Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

High-throughput Small Molecule Drug Screening for aldersrelaterede søvnforstyrrelser ved hjælp af Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

Præsenteret er en protokol til high-throughput lægemiddelscreening for at forbedre søvn ved at overvåge søvnadfærd hos bananfluer i en ældre Drosophila-model .

Abstract

Søvn, en væsentlig komponent i sundhed og generelt velvære, giver ofte udfordringer for ældre personer, der ofte oplever søvnforstyrrelser præget af forkortet søvnvarighed og fragmenterede mønstre. Disse søvnforstyrrelser korrelerer også med en øget risiko for forskellige sygdomme hos ældre, herunder diabetes, hjerte-kar-sygdomme og psykiske lidelser. Desværre er eksisterende lægemidler til søvnforstyrrelser forbundet med betydelige bivirkninger såsom kognitiv svækkelse og afhængighed. Derfor er der et presserende behov for udvikling af nye, sikrere og mere effektive søvnforstyrrelsesmedicin. De høje omkostninger og den lange eksperimentelle varighed af de nuværende lægemiddelscreeningsmetoder er dog fortsat begrænsende faktorer.

Denne protokol beskriver en omkostningseffektiv screeningsmetode med høj kapacitet, der bruger Drosophila melanogaster, en art med en meget bevaret søvnreguleringsmekanisme sammenlignet med pattedyr, hvilket gør den til en ideel model til at studere søvnforstyrrelser hos ældre. Ved at administrere forskellige små forbindelser til ældre fluer kan vi vurdere deres virkninger på søvnforstyrrelser. Disse fluers søvnadfærd registreres ved hjælp af en infrarød overvågningsenhed og analyseres med open source-datapakken Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Denne protokol tilbyder en billig, reproducerbar og effektiv screeningsmetode til søvnregulering. Frugtfluer tjener på grund af deres korte livscyklus, lave husdyrbrugsomkostninger og lette håndtering som fremragende emner til denne metode. Som en illustration viste Reserpine, et af de testede lægemidler, evnen til at fremme søvnvarighed hos ældre fluer og fremhævede effektiviteten af denne protokol.

Introduction

Søvn, en af de væsentlige adfærd, der er nødvendige for menneskelig overlevelse, er kendetegnet ved to hovedtilstande: hurtig øjenbevægelse (REM) søvn og ikke-hurtig øjenbevægelse (NREM) søvn1. NREM-søvn består af tre faser: N1 (overgangen mellem vågenhed og søvn), N2 (let søvn) og N3 (dyb søvn, langsom bølgesøvn), der repræsenterer progressionen fra vågenhed til dyb søvn1. Søvn spiller en afgørende rolle for både fysisk og mental sundhed2. Imidlertid reducerer aldring den samlede søvnvarighed, søvneffektivitet, søvnprocent med langsom bølge og REM-søvnprocent hos voksne3. Ældre personer har tendens til at bruge mere tid i let søvn sammenlignet med langsom bølgesøvn, hvilket gør dem mere følsomme over for natlige opvågninger. Når antallet af opvågninger stiger, falder den gennemsnitlige søvntid, hvilket resulterer i et fragmenteret søvnmønster hos ældre, hvilket kan være forbundet med overdreven excitation af HCRT-neuroner hos mus4. Derudover bidrager aldersrelaterede fald i døgnrytmemekanismer til et tidligere skift i søvnvarighed 5,6. I kombination med fysisk sygdom, psykologisk stress, miljøfaktorer og medicinbrug gør disse faktorer ældre voksne mere modtagelige for søvnforstyrrelser, såsom søvnløshed, REM-søvnadfærdsforstyrrelse, narkolepsi, periodiske benbevægelser, rastløse bensyndrom og søvnforstyrret vejrtrækning 7,8.

Epidemiologiske undersøgelser har vist, at søvnforstyrrelser er tæt forbundet med kroniske sygdomme hos ældre9, herunder depression10, hjerte-kar-sygdom 11 og demens12. Håndtering af søvnforstyrrelser spiller en afgørende rolle i forbedring og behandling af kroniske sygdomme og forbedring af livskvaliteten for ældre voksne. I øjeblikket er patienter primært afhængige af lægemidler som benzodiazepiner, ikke-benzodiazepiner og melatoninreceptoragonister for at forbedre søvnkvaliteten13. Benzodiazepiner kan imidlertid føre til nedregulering af receptorer og afhængighed efter langvarig brug, hvilket forårsager alvorlige abstinenssymptomer ved seponering14,15. Ikke-benzodiazepiner indebærer også risici, herunder demens16, brud17 og kræft18. Den almindeligt anvendte melatoninreceptoragonist, ramelteon, reducerer søvnlatens, men øger ikke søvnvarigheden og har leverfunktionsrelaterede bekymringer på grund af omfattende eliminering af første pass19. Agomelatin, en melatoninreceptoragonist og serotoninreceptorantagonist, forbedrer depressionsrelateret søvnløshed, men udgør også en risiko for leverskade20. Derfor er der et presserende behov for sikrere lægemidler til behandling eller lindring af søvnforstyrrelser. De nuværende lægemiddelscreeningsstrategier, der er baseret på molekylære og cellulære eksperimenter kombineret med automatiserede systemer og computeranalyse, er imidlertid dyre og tidskrævende21. Strukturbaserede lægemiddeldesignstrategier, der er afhængige af receptorstruktur og egenskaber, kræver en klar forståelse af receptorens tredimensionelle struktur og mangler prædiktive evner for lægemiddeleffekter22.

I 2000, baseret på søvnkriterierne foreslået af Campbell og Tobler i 1984 23, etablerede forskere enkle dyremodeller til at studere søvn 24, herunder Drosophila melanogaster, som udviste søvnlignende tilstande25,26. På trods af anatomiske forskelle mellem Drosophila og mennesker bevares mange neurokemiske komponenter og signalveje, der regulerer søvn i Drosophila, i pattedyrs søvn, hvilket letter undersøgelsen af menneskelige neurologiske sygdomme27,28. Drosophila anvendes også i vid udstrækning i døgnrytmeundersøgelser på trods af forskelle i kerneoscillatorer mellem fluer og pattedyr 29,30,31. Derfor tjener Drosophila som en værdifuld modelorganisme til at studere søvnadfærd og udføre søvnrelateret lægemiddelscreening.

Denne undersøgelse foreslår en omkostningseffektiv og enkel fænotypebaseret tilgang til screening af småmolekylære lægemidler til behandling af søvnforstyrrelser ved hjælp af ældre fluer. Søvnregulering i Drosophila er meget bevaret25, og faldet i søvn observeret med alderen kan være reversibel gennem lægemiddeladministration. Således kan denne søvnfænotypebaserede screeningsmetode intuitivt afspejle lægemiddeleffektivitet. Vi fodrer fluerne med en blanding af det undersøgte lægemiddel og mad, overvåger og registrerer søvnadfærd ved hjælp af Drosophila Activity Monitor (DAM)32 og analyserer de erhvervede data ved hjælp af open source SCAMP2020 datapakken i MATLAB (figur 1). Statistisk analyse udføres ved hjælp af statistik og grafsoftware (se materialetabel). Som et eksempel demonstrerer vi effektiviteten af denne protokol ved at præsentere eksperimentelle data om Reserpin, en småmolekylehæmmer af den vesikulære monoamintransportør, der rapporteres at øge søvn33. Denne protokol giver en værdifuld tilgang til at identificere lægemidler til behandling af aldersrelaterede søvnproblemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol bruger de 30 dage gamle w1118 fluer fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, se materialetabel).

1. Tilberedning af de gamle bananfluer

  1. Tilberedning af mad
    1. Forbered standard majsstivelseskulturmedium ved at blande 50 g / L cornflakes, 110 g / L sukker, 5 g / L agar og 25 g / L gær. Opvarm cornflakes og gær med vand for at gelatinere, og opløs derefter alle stofferne helt.
    2. Når mediet afkøles til 50-60 °C, tilsættes 6 ml/l propionsyre og pakkes straks i dyrkningsflasker.
  2. Flueopdræt og klargøring af ældre fluer
    1. Opdræt fluestammen w1118i flasker, der indeholder et standard majsstivelseskulturmedium, og læg flasker i en konstant temperaturinkubator ved 25 ° C, 68% relativ luftfugtighed, 500-1000 lux lysforhold og en 12 timer: 12 timers lys: mørk cyklus.
    2. Overfør fluer til en ny flaske hver 7. dag i henhold til fluernes vækstcyklus, idet alderen på individer i samme flaske holdes konsistent.
    3. Saml det nye parti fluer, der klækkes fra den originale flaske 3 dage efter overførsel af dem, og læg dem i en ny flaske. Efter princippet om at skifte flaske hver 7. dag, vil de blive dyrket, indtil de er omkring 30 dage gamle.

2. Tilberedning af medicinske fødevarer og glasrør til overvågning

BEMÆRK: Proceduren for fremstilling af glasrør følger Jin et al.'s arbejde med modifikationer34.

  1. Rengøring og tørring af glasrør
    1. Anbring glasrøret (5 mm i diameter x 65 mm i længden, se materialetabellen) i et stort bægerglas, blød det i blød og kog det med dobbeltdestilleret vand i 20 minutter. Gentag 3 gange.
    2. Fjern og bundt glasrøret, skyl indersiden med dobbeltdestilleret vand 3-5 gange, og læg det i en ovn til tørring.
  2. Fremstilling af simpelt dyrkningsmedium (100 ml)
    1. 1,5 g agar og 5 g saccharose opløses i dobbeltdestilleret vand, opvarmes og koncentreres til 100 ml.
    2. Der tilsættes 600 μL propionsyre, når mediet afkøles til ca. 70 °C, hvorved det forhindres i at størkne ved hjælp af et vandbad med konstant temperatur.
    3. Der tilsættes ca. 4 ml simpelt medium og Reserpin (se materialetabel) i et lille 10 ml bægerglas, indtil lægemidlet når 20 μM eller 50 μM. Der tilsættes dimethylsulfoxid (DMSO) til koncentrationen på 0,2% i den negative kontrolgruppe.
  3. Fremstilling af glasrørene indeholdende medicin
    1. For at lette mediets strømning skal du forsigtigt indsætte en passende længde glasrør i et lille bægerglas. Mediet kommer naturligt ind i glasrøret på grund af atmosfærisk tryk.
    2. Træk glasrøret ud, når dyrkningsmediet er helt størknet, og tør ydervæggen af for at opnå et overvågningsglasrør med et dyrkningsmedium indeholdende lægemidler i den ene ende.
    3. Den faste paraffin opvarmes i et bægerglas, indtil det smelter ved 70 °C, sætter enden af glasrøret tæt på maden i paraffinvæsken i ca. 5 mm, og fjern det hurtigt. Vent på, at paraffinen størkner for at forsegle madenden af glasrøret.

3. Eksperimentelt design og fluebehandling

  1. Design forsøget til fluebehandlingen efter tabel 1.

4. Drosophila samling og søvn overvågning

BEMÆRK: Proceduren for Drosophila-samling følger Jin et al.34's arbejde med ændringer.

  1. Bedøv fluer med CO2 -gas, læg dem i paraffinforseglede glasrør (et pr. Rør), og bloker nonfood-enden med en absorberende bomuldskugle for at forhindre fluer i at undslippe og sikre luftcirkulation.
  2. Læg rør på den infrarøde skærm til overvågning af dem.
    1. Saml glasrørene indeholdende fluer på en infrarød skærm i samme retning, og registrer monitornummeret og hulnummeret svarende til hvert lægemiddel.
    2. Juster justeringen af hvert rør, og få de infrarøde stråler til at passere lodret gennem midten af fluens aktivitetsområde.
    3. Placer skærmen inde i en 25 °C inkubator placeret i fluesøvnens mørkekammer ved at følge de angivne indstillinger: 25 °C temperatur, Zeitgeber 12 (ZT12) (svarende til lokal tid 08:00) og ZT24 (svarende til lokal tid 08:00). Denne opsætning sikrer, at fluerne oplever vekslende perioder på 12 timers lys og mørke.
      BEMÆRK: Prøv ikke at åbne døren, før overvågningen af dataindsamlingen er afsluttet for at opretholde et stabilt miljø i inkubatoren under overvågningen.
    4. Start overvågningen ved hjælp af DAM2-systemet (se materialetabel).
    5. Når overvågningen er afsluttet, skal du downloade de indsamlede data i .txt format fra systemet.

5. Databehandling

BEMÆRK: Databehandlingen ved hjælp af DAM-systemet, DAMFileScan107 og SCAMP blev udført i henhold til instruktionerne på deres officielle hjemmesider (se materialetabel).

  1. Importer ovenstående txt-fil til DAMFileScan107-software til scanning og del den efter behov for at få søvndata.
    1. Indstil starttidspunktet for segmenteringsdata til 8:01 (1 min segmentering) eller 8:00 (30 min segmentering) den tredje morgen efter start af skærmene, og afslutningstidspunktet er 8:00 tre dage efter starttidspunktet (figur 2A1).
      BEMÆRK: Fluer skal tilpasse sig overvågningsmiljøet i mindst en dag. Så man kan indstille starttidspunktet for delte data til kl. 8 på den tredje dag efter, at skærmen begynder.
    2. Opdel dataene med intervaller på 1 min og 30 min. Skift indstillingen "Bin Length" til 1 minut, skift indstillingen "Output File Type" til kanalfiler, omdøb og output. Datasegmenteringsmetoden på 30 minutter er den samme som ovenfor (figur 2A2-5).
      BEMÆRK: Når du udfører datasegmentering med intervaller på 1 min og 30 minutter, skal den endelige omdøbning af de to filer være konsekvent; Ellers kan det være ulæseligt under efterfølgende Matlab-behandling. Om nødvendigt kan filnavnet ændres efter output for at lette differentiering.
  2. Databehandling ved hjælp af SCAMP2020
    1. Åbn programpakken SCAMP2020 i Matlab, og dobbeltklik på Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (figur 2B).
    2. Tilføj dens undermappe "Vecsey SCAMP Scripts" til stien, find filen "scamp.m" i den mappe, og kør den. I det følgende pop op-vindue skal du vælge processen 1 min og 30 min mapper i rækkefølge (figur 2C, D).
    3. Vælg en skærm, klik på Indlæs individuelle Se grunde , der skal forhåndsvises (figur 3A1), og kontroller det billede, der vises. Fjern markeringen af den tilsvarende kanal for døde fluer (figur 3A2, figur 3B).
    4. Gentag ovenstående trin for at kontrollere alle skærme.
    5. Omdøb hver kanal i hver skærm baseret på det tilsvarende lægemiddel, der skal testes (figur 3A3), vælg alle skærme, og klik på ANALYSER valgte data til analyse (figur 3A4).
    6. Standard til den valgte indstilling, klik på Analysér for valgt papirkurv, tjek Eksporter data, og klik til sidst på GRAPH 30 min Datatyper for alle dage for valgte grupper og EKSPORTER alle data for at output resultaterne (figur 3C).
  3. Vælg filen med navnet s30 fra CSV-filen, find den tilsvarende middelværdi og standardfejldata for hver skærm, sikkerhedskopier den til Excel til ændring og justering, og indsæt den i GraphPad Prism (se materialetabel) for at tegne et søvnstatusdiagram (figur 4A, B).
  4. Find filen med navnet "stdur", og beregn gennemsnitsværdierne for dagtimerne, natten og den samlede søvn for hver flue inden for tre dage (figur 4A, C). Indsæt dataene i Prisme-softwaren for at fuldføre forskelstesten og tegne en graf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reserpin er en småmolekylehæmmer af den vesikulære monoamintransportør (VMAT), som hæmmer genoptagelsen af monoaminer i præsynaptiske vesikler, hvilket fører til øget søvn33. De søvnfremmende virkninger af Reserpin blev undersøgt hos 30 dage gamle fluer, hvor kontrolgruppen udelukkende blev fodret med opløsningsmidlet dimethylsulfoxid (DMSO). I Reserpine-gruppen udviste ældre fluer signifikant øget søvn både dag og nat sammenlignet med DMSO-gruppen. Figur 5A,E illustrerer søvnmønstrene for Reserpine og DMSO-fluer over tre på hinanden følgende dage, mens figur 5B-D og figur 5F-H viser resultaterne af differentialtesten på søvndataene. For at eliminere muligheden for, at lægemidlet udelukkende virker på et køn, blev eksperimenterne gentaget ved hjælp af mandlige fluer. Forskellige koncentrationer af Reserpin, 20 μM og 50 μM, blev administreret, hvilket viste en positiv korrelation mellem Reserpinkoncentration og fremme af søvn.

Figure 1
Figur 1: Lille molekylær lægemiddelscreening for aldersrelaterede søvnforstyrrelser eksperimentel proces. Ældre fluer blev anbragt i et lille glasrør med mad indeholdende de lægemidler, der skulle testes. Søvnmønstret blev løbende overvåget i tre dage ved hjælp af DAM-systemet. De erhvervede data blev importeret til en computer til behandling, visualisering og analyse, hvilket førte til konklusioner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Scanning og opdeling af data . (A) Dataudvælgelse og scanning efterfulgt af sekventiel tidsmæssig segmentering. (B) Placering af mappen "Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)". (C) Tilføjelse af undermappen "Vecsey SCAMP Scripts" til stien. (D) Placering af filen "scamp.m". Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Udvælgelse og behandling af søvndata . (A) Forhåndsvisning af flyvende soveforhold, fjernelse af markering af kanalen for døde fluer og gruppering og analyse af valgte data. (B) Forhåndsvisning af Drosophila-søvn, hvor et ensartet blåt rektangel indikerer aktiv søvn, mens et bestemt øjeblik med et ensartet blåt rektangel antyder, at fluen er død. Døde fluer er markeret med røde rektangler. (C) Analyse og output af udvalgte data. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Resultater af søvndataanalyse . (A) Valg af s30 - og stdur-filer fra CSV-filen. (B) Gennemsnitsværdien og standardfejlen for middelværdien (SEM) af søvn for hver gruppe i "s30.csv". (C) Værdier for dagtimerne (Bin1, Bin3, Bin5), nattetimerne (Bin2, Bin4, Bin6) og den samlede søvn for hver flue inden for tre dage i "stdur.csv". Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Søvnforhold hos ældre fluer behandlet med Reserpin. (A) Skematisk repræsentation af søvntid inden for 3 dage hos ældre hunner, der fik 0,2 % DMSO, 20 μM Reserpin og 50 μM Reserpin. (B-D) Kvantitativ analyse af den gennemsnitlige dagtimerne, natten og den samlede søvntid inden for 3 dage med eller uden medicin. Resultaterne viser en signifikant stigning i søvntid hos ældre kvinder fodret med Reserpine. N = 8 for hver gruppe, envejs ANOVA, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Skematisk repræsentation af søvntid inden for 3 dage hos ældre mænd fodret med 0,2% DMSO, 20 μM Reserpine og 50 μM Reserpin. (F-H) Kvantitativ analyse af den gennemsnitlige dagtimerne, natten og den samlede søvntid inden for 3 dage med eller uden medicin. Resultaterne tyder på, at søvntiden steg hos mænd fodret med Reserpine. n = 16 for hver gruppe, envejs ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Sammenligning af søvnvarighed mellem unge og gamle fluer. (A) Skematisk diagram, der illustrerer monitoreringen af søvnvarigheden over 3 dage hos unge og gamle mænd. (B-D) Kvantitativ analyse af den gennemsnitlige dagtimerne, natten og den samlede søvntid over 3 dage hos unge og gamle mænd afslørede ingen signifikant forskel. n = 32 for hver gruppe, uparret t-test, n.s., ikke signifikant. (E) Skematisk overvågning af søvnvarighed over 3 dage hos unge og gamle kvinder. (F-H) Kvantitativ analyse af den gennemsnitlige dagtimerne, natten og den samlede søvntid over 3 dage hos unge og gamle kvinder viste et signifikant fald i dagtimerne, natten og den samlede søvntid hos gamle kvinder sammenlignet med unge kvinder. n = 32 for hver gruppe, uparret t-test, ****p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Gruppe Studiegruppe Behandling Alder og køn af fluer Antal fluer
Equation 1 Normale kontroller 4 ml simpelt dyrkningsmedium med 0,2% DMSO i 4 dage 30 dage mænd/kvinder 16 fluer pr. Gruppe
Equation 2 Lavdosis lægemiddeltestEquation 6 4 ml simpelt dyrkningsmedium med 20 μM reserpin i 4 dage 30 dage kvinder 16 fluer pr. Gruppe
Equation 3 Højdosis lægemiddeltestEquation 6 4 ml simpelt dyrkningsmedium med 50 μM reserpin i 4 dage 30 dage kvinder 16 fluer pr. Gruppe
Equation 4 Lavdosis lægemiddeltestEquation 7 4 ml simpelt dyrkningsmedium med 20 μM reserpin i 4 dage 30 dage mænd 16 fluer pr. Gruppe
Equation 5 Højdosis lægemiddeltestEquation 7 4 ml simpelt dyrkningsmedium med 50 μM reserpin i 4 dage 30 dage mænd 16 fluer pr. Gruppe

Tabel 1: Eksperimentelt design for fluebehandlingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne metode er egnet til hurtig screening af små og mellemstore søvnmedicin. I øjeblikket er de fleste almindelige screeningsmetoder med høj kapacitet baseret på biokemiske og cellulære niveauer. For eksempel undersøges receptorens struktur og egenskaber for at søge efter specifikke ligander, der kan binde til det22. En anden tilgang indebærer analyse af bindingstilstanden og styrken af molekylære fragmenter af udvalgte lægemidler ved anvendelse af kernemagnetisk resonans (NMR) med massespektrometri35. Imidlertid har disse metoder ofte en relativt høj screeningsfejlrate, og de lægemidler, der vælges gennem dem, viser ofte ingen effekt i dyreforsøg eller kliniske forsøg. Effekten af lægemidler i kroppen påvirkes af forskellige faktorer, såsom lægemiddelabsorption, distribution, metabolisme og udskillelse, hvilket fører til en høj grad af falsk screening. I modsætning hertil, selvom vores foreslåede metode har en mindre screeningsskala sammenlignet med metoder med høj kapacitet, tilbyder den en mere ligetil og omkostningseffektiv tilgang ved direkte at observere lægemiddeleffekter på fænotyper. Dette demonstrerer potentialet ved at bruge Drosophila-modellen til effektiv lægemiddelscreening og identifikation af lægemiddelmål.

Drosophila besidder en bevaret søvnreguleringsmekanisme og udviser søvnforstyrrelser forbundet med aldring. Vi observerede, at søvnvarigheden for 30 dage gamle hunfluer var signifikant kortere end for 7 dage gamle fluer, mens søvnvarigheden for 30 dage gamle hanfluer ikke adskilte sig væsentligt fra søvnvarigheden for 7 dage gamle fluer (figur 6). Derfor blev 30 dage gamle hunfluer udvalgt til de aktuelle forsøg. Screeningsprocessen i flere runder blev udført for at minimere utilsigtet faktorinterferens. Lægemiddelkoncentrationen i første runde blev sat til 20 μM for at undgå toksiske bivirkninger, der kunne føre til fluedødelighed. I den anden screeningsrunde blev lægemiddelkoncentrationen øget til 50 μM for at vurdere lægemidlets virkninger ved forskellige koncentrationer. Lægemidler udvalgt fra anden runde blev administreret til hanfluer ved både 20 μM og 50 μM for at evaluere kønsforskelle i lægemiddeleffekter. Dette gjorde det muligt for en at screene for lægemidler, der konsekvent viste søvnrelaterede virkninger. For eksempel har Reserpine tidligere vist sig at øge søvnen hos voksne fluer i alderen 4-6 dage31 dage. Vi replikerede med succes dette resultat i vores model ved hjælp af ældre fluer, hvor ældre kvinder viste en signifikant stigning i søvn efter at have fået Reserpine (figur 5).

DMSO blev brugt til at opløse lægemidlerne, men dets potentielle toksicitet bør overvejes. Tidligere undersøgelser har vist, at koncentrationer på 0,1% til 0,25% DMSO i dyrkningsmediet ikke skader rottehårceller inden for 24 timer, mens koncentrationer på 0,5% til 6% signifikant øger celledød36. Tilsvarende har det vist sig, at DMSO-koncentrationer på 0,1% eller mindre ikke påvirker ekspressionen af vigtige lægemiddelmetabolismerelaterede enzymer eller transportører i humane hepatocytter. Alligevel kan højere koncentrationer fremkalde ændringer i ekspression37. Det skal dog bemærkes, at 0,1% DMSO har vist sig at påvirke levetiden for hunfluer, men ikke hanner38 år, væsentligt. Derudover har intraperitoneal administration af 15% og 20% DMSO vist sig at interferere med søvn hos rotter39. For at mindske DMSO's potentielle toksicitet holdt vi koncentrationen under 0,2 %.

I øjeblikket er der to hovedmetoder, der bruges til at karakterisere Drosophilas adfærd. En metode er baseret på videoanalyse, som giver et væld af adfærdsparametre, herunder flyveposition, hastighed og subtile bevægelser af kropsdele. Den anden metode er baseret på infrarød strålefraktur, såsom DAM-systemet. 40. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at visse videoanalyseværktøjer som PySolo er designet til at studere flere enkeltresidente fluer, hvilket begrænser antallet af fluer, der kan placeres under et kamera41. Andre værktøjer som C-trax42 og JAABA43 kan udføre befolkningssporing, men er beregningsmæssigt dyre og tidskrævende. Til screening med høj kapacitet er det normalt tilstrækkeligt at fange fluernes samlede søvnvarighed, og præcise bevægelsesparametre er ikke nødvendige. Derfor foretrækkes den udbredte og meget skalerbare metode baseret på infrarød strålefraktur. Denne metode har dog også sine begrænsninger. For eksempel, hvis fluer kun bevæger sig i den ene ende af røret uden at afbryde den infrarøde stråle, kan systemet fejlagtigt registrere det som søvn, hvilket fører til en overvurdering af søvn44. Derudover er det vigtigt omhyggeligt at teste fluestammens bevægelighed, før den bruges til screening for at undgå utilsigtede påvirkninger.

Her er nogle nyttige tip til en vellykket opsætning: (1) For at forhindre mad i at klæbe til glasrøret, når det fjernes fra det lille bægerglas efter størkning, kan man prøve at indsætte glasrøret lodret i bunden af det lille bægerglas, før maden størkner. Det kan være effektivt at trække forsigtigt glasrøret frem og tilbage, banke på bunden af bægerglasset for at lade luft trænge ind, langsomt dreje bægerglasset for at fjerne al maden og glasrøret og derefter forsigtigt tørre eventuel resterende mad af på glasrørets ydervæg. (2) Ved forsegling af glasrørets madende med paraffinfilm anbefales det at bruge et vandbad til langsomt at opvarme filmen, indtil paraffinen smelter. Denne fremgangsmåde hjælper med at undgå problemet med, at den medicinske mad sprøjter voldsomt ved høje temperaturer og forurener paraffinfilmen. Alternativt kan man bruge små plastikhætter til forsegling, men sørg for, at luft kan komme ind under forseglingen, hvilket får maden til at skubbe op generelt. (3) Det er værd at overveje, at nogle potente søvnfremmende lægemidler i første omgang kan føre til forkert vurdering af testede fluer som døde. For at overvinde dette problem anbefales det at indstille en koncentrationsgradient, der tillader udforskning af den optimale lægemiddelkoncentration og gentagelse af eksperimentet. (4) Tag højde for, at lugten af lægemidlet kan påvirke mængden af mad, der indtages af fluerne, og deres indtag af lægemidlet, hvilket potentielt kan påvirke nøjagtigheden af forsøgsresultaterne. Derfor kan det være gavnligt at forlænge forsøgets varighed hensigtsmæssigt, hvilket sikrer, at fluer har rigelig tid til at indtage så meget stof som muligt og øger lægemidlets akkumuleringseffekt. (5) Til databehandling, mens mange universiteter og institutter har adgang til Matlab til offentlig brug, er der billigere alternativer til rådighed for enkeltpersoner eller forskningsinstitutioner, der endnu ikke har købt programmet. En anbefalet mulighed er ShinyR-DAM v3.1 «Opdater»45.

Afslutningsvis har vi udviklet en trinvis procedure til screening af lægemidler til behandling af søvnforstyrrelser. Ved hjælp af en ældre fluemodel, der udviser en fænotype af kortere søvnvarighed, valideres effekten af Reserpine til at øge søvnvarigheden hos ældre hunfluer. Denne metode tilbyder en ny tilgang til lægemiddelscreening med betydeligt anvendelsespotentiale og tjener som grundlag for yderligere lægemiddelforskning. Mens lægemiddeleffekter vurderes ud fra fænotyper, forbliver den underliggende mekanisme for lægemiddelvirkning ukendt. Yderligere undersøgelser vil blive udført for at undersøge patologien for søvnforstyrrelser og den molekylære regulering af søvn og derved kaste lys over de involverede farmakologiske mekanismer. Selvom døgnrytmeapparatet i Drosophila har ligheder med menneskelige oscillatorer, bør forskelle i søvnkontrolmekanismer mellem mennesker og fluer ikke overses. Denne protokol giver en grundlæggende ramme for lægemiddelscreening for søvnforstyrrelser. Imidlertid vil fremtidig forskning afgøre, om nogen af de screenede lægemidler kan bruges til klinisk behandling, samt belyse deres virkningsmekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker professor Junhai Hans laboratoriemedlemmer for deres diskussion og kommentarer. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China 32170970 til Y.T og "Cyanine Blue Project" i Jiangsu-provinsen til Z.C.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer's disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep - a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

Høj kapacitet screening af lægemidler med små molekyler aldersrelaterede søvnforstyrrelser Drosophila melanogaster Søvnvarighed Fragmenterede mønstre Ældre Sygdomme Diabetes Hjerte-kar-sygdomme Psykiske lidelser Eksisterende lægemidler Bivirkninger Kognitiv svækkelse Afhængighed Sikrere medicin Effektiv søvnforstyrrelsesmedicin Omkostningseffektiv screeningsmetode Søvnreguleringsmekanisme Modelorganisme Infrarød overvågningsenhed Søvn og døgnrytmeanalyse MATLAB-program 2020 (SCAMP2020) billig screeningsprotokol
High-throughput Small Molecule Drug Screening for aldersrelaterede søvnforstyrrelser ved hjælp af <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han,… More

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter