en los índices de interacción social de ≥1 (es decir, p>0,05) con ambos objetivos sociales dentro del grupo de control.
Interpretación de los resultados de las pruebas de seguridad y amenaza social
Las características del subgrupo de discriminadores-evitadores, incluyendo el aprendizaje condicionado exitoso de las señales asociadas a la amenaza y la discriminación de amenaza-seguridad, se discuten como características de los individuos resilientes al estrés 16,17,18,19,20,21,22 . Por el contrario, las respuestas aversivas condicionadas generalizadas después de eventos traumáticos, como se observa en el subgrupo de evitadores indiscriminados, son un síntoma clave de los trastornos mentales relacionados con el estrés, como el trastorno de estrés postraumático y los trastornos de ansiedad 16,17,23,24,25,26 y, por lo tanto, son característicos de los individuos susceptibles al estrés. Por último, el subgrupo de no evitadores representa un fenotipo de deterioro del aprendizaje16.
Figura 1: Línea de tiempo esquemática. Al llegar a la instalación, todos los ratones se alojaron en una sola casa durante 7 días y luego se designaron para los tratamientos: grupo tratado con estrés CSD o grupo tratado con control manipulado. Los tratamientos duran 10 días, después de los cuales los animales se alojan en una sola casa durante 1 día. Preparar las arenas para realizar el STST (que se lleva a cabo después del alojamiento individual de los animales por 1 día). Comienza con la fase de habituación durante 6 min. Siga la fase de habituación inmediatamente con la fase de prueba durante otros 6 minutos. Finalmente, devuelva a los animales a sus jaulas de origen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Prueba de seguridad y amenaza social. (A) Diseño de la prueba. La prueba se realiza en una arena de tres cámaras dividida en tres partes iguales separadas por paredes transparentes con aberturas, lo que permite que el animal de interés (C57BL6/J, negro) se mueva entre ellas. En cada una de las periferias se coloca un recinto de malla. Un recinto contiene un nuevo objetivo social de la cepa de residentes encontrada anteriormente durante el tratamiento de CSD (CD-1, blanco); el otro contiene un nuevo objetivo social de una nueva cepa que coincide en edad, tamaño y sexo con el nuevo ratón de la cepa de los residentes, pero de diferente color de pelaje (129/Sv, marrón). Ambos objetivos sociales son más antiguos y más grandes que el animal de interés. El animal de interés se introduce en el centro de la arena y se le permite explorar la arena durante 6 minutos durante la fase de habituación, cuando los recintos de malla están vacíos, y de nuevo durante la fase de prueba, cuando los objetivos sociales se colocan dentro de los recintos de malla como se muestra. (B) Índice de interacción social. Anote el tiempo dedicado a explorar los recintos de malla durante la fase de habituación cuando la nariz del animal está dentro de la zona de interacción (2 cm alrededor de los límites de los recintos de malla). Posteriormente, puntúa el tiempo dedicado a interactuar con los objetivos sociales durante la fase de prueba cuando la nariz está dentro de la zona de interacción. Calcule el índice de interacción social como se muestra. (C) Efecto de estrés de derrota social crónica: El grupo de tratamiento tiene un índice de interacción social <1 con el objetivo social CD-1 como medida del desarrollo de evitación social hacia la cepa CD-1. Mientras tanto, los niveles de sociabilidad basales intactos del grupo de control se reflejan en tener un índice de interacción social ≥1 con el mismo objetivo social. Esto resulta en una diferencia significativa (p < 0.05) en el índice de interacción social con el target social CD-1 entre ambos grupos. Los resultados se presentaron como media ± error estándar de la media (SEM), n=16 por grupo, prueba de Mann-Whitney. (D) Resultados representativos de la prueba de seguridad y amenaza social después del tratamiento de derrota social crónica. El grupo de tratamiento se divide en tres subgrupos en función de los índices de interacción social de los animales con los objetivos sociales. Los ratones con un índice de interacción social ≥1 con el objetivo social CD-1 se denominan no evitadores, los ratones con un índice de interacción social <1 con ambos objetivos sociales se denominan evitadores indiscriminados, y los ratones con un índice de interacción social ≥1 solo con el objetivo social 129/Sv se denominan evitadores discriminatorios. El grupo control tiene índices similares con ambos objetivos sociales. Los resultados se presentaron como media ± SEM, n = 55 por subgrupo. (E) Mapas de calor representativos de cada sub/grupo durante la fase de prueba de STST. Los colores más oscuros indican que se pasa más tiempo en el área. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Criterios de aborto para el procedimiento de derrota social crónica. La tabla presenta un total de cuatro familias de observaciones, cada una con varias subobservaciones27. Cada observación tiene una puntuación. En función de la suma de la puntuación, se indican las medidas a tomar. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
El protocolo conductual aquí describe la Prueba de Seguridad y Amenaza Social, utilizada para dividir un solo grupo después del tratamiento con CSD en tres subgrupos diferentes, que sirve como método para investigar la biología subyacente de la susceptibilidad al estrés y la resiliencia y para probar posibles terapias. El contexto biológico y los detalles técnicos deben considerarse cuidadosamente para guiar un diseño experimental exhaustivo.
Las diferentes condiciones de alojamiento pueden alterar los niveles de sociabilidad de la agresión, lo que puede influir en los resultados obtenidos de la prueba posterior al tratamiento28,29,30. Dichas condiciones incluyen el alojamiento individual de todos los animales a su llegada y 24 horas antes de la prueba posterior al tratamiento, así como el alojamiento individual del grupo de control durante los 10 días de tratamiento. Además, el efecto de tensión de la CSD puede verse comprometido si el grupo de control se estresa accidentalmente. Esto puede ser el resultado de la exposición del grupo de control a olores y vocalizaciones inducidos por el estrés del grupo de tratamiento durante los 10 días de tratamiento, así como del grupo de control que presenció el tratamiento31. Por lo tanto, es recomendable mantener el grupo de control y el grupo de tratamiento alojados en habitaciones diferentes. Además, debido a la implicación del aprendizaje condicionado15, ciertos pasos son fundamentales para obtener resultados de pruebas posteriores al tratamiento similares a los que se describen aquí. Esto incluye la realización del tratamiento en adultos jóvenes durante 10 días, así como la realización de la prueba posterior al tratamiento 24 h después del reposo (ver paso 2.1 del protocolo). El aprendizaje condicionado puede ser diferente en ratones más jóvenes (o mayores). Del mismo modo, realizar el tratamiento durante más o menos de 10 días supone un mayor o menor acondicionamiento del animal, respectivamente. Los cambios en la duración del tratamiento pueden dar lugar a diferentes tamaños de subgrupos. Además, es aconsejable que dentro de un mismo experimento, o bien el mismo experimentador realice el tratamiento y la prueba post-tratamiento en todos los animales o bien exista una separación entre los experimentadores que realizan el tratamiento y los que realizan la prueba post-tratamiento que sea similar en todos los animales. Esto se debe a que el/los experimentador/es representa(n) parte del contexto general de acondicionamiento (tratamiento con DCV) y de las pruebas (prueba de amenaza social-seguridad posterior al tratamiento) para el animal; Por lo tanto, todos los animales dentro del mismo experimento deben estar expuestos al mismo contexto durante todo el experimento. Además, el comportamiento de los animales durante la prueba posterior al tratamiento puede confundirse con las señales de olor32. La limpieza con etanol al 5% entre animales estandariza las señales de olor. Sin embargo, evite la limpieza entre las dos fases de la prueba posterior al tratamiento (habituación y prueba) entre el mismo animal. Esto se debe a que la fase de habituación está parcialmente destinada a familiarizar al animal con la arena, de modo que durante la fase de prueba, el comportamiento del animal está impulsado principalmente por la nueva presencia de los nuevos objetivos sociales. Por lo tanto, la limpieza entre las dos fases puede comprometer las señales de olor marcadas por el animal durante la fase de habituación, lo que hace que el escenario sea menos familiar durante la fase de prueba de la prueba posterior al tratamiento33. Además, es preferible disponer de cuatro recintos de malla por arena, dos de los cuales se atribuyen a la fase de habituación (siempre se utilizan vacíos) y dos a la fase de ensayo (siempre se utilizan con los objetivos sociales), con el fin de extinguir el posible olor residual de los objetivos sociales CD-1 y 129/Sv en los recintos de malla desde la fase de ensayo hasta la fase de habituación. La eliminación del olor residual en los recintos de malla es fundamental porque puede influir en la exploración de los recintos de malla por parte del animal durante la fase de habituación, cambiando los resultados del índice de interacción social y, por lo tanto, la división del grupo de tratamiento en tres subgrupos33. Del mismo modo, es aconsejable atribuir objetivos sociales específicos a la prueba posterior al tratamiento y mantenerlos en condiciones similares cuando no se utilicen. Esto se debe a que la participación de un objetivo social en otros tratamientos y pruebas puede influir en el comportamiento del objetivo respectivo en el recinto de malla durante la prueba posterior al tratamiento. Por ejemplo, el uso de la diana social CD-1 en otros experimentos como residente para el tratamiento de la DCS puede cambiar sus niveles de agresión en relación con el 129/Sv cuando se utiliza en la prueba de seguridad y amenaza social posterior al tratamiento. Las diferencias en los niveles de agresión pueden indicar diferentes señales al animal de interés durante la prueba posterior al tratamiento, creando un sesgo preferencial que no se atribuye al aprendizaje condicionado de los 10 días de tratamiento. Por lo tanto, el hecho de que ambos objetivos sociales tengan experiencias similares antes de su uso en la prueba posterior al tratamiento puede ayudar a estandarizar el comportamiento y las señales de ambos mientras están en el recinto de malla. Otra medida para evitar la implicación de un sesgo preferencial incluye el uso de objetivos sociales más antiguos y más grandes que el animal de interés15, afirmando que la señal principal son los rasgos característicos de la cepa, no la edad o el tamaño. Para ello, la prueba posterior al tratamiento emplea la cepa 129/Sv para contrastar las cepas CD-1 y C57BL6/J. La cepa 129/Sv tiene un color de pelaje diferente al de ambas. Sería interesante probar diferentes cepas de diferentes colores de pelaje y ver cómo se influyen los resultados en la prueba posterior al tratamiento15.
La derrota social crónica es uno de los modelos más robustos para el trastorno de estrés postraumático, la depresión y otras enfermedades relacionadas con el estrés34. Tiene una excelente validez etiológica -35, predictiva-, discriminativa, farmacológica y facial 8,36. Aquí, se describe un protocolo modificado de CSD en ratones machos introducido por van Der Kooji y colaboradores que tiene como objetivo fortalecer el componente psicosocial del estrés inducido10. El fenotipo de evitación social es robusto, confiable y fácilmente comprobable, y posee relevancia etológica y una fuerte validez aparente34. A diferencia de otras pruebas de interacción social9, la STST permite la evaluación simultánea del desarrollo de la evitación social y de la capacidad de discriminación entre amenazas sociales y seguridad16. Los resultados del STST se utilizan para identificar subgrupos susceptibles al estrés y resilientes al estrés dentro de un solo grupo de ratones crónicamente derrotados socialmente, lo que se alinea con la evidencia en humanos que caracteriza a los individuos resilientes con discriminación de amenaza-seguridad y a los individuos susceptibles con generalización de respuesta aversiva16. Esta clasificación puede ser seguida por manipulaciones experimentales para ayudar a desentrañar la base neural de la resiliencia al estrés y la susceptibilidad en general y específica a la discriminación amenaza-seguridad frente a la generalización de la respuesta aversiva16,37. A pesar de décadas de investigación y ciertas mejoras en el tratamiento, los trastornos mentales relacionados con el estrés siguen siendo frecuentes en los seres humanos. Sin embargo, al centrarse en la heterogeneidad entre diferentes individuos en respuesta al mismo factor estresante, se produce un cambio de paradigma de la realización de investigaciones orientadas a la enfermedad por sí solas a la realización simultánea de investigaciones orientadas a la enfermedad y la salud. Este cambio de paradigma podría ayudar a desarrollar nuevos enfoques de prevención38,39 e identificar mejores estrategias de tratamiento dirigidas.
Una limitación del modelo es que solo se investigó a los varones. Debido a que el STST se basa en el modelo CSD, que se desarrolló en base al comportamiento de ratones machos en la naturaleza40, no se evaluó la compatibilidad de la prueba con ratones hembra. Una prueba compatible con ratones hembra sería aquella que sigue un tratamiento de estrés creado en ambos sexos o solo en hembras. Se necesitan más estudios para extender estos hallazgos reportados de ratones machos a hembras. Además, los resultados esperados reportados aquí son de ratones adultos jóvenes. Contribuiría a nuestra comprensión saber cómo (si) cambian los hallazgos mediante el uso de diferentes edades. Cabe destacar que un estudio reciente encontró que el comportamiento de evitación social después de la DCS es similar entre ratones de diferentes grupos de edad41. Del mismo modo, otras variables a tener en cuenta son la duración del tratamiento, si es diferente a 10 días, y el tiempo de ensayo conductual, si se realiza más de 24 h después del descanso. En general, el modelo refina sustancialmente los modelos de susceptibilidad y resiliencia al estrés utilizados actualmente en ratones y contribuye al avance de futuros enfoques traslacionales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación cuenta con el apoyo del Centro de Investigación Colaborativa 1193, Subproyecto Z02, financiado por la Fundación Nacional de Investigación de Alemania (SFB1193, Neurobiología de la Resiliencia) y la Fundación Boehringer Ingelheim (subvención del Instituto Leibniz para la Investigación de la Resiliencia y el Fenotipado Individual y el Análisis Automatizado del Comportamiento de Alta Resolución). Nos gustaría agradecer al Dr. Konstantin Radyushkin y a la Sra. Sandra Reichel por su asistencia técnica, así como a la Sra. Hanna Kim por su apoyo en inglés. Las fuentes de financiación no participaron en el diseño del modelo; recopilación, análisis e interpretación de datos; en la redacción del protocolo; y en la decisión de presentar el protocolo para su publicación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arenas | Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x 40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors |
| Camera for video recording | Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg |
ace Classic acA1300-60gc |
If using automatic detection program, make sure cameras are compatible |
| Camera objective | KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv |
Part-No. 10504 | |
| Detection program/Timer | Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/ethovision-xt | Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically |
| Housing cages | ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel |
3010010 | Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C |
| Mesh enclosures | Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol) |
| Mesh wall | selfmade | N/A | Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact |
| Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders | Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl |
Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl | CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice |
References
- Hyman, S. E. How mice cope with stressful social situations. Cell. 131 (2), 232-234 (2007).
- Kessler, R. C. The effects of stressful life events on depression. Annual Review of Psychology. 48 (1), 191-214 (1997).
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 301 acute and chronic diseases and injuries in 188 countries, 1990-2013: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study, 2013. The Lancet. 386 (9995), 743-800 (2015).
- Björkqvist, K. Social defeat as a stressor in humans. Physiology & Behavior. 73 (3), 435-442 (2001).
- Blanchard, R. J., McKittrick, C. R., Blanchard, D. C. Animal models of social stress: effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiology & Behavior. 73 (3), 261-271 (2001).
- Singleton, G. R., Krebs, C. J. Chapter 3- The Secret World of Wild Mice. The Mouse in Biomedical Research. American College of Laboratory Animal Medicine. The Mouse in Biomedical Research (Second Edition). 1, Academic Press. 25-51 (2007).
- Kondrakiewicz, K., Kostecki, M., Szadzińska, W., Knapska, E. Ecological validity of social interaction tests in rats and mice. Genes, Brain, and Behavior. 18 (1), e12525 (2019).
- Martinez, M., Calvo-Torrent, A., Pico-Alfonso, M. A. Social defeat and subordination as models of social stress in laboratory rodents: a review. Aggressive Behavior: Official Journal of the International Society for Research on Aggression. 24 (4), 241-256 (1998).
- Golden, S. A., Covington III, H. E., Berton, O., Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nature Protocols. 6 (8), 1183 (2011).
- van der Kooij, M. A., et al. Chronic social stress-induced hyperglycemia in mice couples individual stress susceptibility to impaired spatial memory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), E10187-E10196 (2018).
- Chartier, M. J., Walker, J. R., Stein, M. B.
- Cohen, H., Zohar, J., Matar, M. A., Kaplan, Z., Geva, A. B. Unsupervised fuzzy clustering analysis supports behavioral cutoff criteria in an animal model of post-traumatic stress disorder. Biological Psychiatry. 58 (8), 640-650 (2005).
- Scharf, S. H., Schmidt, M. V. Animal models of stress vulnerability and resilience in translational research. Current Psychiatry Reports. 14 (2), 159-165 (2012).
- Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
- Ayash, S., Schmitt, U., Müller, M. B. Chronic social defeat-induced social avoidance as a proxy of stress resilience in mice involves conditioned learning. Journal of Psychiatric Research. 120, 64-71 (2020).
- Ayash, S., et al. Fear circuit-based neurobehavioural signatures mirror resilience to chronic social stress in mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (17), e2205576120 (2023).
- Duits, P., et al. Updated meta-analysis of classical fear conditioning in the anxiety disorders. Depression and Anxiety. 32 (4), 239-253 (2015).
- Coifman, K. G., Bonanno, G. A., Rafaeli, E. Affect dynamics, bereavement, and resilience to loss. Journal of Happiness Studies. 8 (3), 371-392 (2007).
- Waugh, C. E., Thompson, R. J., Gotlib, I. H. Flexible emotional responsiveness in trait resilience. Emotion. 11 (5), 1059 (2011).
- Bonanno, G. A. Loss, trauma, and human resilience: Have we underestimated the human capacity to thrive after extremely aversive events. American Psychologist. 59 (1), 20 (2004).
- Bonanno, G. A.
- Yehuda, R., Flory, J. D., Southwick, S., Charney, D. S. Developing an agenda for translational studies of resilience and vulnerability following trauma exposure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1071 (1), 379-396 (2006).
- Grillon, C., Morgan III, C. A. Fear-potentiated startle conditioning to explicit and contextual cues in Gulf War veterans with post-traumatic stress disorder. Journal of Abnormal Psychology. 108 (1), 134 (1999).
- Brewin, C. R. A cognitive neuroscience account of post-traumatic stress disorder and its treatment. Behaviour Research and Therapy. 39 (4), 373-393 (2001).
- Milad, M. R., Rauch, S. L., Pitman, R. K., Quirk, G. J. Fear extinction in rats: implications for human brain imaging and anxiety disorders. Biological Psychology. 73 (1), 61-71 (2006).
- Jovanovic, T., Norrholm, S. D. Neural mechanisms of impaired fear inhibition in post-traumatic stress disorder. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 5, 44 (2011).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. The Veterinary Record. 116 (6), 431-436 (1985).
- Goldsmith, J. F., Brain, P. F., Benton, D. Effects of the duration of individual or group housing on behavioural and adrenocortical reactivity in male mice. Physiology & Behavior. 21 (5), 757-760 (1978).
- Cairns, R. B., Hood, K. E., Midlam, J. On fighting in mice: Is there a sensitive period for isolation effects. Animal Behaviour. 33 (1), 166-180 (1985).
- Varlinskaya, E. I., Spear, L. P., Spear, N. E. Social behavior and social motivation in adolescent rats: role of housing conditions and partner's activity. Physiology & Behavior. 67 (4), 475-482 (1999).
- Sial, O. K., Warren, B. L., Alcantara, L. F., Parise, E. M., Bolaños-Guzmán, C. A. Vicarious social defeat stress: Bridging the gap between physical and emotional stress. Journal of Neuroscience Methods. 258, 94-103 (2016).
- Brown, R. E. The rodents II. Suborder Myomorpha. [In: Social Odours in Mammals]. Brown, R. E., Macdonald, D. W. 1, Oxford University Press. Oxford. (1985).
- Haney, M., Miczek, K. A. Ultrasounds during agonistic interactions between female rats (Rattus norvegicus). Journal of Comparative Psychology. 107 (4), 373 (1993).
- Warren, B. L., et al. Neurobiological sequelae of witnessing stressful events in adult mice. Biological Psychiatry. 73 (1), 7-14 (2013).
- Malatynska, E., Knapp, R. J. Dominant-submissive behavior as models of mania and depression. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 715-737 (2005).
- Avgustinovich, D. F., Kovalenko, I. L., Kudryavtseva, N. N. A model of anxious depression: persistence of behavioral pathology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 35 (9), 917-924 (2005).
- Vennin, C., et al. A resilience related glial-neurovascular network is transcriptionally activated after chronic social defeat in male mice. Cells. 11 (21), 3405 (2022).
- Ayash, S., Schmitt, U., Lyons, D. M., Müller, M. B. Stress inoculation in mice induces global resilience. Translational Psychiatry. 10 (1), 200 (2020).
- Yuan, R., et al. Long-term effects of intermittent early life stress on primate prefrontal-subcortical functional connectivity. Neuropsychopharmacology. 46 (7), 1348-1356 (2021).
- Lyons, D. M., Ayash, S., Schatzberg, A. F., Müller, M. B. Ecological validity of social defeat stressors in mouse models of vulnerability and resilience. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 145, 105032 (2023).
- Oizumi, H., et al. Influence of aging on the behavioral phenotypes of C57BL/6J mice after social defeat. PLoS One. 14 (9), e0222076 (2019).
