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Behavior

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का उपयोग करके उम्र से संबंधित नींद विकारों के लिए उच्च-थ्रूपुट छोटे अणु दवा स्क्रीनिंग

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

प्रस्तुत एक बुजुर्ग ड्रोसोफिला मॉडल में फल मक्खियों के नींद व्यवहार की निगरानी करके नींद में सुधार करने के लिए उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

नींद, स्वास्थ्य और समग्र कल्याण का एक आवश्यक घटक, अक्सर पुराने व्यक्तियों के लिए चुनौतियां प्रस्तुत करता है जो अक्सर कम नींद की अवधि और खंडित पैटर्न की विशेषता वाले नींद विकारों का अनुभव करते हैं। ये नींद व्यवधान मधुमेह, हृदय रोगों और मनोवैज्ञानिक विकारों सहित बुजुर्गों में विभिन्न बीमारियों के बढ़ते जोखिम के साथ भी सहसंबंधित हैं। दुर्भाग्य से, नींद विकारों के लिए मौजूदा दवाएं संज्ञानात्मक हानि और लत जैसे महत्वपूर्ण दुष्प्रभावों से जुड़ी हैं। नतीजतन, नई, सुरक्षित और अधिक प्रभावी नींद विकार दवाओं के विकास की तत्काल आवश्यकता है। हालांकि, वर्तमान दवा स्क्रीनिंग विधियों की उच्च लागत और लंबी प्रयोगात्मक अवधि सीमित कारक बनी हुई है।

यह प्रोटोकॉल एक लागत प्रभावी और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि का वर्णन करता है जो ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का उपयोग करता है, स्तनधारियों की तुलना में अत्यधिक संरक्षित नींद विनियमन तंत्र वाली एक प्रजाति, जो इसे बुजुर्गों में नींद विकारों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल बनाती है। वृद्ध मक्खियों को विभिन्न छोटे यौगिकों को प्रशासित करके, हम नींद विकारों पर उनके प्रभावों का आकलन कर सकते हैं। इन मक्खियों के नींद के व्यवहार को एक अवरक्त निगरानी उपकरण का उपयोग करके दर्ज किया जाता है और ओपन-सोर्स डेटा पैकेज स्लीप एंड सर्कैडियन एनालिसिस मैटलैब प्रोग्राम 2020 (SCAMP2020) के साथ विश्लेषण किया जाता है। यह प्रोटोकॉल नींद विनियमन के लिए कम लागत वाली, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कुशल स्क्रीनिंग दृष्टिकोण प्रदान करता है। फल मक्खियां, उनके छोटे जीवन चक्र, कम पशुपालन लागत और हैंडलिंग में आसानी के कारण, इस विधि के लिए उत्कृष्ट विषयों के रूप में काम करती हैं। एक उदाहरण के रूप में, परीक्षण की गई दवाओं में से एक रेसेरपिन ने बुजुर्ग मक्खियों में नींद की अवधि को बढ़ावा देने की क्षमता का प्रदर्शन किया, इस प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता पर प्रकाश डाला।

Introduction

नींद, मानव अस्तित्व के लिए आवश्यक आवश्यक व्यवहारों में से एक, दो मुख्य अवस्थाओं की विशेषता है: रैपिड आई मूवमेंट (आरईएम) नींद और गैर-रैपिड आई मूवमेंट (एनआरईएम) नींद1। एनआरईएम नींद में तीन चरण शामिल हैं: एन 1 (जागने और नींद के बीच संक्रमण), एन 2 (हल्की नींद), और एन 3 (गहरी नींद, धीमी तरंग नींद), जागने सेगहरी नींद तक प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है। नींद शारीरिक औरमानसिक स्वास्थ्य दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। हालांकि, उम्र बढ़ने से कुल नींद की अवधि, नींद दक्षता, धीमी-तरंग नींद प्रतिशत और वयस्कों में आरईएम नींद प्रतिशतकम हो जाता है। वृद्ध व्यक्ति धीमी-तरंग नींद की तुलना में हल्की नींद में अधिक समय बिताते हैं, जिससे वे निशाचर जागृति के प्रति अधिक संवेदनशील हो जाते हैं। जैसे-जैसे जागृति की संख्या बढ़ती है, औसत नींद का समय कम हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बुजुर्गों में एक खंडित नींद पैटर्न होता है,जो चूहों में एचसीआरटी न्यूरॉन्स के अत्यधिक उत्तेजना से जुड़ा हो सकता है। इसके अतिरिक्त, सर्कैडियन तंत्र में उम्र से संबंधित गिरावट नींद की अवधि 5,6 में पहले बदलाव में योगदान करती है। शारीरिक बीमारी, मनोवैज्ञानिक तनाव, पर्यावरणीय कारकों और दवा के उपयोग के संयोजन में, ये कारक पुराने वयस्कों को नींद विकारों के लिए अधिक संवेदनशील बनाते हैं, जैसे अनिद्रा, आरईएम नींद व्यवहार विकार, नार्कोलेप्सी, आवधिक पैर आंदोलनों, बेचैन पैर सिंड्रोम, और नींद-अव्यवस्थित श्वास 7,8।

महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चला है कि नींद संबंधी विकार बुजुर्गों में पुरानी बीमारियों से निकटता से जुड़े हुए हैं9, जिसमें अवसाद10, हृदय रोग 11 और मनोभ्रंश12 शामिल हैं। नींद विकारों को संबोधित करना पुरानी बीमारियों में सुधार और उपचार और पुराने वयस्कों के लिए जीवन की गुणवत्ता को बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वर्तमान में, रोगी मुख्य रूप से नींदकी गुणवत्ता बढ़ाने के लिए बेंजोडायजेपाइन, गैर-बेंजोडायजेपाइन और मेलाटोनिन रिसेप्टर एगोनिस्ट जैसी दवाओं पर भरोसा करते हैं। हालांकि, बेंजोडायजेपाइन लंबे समय तक उपयोग के बाद रिसेप्टर्स और निर्भरता के डाउनरेग्यूलेशन का कारण बन सकता है, जिससे14,15 को बंद करने पर गंभीर वापसी के लक्षण हो सकते हैं। गैर-बेंजोडायजेपाइन दवाएं भी जोखिम उठाती हैं, जिनमें मनोभ्रंश 16, फ्रैक्चर17 और कैंसर18 शामिल हैं। आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला मेलाटोनिन रिसेप्टर एगोनिस्ट, रैमेल्टन, नींद की विलंबता को कम करता है लेकिन नींद की अवधि में वृद्धि नहीं करता है और व्यापक प्रथम-पास उन्मूलन19 के कारण यकृत समारोह से संबंधित चिंताएं हैं। एगोमेलैटिन, एक मेलाटोनिन रिसेप्टर एगोनिस्ट और सेरोटोनिन रिसेप्टर विरोधी, अवसाद से संबंधित अनिद्रा में सुधार करता है लेकिनयकृत क्षति का खतरा भी पैदा करता है। नतीजतन, नींद विकारों के इलाज या कम करने के लिए सुरक्षित दवाओं की तत्काल आवश्यकता है। हालांकि, स्वचालित प्रणालियों और कंप्यूटर विश्लेषण के साथ संयुक्त आणविक और सेलुलर प्रयोगों के आधार पर वर्तमान दवा स्क्रीनिंग रणनीतियाँ महंगी और समय लेने वालीहैं। रिसेप्टर संरचना और गुणों पर निर्भर संरचना-आधारित दवा डिजाइन रणनीतियों को रिसेप्टर त्रि-आयामी संरचना की स्पष्ट समझ की आवश्यकता होती है और दवा प्रभाव ों के लिए पूर्वानुमान क्षमताओं की कमीहोती है।

2000 में, 1984 23 में कैंपबेल और टॉबलर द्वारा प्रस्तावित नींद के मानदंडों के आधार पर, शोधकर्ताओं ने ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर सहित नींद 24 का अध्ययन करने के लिए सरल पशु मॉडल स्थापित किए, जिसमें नींद जैसी स्थिति25,26 प्रदर्शित की गई। ड्रोसोफिला और मनुष्यों के बीच शारीरिक अंतर के बावजूद, ड्रोसोफिला में नींद को विनियमित करने वाले कई न्यूरोकेमिकल घटक और सिग्नलिंग मार्ग स्तनधारी नींद में संरक्षित हैं, जिससे मानवन्यूरोलॉजिकल रोगों के अध्ययन की सुविधा मिलती है। ड्रोसोफिला का उपयोग सर्कैडियन लय अध्ययन में भी बड़े पैमाने पर किया जाता है, मक्खियों और स्तनधारियों के बीच कोर ऑसिलेटर में अंतर के बावजूद 29,30,31। इसलिए, ड्रोसोफिला नींद के व्यवहार का अध्ययन करने और नींद से संबंधित दवा स्क्रीनिंग का संचालन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव के रूप में कार्य करता है।

यह अध्ययन वृद्ध मक्खियों का उपयोग करके नींद विकारों के इलाज के लिए छोटे-अणु दवाओं की स्क्रीनिंग के लिए एक लागत प्रभावी और सरल फेनोटाइप-आधारित दृष्टिकोण का प्रस्ताव करता है। ड्रोसोफिला में नींद विनियमनअत्यधिक संरक्षित है, और उम्र के साथ देखी गई नींद में गिरावट दवा प्रशासन के माध्यम से प्रतिवर्ती हो सकती है। इस प्रकार, यह नींद फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग विधि सहज रूप से दवा प्रभावकारिता को प्रतिबिंबित कर सकती है। हम जांच और भोजन के तहत दवा के मिश्रण के साथ मक्खियों को खिलाते हैं, ड्रोसोफिला गतिविधि मॉनिटर (डीएएम) 32 का उपयोग करके नींद के व्यवहार की निगरानी और रिकॉर्ड करते हैं, और मैटलैब (चित्रा 1) में ओपन-सोर्स SCAMP2020 डेटा पैकेज का उपयोग करके अधिग्रहित डेटा का विश्लेषण करते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण सांख्यिकी और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। एक उदाहरण के रूप में, हम रेसेरपिन पर प्रयोगात्मक डेटा प्रस्तुत करके इस प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करते हैं, जो वेसिकुलर मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर का एक छोटा-अणु अवरोधक है जो नींदको बढ़ाने के लिए रिपोर्ट किया गया है। यह प्रोटोकॉल उम्र से संबंधित नींद की समस्याओं के इलाज के लिए दवाओं की पहचान करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करता है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (BDSC_3605, सामग्री की तालिका देखें) से 30 दिन पुराने डब्ल्यू1118 मक्खियों का उपयोग करता है।

1. वृद्ध फल मक्खियों की तैयारी

  1. भोजन तैयार करना
    1. 50 ग्राम / एल कॉर्नफ्लेक्स, 110 ग्राम / एल चीनी, 5 ग्राम / एल आगर, और 25 ग्राम / एल खमीर को मिलाकर मानक मकई स्टार्च कल्चर माध्यम तैयार करें। जिलेटिनाइज करने के लिए कॉर्नफ्लेक्स और खमीर को पानी के साथ गर्म करें, और फिर सभी पदार्थों को पूरी तरह से घोल लें।
    2. जब माध्यम 50-60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाता है, तो प्रोपियोनिक एसिड के 6 एमएल / एल जोड़ें और तुरंत उन्हें कल्चर बोतलों में पैक करें।
  2. मक्खी पालन और वृद्ध मक्खियों की तैयारी
    1. एक मानक कॉर्नस्टार्च कल्चर माध्यम वाली बोतलों में फ्लाई स्ट्रेन डब्ल्यू1118को ब्रीड करें और बोतलों को 25 डिग्री सेल्सियस, 68% सापेक्ष आर्द्रता, 500-1000 लक्स प्रकाश की स्थिति और 12 घंटे: 12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र पर एक निरंतर तापमान इनक्यूबेटर में रखें।
    2. मक्खियों के विकास चक्र के अनुसार हर 7 दिनों में एक नई बोतल में मक्खियों को स्थानांतरित करें, जिससे एक ही बोतल में व्यक्तियों की उम्र सुसंगत रहे।
    3. मक्खियों के नए बैच को इकट्ठा करें जो उन्हें स्थानांतरित करने के 3 दिन बाद मूल बोतल से निकलते हैं और उन्हें एक नई बोतल में डाल देते हैं। हर 7 दिनों में बोतल बदलने के सिद्धांत का पालन करते हुए, उन्हें लगभग 30 दिन की उम्र तक सुसंस्कृत किया जाएगा।

2. निगरानी के लिए औषधीय भोजन और ग्लास ट्यूब तैयार करना

नोट: ग्लास ट्यूब तैयार करने की प्रक्रिया संशोधनों के साथ जिन एट अल केकाम का पालन करती है।

  1. कांच की नलियों की सफाई और सुखाना।
    1. ग्लास ट्यूब (व्यास में 5 मिमी x 65 मिमी लंबाई, सामग्री की तालिका देखें) को एक बड़े बीकर में रखें, इसे भिगोएं, और इसे 20 मिनट के लिए डबल आसुत पानी के साथ उबालें। 3 बार दोहराएं।
    2. ग्लास ट्यूब को निकालें और बंडल करें, अंदर को डबल डिस्टिल्ड पानी से 3-5 बार कुल्ला करें, और इसे सूखने के लिए ओवन में रखें।
  2. सरल संस्कृति माध्यम (100 एमएल) की तैयारी
    1. 1.5 ग्राम आगार और 5 ग्राम सुक्रोज को डबल आसुत जल में घोलें, गर्मी दें, और 100 एमएल तक केंद्रित करें।
    2. जब माध्यम लगभग 70 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाता है, तो 600 μL प्रोपियोनिक एसिड जोड़ें, जिससे इसे निरंतर तापमान वाले पानी के स्नान का उपयोग करके ठोस होने से रोका जा सके।
    3. 10 एमएल छोटे बीकर में लगभग 4 मिलीलीटर सरल माध्यम और रेसेरपाइन (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें जब तक कि दवा 20 μM या 50 μM तक नहीं पहुंच जाती। नकारात्मक नियंत्रण समूह में 0.2% की एकाग्रता में डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) जोड़ें।
  3. दवा युक्त ग्लास ट्यूब की तैयारी
    1. माध्यम के प्रवाह को सुविधाजनक बनाने के लिए, एक छोटे बीकर में ग्लास ट्यूब की एक उपयुक्त लंबाई को सावधानीपूर्वक डालें। वायुमंडलीय दबाव के कारण माध्यम स्वाभाविक रूप से ग्लास ट्यूब में प्रवेश करेगा।
    2. जब संस्कृति माध्यम पूरी तरह से जम जाता है तो ग्लास ट्यूब को बाहर निकालें और एक छोर पर ड्रग्स युक्त संस्कृति माध्यम के साथ एक निगरानी ग्लास ट्यूब प्राप्त करने के लिए बाहरी दीवार को पोंछ दें।
    3. एक बीकर में ठोस पैराफिन को तब तक गर्म करें जब तक कि यह 70 डिग्री सेल्सियस पर पिघल न जाए, ग्लास ट्यूब के अंत को भोजन के करीब पैराफिन तरल में लगभग 5 मिमी के लिए डालें, और जल्दी से इसे हटा दें। ग्लास ट्यूब के भोजन के अंत को सील करने के लिए पैराफिन के जमने की प्रतीक्षा करें।

3. प्रायोगिक डिजाइन और फ्लाई उपचार

  1. तालिका 1 के बाद फ्लाई उपचार के लिए प्रयोग डिजाइन करें।

4. ड्रोसोफिला असेंबली और नींद की निगरानी

नोट: ड्रोसोफिला असेंबली की प्रक्रिया संशोधनों के साथ जिन एट अल .34 के काम का अनुसरण करती है।

  1. मक्खियों को सीओ2 गैस के साथ एनेस्थेटाइज करें, उन्हें पैराफिन-सील ग्लास ट्यूबों (प्रति ट्यूब एक) में डालें, और मक्खियों को भागने से रोकने और वायु परिसंचरण सुनिश्चित करने के लिए एक शोषक कपास की गेंद के साथ गैर-खाद्य छोर को अवरुद्ध करें।
  2. उनकी निगरानी के लिए इन्फ्रारेड मॉनिटर पर ट्यूब लोड करें।
    1. एक ही दिशा में एक अवरक्त मॉनिटर पर मक्खियों वाले ग्लास ट्यूबों को इकट्ठा करें, और प्रत्येक दवा के अनुरूप मॉनिटर नंबर और छेद संख्या रिकॉर्ड करें।
    2. प्रत्येक ट्यूब के संरेखण को समायोजित करें, और अवरक्त किरणों को मक्खी की गतिविधि सीमा के केंद्र से लंबवत रूप से पारित करें।
    3. मॉनिटर को फ्लाई स्लीप डार्करूम में स्थित 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर रखें, निर्दिष्ट सेटिंग्स का पालन करते हुए: 25 डिग्री सेल्सियस तापमान, ज़ीटगेबर 12 (जेडटी 12) (स्थानीय समय 08:00 बजे के बराबर), और जेडटी 24 (स्थानीय समय 08:00 बजे के बराबर)। यह सेटअप सुनिश्चित करता है कि मक्खियों को प्रकाश और अंधेरे के 12 घंटे की वैकल्पिक अवधि का अनुभव हो।
      नोट: निगरानी के दौरान इनक्यूबेटर में एक स्थिर वातावरण बनाए रखने के लिए निगरानी डेटा संग्रह पूरा होने तक दरवाजा न खोलने का प्रयास करें।
    4. DAM2 प्रणाली का उपयोग कर निगरानी प्रारंभ करें ( सामग्री की तालिका देखें).
    5. एक बार निगरानी पूरी हो जाने के बाद, सिस्टम से .txt प्रारूप में एकत्र किए गए डेटा को डाउनलोड करें।

5. डेटा प्रोसेसिंग

नोट: डीएएम सिस्टम, डैमफिलस्कैन 107, और एससीएमपी का उपयोग करके डेटा प्रोसेसिंग उनकी आधिकारिक वेबसाइटों पर दिए गए निर्देशों के अनुसार किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. स्कैनिंग के लिए उपरोक्त txt फ़ाइल को DAMFileScan107 सॉफ़्टवेयर में आयात करें और नींद डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यकतानुसार विभाजित करें।
    1. मॉनिटर शुरू करने के बाद तीसरी सुबह विभाजन डेटा का प्रारंभिक समय 8:01 (1 मिनट विभाजन) या 8:00 (30 मिनट विभाजन) पर सेट करें, और समाप्ति समय प्रारंभ समय के तीन दिन बाद 8:00 बजे है (चित्रा 2 ए 1)।
      नोट: मक्खियों को कम से कम एक दिन के लिए निगरानी वातावरण के अनुकूल होना चाहिए। इसलिए, मॉनिटर शुरू होने के बाद तीसरे दिन स्प्लिट डेटा स्टार्ट टाइम सुबह 8 बजे सेट किया जा सकता है।
    2. डेटा को 1 मिनट और 30 मिनट के अंतराल पर विभाजित करें। "बिन लंबाई" विकल्प को 1 मिनट में बदलें, "आउटपुट फ़ाइल प्रकार" विकल्प को चैनल फ़ाइलों में बदलें, नाम बदलें, और आउटपुट। 30 मिनट डेटा विभाजन विधि ऊपर के समान है (चित्रा 2 ए 2-5)।
      नोट: 1 मिनट और 30 मिनट के अंतराल पर डेटा विभाजन करते समय, दो फ़ाइलों का अंतिम नामकरण सुसंगत होना चाहिए; अन्यथा, यह बाद में मैटलैब प्रसंस्करण के दौरान अपठनीय हो सकता है। यदि आवश्यक हो, तो विभेदन की सुविधा के लिए आउटपुट के बाद फ़ाइल का नाम बदला जा सकता है।
  2. SCAMP2020 का उपयोग करके डेटा प्रोसेसिंग
    1. मैटलैब में प्रोग्राम पैकेज SCAMP2020 खोलें, और वेसी स्लीप और सर्कैडियन एनालिसिस मैटलैब प्रोग्राम (एससीएमपी) (चित्रा 2 बी) पर डबल-क्लिक करें।
    2. पथ में इसके सबफ़ोल्डर "वेसी एससीएएमपी स्क्रिप्ट" जोड़ें, उस फ़ोल्डर में फ़ाइल "scamp.m" ढूंढें, और इसे चलाएं। निम्न पॉप-अप विंडो में, अनुक्रम में प्रक्रिया 1 मिनट और 30 मिनट फ़ोल्डरका चयन करें (चित्रा 2 सी, डी)।
    3. एक मॉनिटर का चयन करें, पूर्वावलोकन करने के लिए प्लॉट देखें लोड करें पर क्लिक करें (चित्रा 3 ए 1), और दिखाई देने वाली छवि की जांच करें। मृत मक्खियों के संबंधित चैनल को अनचेक करें (चित्रा 3 ए 2, चित्रा 3 बी)।
    4. सभी मॉनिटरों की जाँच करने के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएँ।
    5. परीक्षण की जाने वाली संबंधित दवा (चित्रा 3 ए 3) के आधार पर प्रत्येक मॉनिटर में प्रत्येक चैनल का नाम बदलें, सभी मॉनिटर का चयन करें, और विश्लेषण के लिए चयनित डेटा का विश्लेषण करें (चित्रा 3 ए 4) पर क्लिक करें।
    6. चयनित विकल्प के लिए डिफ़ॉल्ट रूप से, चुने हुए बिन के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें, डेटा निर्यात करें, और अंत में चयनित समूहों के लिए सभी दिनों के लिए ग्राफ 30 मिनट डेटा प्रकार पर क्लिक करें और परिणामों को आउटपुट करने के लिए सभी डेटा निर्यात करें (चित्रा 3 सी)।
  3. CSV फ़ाइल से s30 नामक फ़ाइल का चयन करें, प्रत्येक मॉनिटर के लिए संगत माध्य मान और मानक त्रुटि डेटा ढूंढें, संशोधन और समायोजन के लिए इसे Excel में बैकअप लें, और नींद की स्थिति आरेख (चित्रा 4A, B) बनाने के लिए इसे GraphPad प्रिज्म (सामग्री की तालिका देखें) में पेस्ट करें।
  4. "Stdur" नामक फ़ाइल का पता लगाएं और तीन दिनों के भीतर प्रत्येक मक्खी के लिए दिन, रात और कुल नींद के औसत मूल्यों की गणना करें (चित्रा 4 ए, सी)। अंतर परीक्षण को पूरा करने और ग्राफ खींचने के लिए डेटा को प्रिज्म सॉफ्टवेयर में पेस्ट करें।

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Representative Results

रेसेरपाइन वेसिकुलर मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर (वीएमएटी) का एक छोटा-अणु अवरोधक है, जो प्रीसिनेप्टिक पुटिकाओं में मोनोमाइन के पुन: उत्थान को रोकता है,जिससे नींद में वृद्धि होती है। 30 दिन पुरानी मक्खियों में रेसेरपाइन के नींद को बढ़ावा देने वाले प्रभावों की जांच की गई, जिसमें नियंत्रण समूह को पूरी तरह से विलायक डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ खिलाया गया। रेसेरपाइन समूह में, पुरानी मक्खियों ने डीएमएसओ समूह की तुलना में दिन और रात दोनों के दौरान नींद में काफी वृद्धि का प्रदर्शन किया। चित्रा 5 ए, ई लगातार तीन दिनों में रेसेरपाइन और डीएमएसओ मक्खियों के नींद के पैटर्न को चित्रित करता है, जबकि चित्रा 5 बी-डी और चित्रा 5 एफ-एच नींद डेटा पर अंतर परीक्षण के परिणाम दिखाते हैं। विशेष रूप से एक लिंग पर काम करने वाली दवा की संभावना को खत्म करने के लिए, नर मक्खियों का उपयोग करके प्रयोगों को दोहराया गया था। रेसेरपाइन की विभिन्न सांद्रता, 20 μM, और 50 μM, प्रशासित किए गए थे, जो Reserpine एकाग्रता और नींद को बढ़ावा देने के बीच एक सकारात्मक सहसंबंध का प्रदर्शन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: उम्र से संबंधित नींद विकारों प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए छोटी आणविक दवा स्क्रीनिंग। बुजुर्ग मक्खियों को एक छोटी कांच की ट्यूब में रखा गया था, जिसमें परीक्षण की जाने वाली दवाओं वाले भोजन थे। डीएएम प्रणाली का उपयोग करके तीन दिनों के लिए नींद के पैटर्न की लगातार निगरानी की गई। अधिग्रहित डेटा को प्रसंस्करण, विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण के लिए कंप्यूटर में आयात किया गया था, जिससे निष्कर्ष निकला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्कैनिंग और डेटा का विभाजन। (ए) डेटा चयन और स्कैनिंग, इसके बाद अनुक्रमिक अस्थायी विभाजन। (बी) "वेसी स्लीप एंड सर्कैडियन एनालिसिस मैटलैब प्रोग्राम (एससीएमपी)" फ़ोल्डर का स्थान। (सी) पथ में सबफ़ोल्डर "वेसी एससीएएमपी स्क्रिप्ट" को जोड़ना। (डी) फ़ाइल "scamp.m" का स्थान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नींद डेटा का चयन और प्रसंस्करण। (ए) मक्खी की नींद की स्थिति का पूर्वावलोकन, मृत मक्खियों के लिए चैनल की जांच करना, और चयनित डेटा को समूहीकृत करना और विश्लेषण करना। (बी) ड्रोसोफिला नींद का पूर्वावलोकन, जहां एक समान नीला आयत सक्रिय नींद को इंगित करता है, जबकि एक समान नीले आयत का एक निश्चित क्षण बताता है कि मक्खी मर चुकी है। मृत मक्खियों को लाल आयताकार के साथ चिह्नित किया जाता है। (सी) चयनित डेटा का विश्लेषण और आउटपुट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नींद डेटा विश्लेषण के परिणाम । (ए) सीएसवी फ़ाइल से एस 30 और एसटीडीआर फाइलों का चयन। (बी) "एस 30" में प्रत्येक समूह के लिए नींद के औसत (एसईएम) का औसत मूल्य और मानक त्रुटि.csv। (सी) दिन के समय (बिन 1, बिन 3, बिन 5), रात के समय (बिन 2, बिन 4, बिन 6), और प्रत्येक मक्खी के लिए कुल नींद का मान तीन दिनों के भीतर "स्टेडर.csv में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: वृद्ध मक्खियों की नींद की स्थिति का इलाज रेसेरपिन के साथ किया जाता है। (ए) वृद्ध महिलाओं में 3 दिनों के भीतर नींद के समय का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 0.2% डीएमएसओ, 20 μM Reserpin, और 50 μM Reserpine. (B-D) दवाओं के साथ या बिना 3 दिनों के भीतर औसत दिन, रात और कुल नींद के समय का मात्रात्मक विश्लेषण। परिणाम वृद्ध महिलाओं में नींद के समय में उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित करते हैं जिन्हें रेसेरपिन खिलाया जाता है। एन = 8 प्रत्येक समूह के लिए, वन-वे एनोवा, ** पी < 0.01, ***पी < 0.001। (ई) वृद्ध पुरुषों में 3 दिनों के भीतर नींद के समय का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 0.2% डीएमएसओ, 20 μM Reserpin, और 50 μM Reserpine. (F-H) दवाओं के साथ या बिना 3 दिनों के भीतर औसत दिन, रात और कुल नींद के समय का मात्रात्मक विश्लेषण। परिणाम बताते हैं कि रेसेरपिन खिलाए गए पुरुषों में नींद का समय बढ़ गया है। n = 16 प्रत्येक समूह के लिए, वन-वे ANOVA, *p < 0.05, **p < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: युवा और वृद्ध मक्खियों के बीच नींद की अवधि की तुलना। (ए) योजनाबद्ध आरेख युवा और वृद्ध पुरुषों में 3 दिनों में नींद की अवधि की निगरानी को दर्शाता है। (B-D) युवा और बूढ़े पुरुषों में 3 दिनों में औसत दिन, रात और कुल नींद के समय के मात्रात्मक विश्लेषण से कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला। एन = 32 प्रत्येक समूह के लिए, अप्रकाशित टी-टेस्ट, एन.एस., महत्वपूर्ण नहीं है। (ई) युवा और वृद्ध महिलाओं में 3 दिनों से अधिक नींद की अवधि की योजनाबद्ध निगरानी। (F-H) युवा और वृद्ध महिलाओं में 3 दिनों में औसत दिन, रात और कुल नींद के समय के मात्रात्मक विश्लेषण ने युवा महिलाओं की तुलना में वृद्ध महिलाओं में दिन, रात और कुल नींद के समय में उल्लेखनीय कमी का प्रदर्शन किया। n = 32 प्रत्येक समूह के लिए, अप्रकाशित टी-टेस्ट, ****p < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समूह अध्ययन समूह उपचार मक्खियों की उम्र और लिंग मक्खियों की संख्या
Equation 1 सामान्य नियंत्रण 4 दिनों के लिए 0.2% डीएमएसओ के साथ 4 एमएल सरल संस्कृति माध्यम 30 दिन पुरुष / महिलाएं प्रति समूह 16 मक्खियाँ
Equation 2 कम खुराक वाली दवा परीक्षणEquation 6 4 दिनों के लिए 20 μM reserpine के साथ 4 mL सरल संस्कृति माध्यम 30 दिन महिलाएं प्रति समूह 16 मक्खियाँ
Equation 3 उच्च खुराक दवा परीक्षणEquation 6 4 दिनों के लिए 50 μM reserpine के साथ 4 mL सरल संस्कृति माध्यम 30 दिन महिलाएं प्रति समूह 16 मक्खियाँ
Equation 4 कम खुराक वाली दवा परीक्षणEquation 7 4 दिनों के लिए 20 μM reserpine के साथ 4 mL सरल संस्कृति माध्यम 30 दिन पुरुष प्रति समूह 16 मक्खियाँ
Equation 5 उच्च खुराक दवा परीक्षणEquation 7 4 दिनों के लिए 50 μM reserpine के साथ 4 mL सरल संस्कृति माध्यम 30 दिन पुरुष प्रति समूह 16 मक्खियाँ

तालिका 1: मक्खी उपचार के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन।

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Discussion

वर्णित विधि तेजी से छोटे और मध्यम आकार की नींद की दवाओं की जांच के लिए उपयुक्त है। वर्तमान में, अधिकांश मुख्यधारा के उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग विधियां जैव रासायनिक और सेलुलर स्तरों पर आधारित हैं। उदाहरण के लिए, रिसेप्टर की संरचना और गुणों की जांच विशिष्ट लिगेंड की खोज के लिए की जाती हैजो इसे बांध सकते हैं। एक अन्य दृष्टिकोण में मास स्पेक्ट्रोमेट्री35 के साथ परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) का उपयोग करके चयनित दवाओं के आणविक टुकड़ों के बाध्यकारी मोड और ताकत का विश्लेषण करना शामिल है। हालांकि, इन विधियों में अक्सर अपेक्षाकृत उच्च स्क्रीनिंग त्रुटि दर होती है, और उनके माध्यम से चुनी गई दवाएं अक्सर पशु या नैदानिक प्रयोगों में कोई प्रभाव नहीं दिखाती हैं। शरीर में दवाओं की प्रभावकारिता विभिन्न कारकों से प्रभावित होती है, जैसे कि दवा अवशोषण, वितरण, चयापचय और उत्सर्जन, जिससे झूठी स्क्रीनिंग की उच्च दर होती है। इसके विपरीत, हालांकि हमारी प्रस्तावित विधि में उच्च-थ्रूपुट विधियों की तुलना में एक छोटा स्क्रीनिंग स्केल है, यह फेनोटाइप ्स पर दवा के प्रभावों को सीधे देखकर एक अधिक सरल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह प्रभावी दवा स्क्रीनिंग और दवा लक्ष्यों की पहचान के लिए ड्रोसोफिला मॉडल का उपयोग करने की क्षमता को दर्शाता है।

ड्रोसोफिला में एक संरक्षित नींद विनियमन तंत्र होता है और उम्र बढ़ने से जुड़ी नींद की गड़बड़ी प्रदर्शित करता है। हमने देखा कि 30 दिन की मादा मक्खियों की नींद की अवधि 7-दिन की मक्खियों की तुलना में काफी कम थी, जबकि 30-दिन की नर मक्खियों की नींद की अवधि 7-दिन की मक्खियों से काफी भिन्न नहीं थी (चित्रा 6)। नतीजतन, वर्तमान प्रयोगों के लिए 30 दिन पुरानी मादा मक्खियों का चयन किया गया था। आकस्मिक कारक हस्तक्षेप को कम करने के लिए कई राउंड में स्क्रीनिंग प्रक्रिया आयोजित की गई थी। पहले दौर में दवा की एकाग्रता विषाक्त दुष्प्रभावों से बचने के लिए 20 μM पर सेट की गई थी जो मक्खी मृत्यु दर का कारण बन सकती है। दूसरे स्क्रीनिंग राउंड में, विभिन्न सांद्रता पर दवा के प्रभावों का आकलन करने के लिए दवा एकाग्रता को 50 μM तक बढ़ाया गया था। दूसरे दौर से चुनी गई दवाओं को दवा के प्रभाव ों में लिंग अंतर का मूल्यांकन करने के लिए 20 μM और 50 μM दोनों पर नर मक्खियों को प्रशासित किया गया था। इसने उन दवाओं के लिए स्क्रीन करने की अनुमति दी जो लगातार नींद से संबंधित प्रभावों का प्रदर्शन करते थे। उदाहरण के लिए, रेसेरपाइन को पहले 4-6 दिन31 वर्ष की आयु की वयस्क मक्खियों में नींद बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। हमने पुरानी मक्खियों का उपयोग करके अपने मॉडल में इस परिणाम को सफलतापूर्वक दोहराया, जहां वृद्ध महिलाओं ने रेसेरपाइन (चित्रा 5) प्रशासित होने के बाद नींद में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई।

दवाओं को भंग करने के लिए डीएमएसओ का उपयोग किया गया था, लेकिन इसकी संभावित विषाक्तता पर विचार किया जाना चाहिए। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि संस्कृति माध्यम में 0.1% से 0.25% डीएमएसओ की सांद्रता 24 घंटे के भीतर चूहे के बालों की कोशिकाओं को नुकसान नहीं पहुंचाती है, जबकि 0.5% से 6% की सांद्रता कोशिका मृत्यु36 में काफी वृद्धि करती है। इसी तरह, यह पाया गया है कि 0.1% या उससे कम की डीएमएसओ सांद्रता मानव हेपेटोसाइट्स में प्रमुख दवा चयापचय से संबंधित एंजाइमों या ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करती है। फिर भी, उच्च सांद्रता अभिव्यक्ति37 में परिवर्तन को प्रेरित कर सकती है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि 0.1% डीएमएसओ मादा मक्खियों के जीवनकाल को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करने के लिए पाया गया है, लेकिन पुरुषोंको नहीं। इसके अतिरिक्त, 15% और 20% डीएमएसओ के इंट्रापरिटोनियल प्रशासन को चूहों में नींद में हस्तक्षेपकरने के लिए दिखाया गया है। डीएमएसओ की संभावित विषाक्तता को कम करने के लिए, हमने इसकी एकाग्रता को 0.2% से नीचे रखा।

वर्तमान में, ड्रोसोफिला के व्यवहार को चिह्नित करने के लिए दो मुख्य तरीकों का उपयोग किया जाता है। एक विधि वीडियो विश्लेषण पर आधारित है, जो व्यवहार मापदंडों का खजाना प्रदान करती है, जिसमें मक्खी की स्थिति, गति और शरीर के अंगों के सूक्ष्म आंदोलन शामिल हैं। अन्य विधि अवरक्त बीम फ्रैक्चर पर आधारित है, जैसे कि डीएएम प्रणाली। 40. हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पाइसोलो जैसे कुछ वीडियो विश्लेषण उपकरण कई एकल-निवासी मक्खियों का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, जो मक्खियों की संख्या को सीमित करते हैं जिन्हें कैमरे41 के नीचे रखा जा सकता है। सी-ट्रैक्स42 और जेएएबीए43 जैसे अन्य उपकरण जनसंख्या ट्रैकिंग कर सकते हैं लेकिन कम्प्यूटेशनल रूप से महंगे और समय लेने वाले हैं। उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए, मक्खियों की समग्र नींद की अवधि को कैप्चर करना आमतौर पर पर्याप्त होता है, और सटीक आंदोलन पैरामीटर आवश्यक नहीं होते हैं। इसलिए, इन्फ्रारेड बीम फ्रैक्चर पर आधारित व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली और अत्यधिक स्केलेबल विधि पसंद की जाती है। हालांकि, इस विधि की अपनी सीमाएं भी हैं। उदाहरण के लिए, यदि मक्खियां अवरक्त बीम को बाधित किए बिना ट्यूब के केवल एक छोर पर चलती हैं, तो सिस्टम गलती से इसे नींद के रूप में रिकॉर्ड कर सकता है,जिससे नींद की अतिवृद्धि हो सकती है। इसके अतिरिक्त, अनपेक्षित प्रभावों से बचने के लिए स्क्रीनिंग में इसका उपयोग करने से पहले फ्लाई स्ट्रेन की गतिशीलता का सावधानीपूर्वक परीक्षण करना महत्वपूर्ण है।

एक सफल सेटअप के लिए यहां कुछ उपयोगी सुझाव दिए गए हैं: (1) ठोसकरण के बाद छोटे बीकर से हटाते समय भोजन को ग्लास ट्यूब से चिपकने से रोकने के लिए, भोजन के जमने से पहले ग्लास ट्यूब को छोटे बीकर के तल में लंबवत रूप से डालने की कोशिश की जा सकती है। धीरे से ग्लास ट्यूब को आगे और पीछे खींचना, हवा को प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए बीकर के निचले हिस्से को टैप करना, धीरे-धीरे सभी भोजन और ग्लास ट्यूब को हटाने के लिए बीकर को घुमाना, और फिर ग्लास ट्यूब की बाहरी दीवार पर किसी भी शेष भोजन को सावधानीपूर्वक पोंछना प्रभावी हो सकता है। (2) पैराफिन फिल्म के साथ ग्लास ट्यूब के भोजन के अंत को सील करते समय, पैराफिन पिघलने तक फिल्म को धीरे-धीरे गर्म करने के लिए पानी के स्नान का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह दृष्टिकोण उच्च तापमान पर हिंसक रूप से औषधीय भोजन की समस्या से बचने और पैराफिन फिल्म को दूषित करने में मदद करता है। वैकल्पिक रूप से, कोई सीलिंग के लिए छोटी प्लास्टिक टोपियों का उपयोग कर सकता है, लेकिन सुनिश्चित करें कि सीलिंग के दौरान हवा प्रवेश कर सकती है, जिससे भोजन समग्र रूप से ऊपर जा सकता है। (3) यह विचार करने योग्य है कि कुछ शक्तिशाली नींद को बढ़ावा देने वाली दवाएं शुरू में परीक्षण की गई मक्खियों को मृत के रूप में गलत निर्णय दे सकती हैं। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, एक एकाग्रता ढाल निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है, जिससे इष्टतम दवा एकाग्रता की खोज और प्रयोग को दोहराया जा सके। (4) ध्यान रखें कि दवा की गंध मक्खियों द्वारा खाए गए भोजन की मात्रा और दवा के उनके सेवन को प्रभावित कर सकती है, संभावित रूप से प्रयोगात्मक परिणामों की सटीकता को प्रभावित कर सकती है। इसलिए, प्रयोग की अवधि को उचित रूप से बढ़ाना फायदेमंद हो सकता है, यह सुनिश्चित करना कि मक्खियों के पास जितना संभव हो उतना दवा का उपभोग करने और दवा के संचय प्रभाव को बढ़ाने के लिए पर्याप्त समय है। (5) डेटा प्रोसेसिंग के लिए, जबकि कई विश्वविद्यालयों और संस्थानों के पास सार्वजनिक उपयोग के लिए मैटलैब तक पहुंच है, ऐसे व्यक्तियों या अनुसंधान संस्थानों के लिए कम लागत वाले विकल्प उपलब्ध हैं जिन्होंने अभी तक कार्यक्रम नहीं खरीदा है। एक अनुशंसित विकल्प शाइनआर-डीएएम v3.1 «ताज़ा»45 है।

अंत में, हमने नींद विकारों के इलाज के लिए दवाओं की स्क्रीनिंग के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया विकसित की है। कम नींद की अवधि के फेनोटाइप का प्रदर्शन करने वाले एक पुराने फ्लाई मॉडल का उपयोग करते हुए, पुरानी मादा मक्खियों में नींद की अवधि बढ़ाने में रेसेरपाइन की प्रभावकारिता को मान्य किया जाता है। यह विधि महत्वपूर्ण अनुप्रयोग क्षमता के साथ दवा स्क्रीनिंग के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करती है और आगे के दवा अनुसंधान के लिए एक नींव के रूप में कार्य करती है। जबकि दवा के प्रभाव का मूल्यांकन फेनोटाइप के आधार पर किया जाता है, दवा कार्रवाई का अंतर्निहित तंत्र अज्ञात रहता है। नींद विकारों की विकृति और नींद के आणविक विनियमन की जांच के लिए आगे के अध्ययन आयोजित किए जाएंगे, जिससे इसमें शामिल औषधीय तंत्र पर प्रकाश डाला जाएगा। यद्यपि ड्रोसोफिला में सर्कैडियन मशीनरी मानव ऑसिलेटर्स के समान है, मनुष्यों और मक्खियों के बीच नींद नियंत्रण तंत्र में अंतर को अनदेखा नहीं किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल नींद विकारों के लिए दवा स्क्रीनिंग के लिए एक बुनियादी ढांचा प्रदान करता है। हालांकि, भविष्य के शोध यह निर्धारित करेंगे कि क्या स्क्रीनिंग की गई दवाओं में से किसी का उपयोग नैदानिक उपचार के लिए किया जा सकता है, साथ ही साथ उनकी कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम प्रोफेसर जुन्हाई हान के प्रयोगशाला सदस्यों को उनकी चर्चा और टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को वाई.टी. के 32170970 चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन और जियांग्सू प्रांत के "साइनिन ब्लू प्रोजेक्ट" द्वारा जेडसीजेड द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

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