Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

High-Throughput Small Molecule Drug Screening voor leeftijdsgebonden slaapstoornissen met behulp van Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

Gepresenteerd wordt een protocol voor high-throughput drug screening om de slaap te verbeteren door het slaapgedrag van fruitvliegjes te monitoren in een ouder Drosophila-model .

Abstract

Slaap, een essentieel onderdeel van de gezondheid en het algehele welzijn, vormt vaak een uitdaging voor oudere personen die vaak slaapstoornissen ervaren die worden gekenmerkt door een verkorte slaapduur en gefragmenteerde patronen. Deze slaapstoornissen correleren ook met een verhoogd risico op verschillende ziekten bij ouderen, waaronder diabetes, hart- en vaatziekten en psychische stoornissen. Helaas worden bestaande medicijnen voor slaapstoornissen in verband gebracht met aanzienlijke bijwerkingen zoals cognitieve stoornissen en verslaving. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe, veiligere en effectievere medicijnen tegen slaapstoornissen dringend nodig. De hoge kosten en de lange experimentele duur van de huidige methoden voor het screenen van geneesmiddelen blijven echter beperkende factoren.

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve en high-throughput screeningsmethode die gebruik maakt van Drosophila melanogaster, een soort met een sterk geconserveerd slaapregulatiemechanisme in vergelijking met zoogdieren, waardoor het een ideaal model is voor het bestuderen van slaapstoornissen bij ouderen. Door verschillende kleine verbindingen toe te dienen aan oude vliegen, kunnen we hun effecten op slaapstoornissen beoordelen. Het slaapgedrag van deze vliegen wordt geregistreerd met behulp van een infraroodbewakingsapparaat en geanalyseerd met het open-source datapakket Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Dit protocol biedt een goedkope, reproduceerbare en efficiënte screeningsaanpak voor slaapregulatie. Fruitvliegjes zijn vanwege hun korte levenscyclus, lage houderijkosten en gebruiksgemak uitstekende onderwerpen voor deze methode. Ter illustratie: Reserpine, een van de geteste medicijnen, toonde het vermogen aan om de slaapduur bij oudere vliegen te bevorderen, wat de effectiviteit van dit protocol benadrukte.

Introduction

Slaap, een van de essentiële gedragingen die nodig zijn voor het overleven van de mens, wordt gekenmerkt door twee hoofdtoestanden: REM-slaap (Rapid Eye Movement) en niet-Rapid Eye Movement (NREM)-slaap1. NREM-slaap bestaat uit drie fasen: N1 (de overgang tussen waken en slapen), N2 (lichte slaap) en N3 (diepe slaap, langzame golfslaap), die de progressie van waakzaamheid naar diepe slaap1 vertegenwoordigen. Slaap speelt een cruciale rol in zowel de lichamelijke als de geestelijke gezondheid2. Veroudering vermindert echter de totale slaapduur, de slaapefficiëntie, het slow-wave slaappercentage en het REM-slaappercentage bijvolwassenen3. Oudere mensen hebben de neiging om meer tijd in lichte slaap door te brengen in vergelijking met langzame slaap, waardoor ze gevoeliger zijn voor nachtelijk ontwaken. Naarmate het aantal ontwaken toeneemt, neemt de gemiddelde slaaptijd af, wat resulteert in een gefragmenteerd slaappatroon bij ouderen, wat in verband kan worden gebracht met overmatige excitatie van Hprt-neuronen bij muizen4. Bovendien dragen leeftijdsgerelateerde dalingen van circadiane mechanismen bij aan een eerdere verschuiving in slaapduur 5,6. In combinatie met lichamelijke ziekte, psychologische stress, omgevingsfactoren en medicijngebruik maken deze factoren oudere volwassenen vatbaarder voor slaapstoornissen, zoals slapeloosheid, REM-slaapgedragsstoornis, narcolepsie, periodieke beenbewegingen, rustelozebenensyndroom en slaapstoornissen in de ademhaling 7,8.

Epidemiologische studies hebben aangetoond dat slaapstoornissen nauw verband houden met chronische ziekten bij ouderen9, waaronder depressie10, hart- en vaatziekten11 en dementie12. Het aanpakken van slaapstoornissen speelt een cruciale rol bij het verbeteren en behandelen van chronische ziekten en het verbeteren van de kwaliteit van leven van oudere volwassenen. Momenteel vertrouwen patiënten voornamelijk op geneesmiddelen zoals benzodiazepinen, niet-benzodiazepinen en melatoninereceptoragonisten om de slaapkwaliteit teverbeteren13. Benzodiazepinen kunnen echter leiden tot neerwaartse regulatie van receptoren en afhankelijkheid na langdurig gebruik, waardoor ernstige ontwenningsverschijnselen ontstaan bij stopzetting14,15. Niet-benzodiazepinen brengen ook risico's met zich mee, waaronder dementie 16, fracturen17 en kanker18. De veelgebruikte melatoninereceptoragonist, ramelteon, vermindert de slaaplatentie, maar verlengt de slaapduur niet en heeft problemen met de leverfunctie als gevolg van uitgebreide first-pass-eliminatie19. Agomelatine, een melatoninereceptoragonist en serotoninereceptorantagonist, verbetert depressiegerelateerde slapeloosheid, maar vormt ook een risico op leverbeschadiging20. Daarom is er dringend behoefte aan veiligere medicijnen om slaapstoornissen te behandelen of te verlichten. De huidige strategieën voor het screenen van geneesmiddelen, gebaseerd op moleculaire en cellulaire experimenten in combinatie met geautomatiseerde systemen en computeranalyse, zijn echter duur en tijdrovend21. Op structuur gebaseerde strategieën voor het ontwerpen van geneesmiddelen, die gebaseerd zijn op de structuur en eigenschappen van receptoren, vereisen een duidelijk begrip van de driedimensionale structuur van receptoren en missen voorspellende mogelijkheden voor geneesmiddeleffecten22.

In 2000 stelden onderzoekers, op basis van de slaapcriteria voorgesteld door Campbell en Tobler in 1984 23, eenvoudige diermodellen op om slaap24 te bestuderen, waaronder Drosophila melanogaster, die slaapachtige toestanden vertoonde25,26. Ondanks anatomische verschillen tussen Drosophila en mensen, zijn veel neurochemische componenten en signaalroutes die de slaap bij Drosophila reguleren bewaard gebleven in de slaap van zoogdieren, wat de studie van neurologische aandoeningen bij de mens vergemakkelijkt27,28. Drosophila wordt ook op grote schaal gebruikt in circadiane ritmestudies, ondanks verschillen in kernoscillatoren tussen vliegen en zoogdieren 29,30,31. Daarom dient Drosophila als een waardevol modelorganisme voor het bestuderen van slaapgedrag en het uitvoeren van slaapgerelateerde drugsscreening.

Deze studie stelt een kosteneffectieve en eenvoudige op fenotype gebaseerde benadering voor voor het screenen van geneesmiddelen met kleine moleculen om slaapstoornissen te behandelen met behulp van verouderde vliegen. Slaapregulatie bij Drosophila is sterk geconserveerd25, en de afname van de slaap die met de leeftijd wordt waargenomen, kan omkeerbaar zijn door toediening van medicijnen. Deze op slaapfenotype gebaseerde screeningsmethode kan dus intuïtief de werkzaamheid van geneesmiddelen weerspiegelen. We voeden de vliegen met een mengsel van het onderzochte medicijn en voedsel, monitoren en registreren het slaapgedrag met behulp van de Drosophila Activity Monitor (DAM)32 en analyseren de verkregen gegevens met behulp van het open-source SCAMP2020 datapakket in MATLAB (Figuur 1). Statistische analyse wordt uitgevoerd met behulp van statistische en grafische software (zie Tabel met materialen). Als voorbeeld demonstreren we de effectiviteit van dit protocol door experimentele gegevens te presenteren over Reserpine, een remmer van kleine moleculen van de vesiculaire monoaminetransporter waarvan wordt gemeld dat deze de slaapverhoogt33. Dit protocol biedt een waardevolle benadering om geneesmiddelen te identificeren voor de behandeling van leeftijdsgebonden slaapproblemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol maakt gebruik van de 30 dagen oude w1118 vliegen van het Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, zie Tabel met materialen).

1. Bereiding van de gerijpte fruitvliegjes

  1. Voedselbereiding
    1. Bereid standaard maïszetmeelkweekmedium door 50 g/l cornflakes, 110 g/l suiker, 5 g/l agar en 25 g/l gist te mengen. Verwarm de cornflakes en gist met water om te gelatiniseren en los vervolgens alle stoffen volledig op.
    2. Wanneer het medium is afgekoeld tot 50-60 °C, voeg dan 6 ml/l propionzuur toe en verpak ze onmiddellijk in kweekflessen.
  2. Vliegenkweek en voorbereiding van oude vliegen
    1. Kweek de vliegenstam w1118in flessen met een standaard maizena-kweekmedium en plaats de flessen in een incubator met constante temperatuur bij 25° C, 68% relatieve vochtigheid, 500-1000 lux lichtomstandigheden en een 12 u:12 h licht: donker cyclus.
    2. Breng vliegen elke 7 dagen over in een nieuwe fles, afhankelijk van de groeicyclus van vliegen, waarbij de leeftijd van individuen in dezelfde fles consistent blijft.
    3. Verzamel de nieuwe partij vliegen die uit de originele fles komen 3 dagen na het overbrengen en doe ze in een nieuwe fles. Volgens het principe om de fles om de 7 dagen te vervangen, worden ze gekweekt tot ze ongeveer 30 dagen oud zijn.

2. Bereiding van medicinale voeding en glazen buisjes voor monitoring

OPMERKING: De procedure voor de voorbereiding van glazen buizen volgt het werk van Jin et al. met wijzigingen34.

  1. Reinigen en drogen van glazen buizen
    1. Plaats de glazen buis (5 mm diameter x 65 mm lang, zie Materiaaltabel) in een grote beker, week hem en kook hem 20 minuten met dubbel gedestilleerd water. Herhaal 3 keer.
    2. Verwijder en bundel de glazen buis, spoel de binnenkant 3-5 keer af met dubbel gedestilleerd water en plaats deze in een oven om te drogen.
  2. Bereiding van eenvoudig kweekmedium (100 ml)
    1. Los 1,5 g agar en 5 g sucrose op in dubbel gedestilleerd water, verwarm en concentreer tot 100 ml.
    2. Voeg 600 μL propionzuur toe wanneer het medium is afgekoeld tot ongeveer 70 °C, zodat het niet kan stollen met behulp van een waterbad met constante temperatuur.
    3. Voeg ongeveer 4 ml enkelvoudig medium en reserpine (zie materiaaltabel) toe aan een bekerglas van 10 ml tot het geneesmiddel 20 μM of 50 μM bereikt. Voeg dimethylsulfoxide (DMSO) toe tot de concentratie van 0,2% in de negatieve controlegroep.
  3. Bereiding van de glazen buisjes met medicijnen
    1. Om de doorstroming van het medium te vergemakkelijken, steekt u voorzichtig een geschikte lengte glazen buis in een kleine beker. Het medium komt op natuurlijke wijze door atmosferische druk in de glazen buis.
    2. Trek de glazen buis eruit wanneer het kweekmedium volledig is gestold en veeg de buitenwand schoon om een glazen bewakingsbuis te verkrijgen met aan één uiteinde een kweekmedium dat medicijnen bevat.
    3. Verwarm de vaste paraffine in een bekerglas tot het smelt bij 70 °C, steek het uiteinde van de glazen buis dicht bij het voedsel ongeveer 5 mm in de paraffinevloeistof en verwijder het snel. Wacht tot de paraffine is gestold om het voedseluiteinde van de glazen buis af te sluiten.

3. Experimenteel ontwerp en vliegenbehandeling

  1. Ontwerp het experiment voor de vliegenbehandeling volgens tabel 1.

4. Drosophila-assemblage en slaapbewaking

OPMERKING: De procedure voor de assemblage van Drosophila volgt het werk van Jin et al.34 met wijzigingen.

  1. Verdoof vliegen met CO2 -gas, doe ze in met paraffine verzegelde glazen buizen (één per buis) en blokkeer het non-fooduiteinde met een absorberend watje om te voorkomen dat vliegen ontsnappen en om luchtcirculatie te garanderen.
  2. Laad buizen op de infraroodmonitor om ze te bewaken.
    1. Monteer de glazen buisjes met vliegen op een infraroodmonitor in dezelfde richting en noteer het monitornummer en het gatnummer dat overeenkomt met elk medicijn.
    2. Pas de uitlijning van elke buis aan en laat de infraroodstralen verticaal door het midden van het activiteitsbereik van de vlieg gaan.
    3. Plaats de monitor in een incubator van 25 °C in de donkere kamer van de vliegslaap, volgens de gespecificeerde instellingen: temperatuur van 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (gelijk aan lokale tijd 08:00 uur) en ZT24 (gelijk aan lokale tijd 08:00 uur). Deze opstelling zorgt ervoor dat de vliegen afwisselend periodes van 12 uur licht en duisternis ervaren.
      NOTITIE: Probeer de deur niet te openen voordat het verzamelen van de bewakingsgegevens is voltooid om tijdens de bewaking een stabiele omgeving in de couveuse te behouden.
    4. Start de bewaking met behulp van het DAM2-systeem (zie Materiaaltabel).
    5. Zodra de monitoring is voltooid, downloadt u de verzamelde gegevens in .txt formaat van het systeem.

5. Gegevensverwerking

OPMERKING: De gegevensverwerking met behulp van het DAM-systeem, DAMFileScan107 en SCAMP werd uitgevoerd volgens de instructies op hun officiële websites (zie Materiaaltabel).

  1. Importeer het bovenstaande txt-bestand in de DAMFileScan107-software om te scannen en verdeel het naar behoefte om slaapgegevens te verkrijgen.
    1. Stel de starttijd van segmentatiegegevens in op 8:01 (segmentatie van 1 minuut) of 8:00 uur (segmentatie van 30 minuten) op de derde ochtend na het starten van de monitoren, en de eindtijd is drie dagen na de starttijd om 8:00 uur (Figuur 2A1).
      OPMERKING: Vliegen moeten zich minimaal één dag aanpassen aan de bewakingsomgeving. Men kan dus de starttijd van de gesplitste gegevens instellen op 8 uur op de derde dag nadat de monitor is begonnen.
    2. Splits de gegevens met tussenpozen van 1 minuut en 30 minuten. Wijzig de optie "Binlengte" in 1 minuut, wijzig de optie "Uitvoerbestandstype" in Kanaalbestanden, hernoem en uitvoer. De 30 min datasegmentatiemethode is dezelfde als hierboven (Figuur 2A2-5).
      OPMERKING: Bij het uitvoeren van gegevenssegmentatie met intervallen van 1 minuut en 30 minuten, moet de uiteindelijke hernoeming van de twee bestanden consistent zijn; anders kan het onleesbaar zijn tijdens de daaropvolgende Matlab-verwerking. Indien nodig kan de bestandsnaam na uitvoer worden gewijzigd om differentiatie te vergemakkelijken.
  2. Gegevensverwerking met behulp van SCAMP2020
    1. Open het programmapakket SCAMP2020 in Matlab en dubbelklik op Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figuur 2B).
    2. Voeg de submap "Vecsey SCAMP Scripts" toe aan het pad, zoek het bestand "scamp.m" in die map en voer het uit. Selecteer in het volgende pop-upvenster de mappen proces 1 min en 30 min achtereenvolgens (Figuur 2C,D).
    3. Selecteer een monitor, klik op Laad individuele See Plots om een voorbeeld te bekijken (Figuur 3A1) en controleer de afbeelding die verschijnt. Schakel het overeenkomstige kanaal van dode vliegen uit (Figuur 3A2, Figuur 3B).
    4. Herhaal de bovenstaande stappen om alle monitoren te controleren.
    5. Hernoem elk kanaal in elke monitor op basis van het corresponderende medicijn dat moet worden getest (Figuur 3A3), selecteer alle monitoren en klik op ANALYZE Selected Data voor analyse (Figuur 3A4).
    6. Ga standaard naar de geselecteerde optie, klik op Analyseren voor gekozen prullenbak, vink Gegevens exporteren aan en klik ten slotte op GRAFIEK 30 min gegevenstypen voor alle dagen voor geselecteerde groepen en EXPORTEER alle gegevens om de resultaten uit te voeren (Figuur 3C).
  3. Selecteer het bestand met de naam s30 in het CSV-bestand, zoek de bijbehorende gemiddelde waarde en standaardfoutgegevens voor elke monitor, maak een back-up naar Excel voor wijziging en aanpassing en plak het in GraphPad Prism (zie Materiaaltabel) om een slaapstatusdiagram te tekenen (Figuur 4A,B).
  4. Zoek het bestand met de naam "stdur" en bereken de gemiddelde waarden van dag, nacht en totale slaap voor elke vlieg binnen drie dagen (Figuur 4A,C). Plak de gegevens in de Prism-software om de verschiltest te voltooien en een grafiek te tekenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reserpine is een remmer van kleine moleculen van de vesiculaire monoaminetransporter (VMAT), die de heropname van monoaminen in presynaptische blaasjes remt, wat leidt tot een verhoogdeslaap33. De slaapbevorderende effecten van Reserpine werden onderzocht bij vliegen van 30 dagen oud, waarbij de controlegroep uitsluitend werd gevoed met het oplosmiddel dimethylsulfoxide (DMSO). In de Reserpine-groep vertoonden oudere vliegen zowel overdag als 's nachts een significant verhoogde slaap in vergelijking met de DMSO-groep. Figuur 5A,E illustreert het slaappatroon van de Reserpine- en DMSO-vliegen gedurende drie opeenvolgende dagen, terwijl Figuur 5B-D en Figuur 5F-H de resultaten van de differentiële test op de slaapgegevens tonen. Om de mogelijkheid uit te sluiten dat het medicijn uitsluitend op één geslacht inwerkt, werden de experimenten herhaald met mannelijke vliegen. Er werden verschillende concentraties Reserpine, 20 μM en 50 μM, toegediend, wat een positieve correlatie aantoont tussen de Reserpine-concentratie en de bevordering van de slaap.

Figure 1
Figuur 1: Experimenteel proces voor screening van kleine moleculaire geneesmiddelen voor leeftijdsgebonden slaapstoornissen. Oudere vliegen werden in een kleine glazen buis geplaatst met voedsel dat de te testen medicijnen bevatte. Slaappatronen werden gedurende drie dagen continu gemonitord met behulp van het DAM-systeem. De verkregen gegevens werden geïmporteerd in een computer voor verwerking, visualisatie en analyse, wat leidde tot conclusies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Scannen en verdelen van gegevens. (A) Selectie en scannen van gegevens, gevolgd door sequentiële temporele segmentatie. (B) Locatie van de map "Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)". (C) Toevoeging van de submap "Vecsey SCAMP Scripts" aan het pad. (D) Locatie van het bestand "scamp.m". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Selectie en verwerking van slaapgegevens . (A) Voorbeeld van de slaapomstandigheden van vliegen, het uitvinken van het kanaal voor dode vliegen en het groeperen en analyseren van geselecteerde gegevens. (B) Voorbeeld van de slaap van Drosophila, waarbij een uniforme blauwe rechthoek een actieve slaap aangeeft, terwijl een bepaald moment van een uniforme blauwe rechthoek suggereert dat de vlieg dood is. Dode vliegen zijn gemarkeerd met rode rechthoeken. (C) Analyse en output van geselecteerde gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Resultaten van de analyse van slaapgegevens . (A) Selectie van de s30 - en stdur-bestanden uit het CSV-bestand. (B) De gemiddelde waarde en standaardfout van het gemiddelde (SEM) van de slaap voor elke groep in "s30.csv". (C) Waarden van dag (Bin1, Bin3, Bin5), nacht (Bin2, Bin4, Bin6) en totale slaap voor elke vlieg binnen drie dagen in "stdur.csv". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Slaapomstandigheden van oude vliegen die met Reserpine zijn behandeld. (A) Schematische weergave van de slaaptijd binnen 3 dagen bij oudere vrouwtjes die 0,2% DMSO, 20 μM Reserpine en 50 μM Reserpine kregen. (B-D) Kwantitatieve analyse van de gemiddelde dag-, nacht- en totale slaaptijd binnen 3 dagen met of zonder medicijnen. De resultaten tonen een significante toename van de slaaptijd aan bij oudere vrouwen die Reserpine kregen. N = 8 voor elke groep, Enkele reis ANOVA, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Schematische weergave van de slaaptijd binnen 3 dagen bij oudere mannen die 0,2% DMSO, 20 μM Reserpine en 50 μM Reserpine kregen. (F-H) Kwantitatieve analyse van de gemiddelde dag-, nacht- en totale slaaptijd binnen 3 dagen met of zonder medicijnen. De resultaten geven aan dat de slaaptijd toenam bij mannen die Reserpine kregen. n = 16 voor elke groep, Enkele reis ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Vergelijking van de slaapduur tussen jonge en oude vliegen. (A) Schematisch diagram ter illustratie van de monitoring van de slaapduur gedurende 3 dagen bij jonge en oude mannetjes. (B-D) Kwantitatieve analyse van de gemiddelde dag-, nacht- en totale slaaptijd gedurende 3 dagen bij jonge en oude mannen onthulde geen significant verschil. n = 32 voor elke groep, ongepaarde t-toets, n.s., niet significant. (E) Schematische monitoring van de slaapduur gedurende 3 dagen bij jonge en oude vrouwtjes. (F-H) Kwantitatieve analyse van de gemiddelde dag-, nacht- en totale slaaptijd gedurende 3 dagen bij jonge en oude vrouwen toonde een significante afname van de dag-, nacht- en totale slaaptijd bij oude vrouwtjes in vergelijking met jonge vrouwtjes. n = 32 voor elke groep, ongepaarde t-toets, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Groep Studiegroep Behandeling Leeftijd en geslacht van vliegen Aantal vliegen
Equation 1 Normale bediening 4 ml eenvoudig kweekmedium met 0,2% DMSO gedurende 4 dagen 30 dagen reuen/teefjes 16 vliegen per groep
Equation 2 Drugstest met lage dosisEquation 6 4 ml eenvoudig kweekmedium met 20 μM reserpine gedurende 4 dagen 30 dagen teefjes 16 vliegen per groep
Equation 3 Drugstest met hoge dosisEquation 6 4 ml eenvoudig kweekmedium met 50 μM reserpine gedurende 4 dagen 30 dagen teefjes 16 vliegen per groep
Equation 4 Drugstest met lage dosisEquation 7 4 ml eenvoudig kweekmedium met 20 μM reserpine gedurende 4 dagen 30 dagen reuen 16 vliegen per groep
Equation 5 Drugstest met hoge dosisEquation 7 4 ml eenvoudig kweekmedium met 50 μM reserpine gedurende 4 dagen 30 dagen reuen 16 vliegen per groep

Tabel 1: Experimenteel ontwerp voor de behandeling van vliegen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beschreven methode is geschikt voor het snel screenen van kleine en middelgrote slaapmiddelen. Momenteel zijn de meeste gangbare high-throughput methoden voor het screenen van geneesmiddelen gebaseerd op biochemisch en cellulair niveau. Zo wordt bijvoorbeeld gekeken naar de structuur en eigenschappen van de receptor om te zoeken naar specifieke liganden die zich eraan kunnen binden22. Een andere benadering omvat het analyseren van de bindingswijze en sterkte van moleculaire fragmenten van geselecteerde geneesmiddelen met behulp van nucleaire magnetische resonantie (NMR) met massaspectrometrie35. Deze methoden hebben echter vaak een relatief hoog screeningsfoutenpercentage en de medicijnen die via hen worden geselecteerd, vertonen vaak geen effect in dier- of klinische experimenten. De werkzaamheid van geneesmiddelen in het lichaam wordt beïnvloed door verschillende factoren, zoals de absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding van geneesmiddelen, wat leidt tot een hoog percentage valse screening. Hoewel onze voorgestelde methode daarentegen een kleinere screeningsschaal heeft in vergelijking met high-throughput-methoden, biedt het een eenvoudigere en kosteneffectievere aanpak door de effecten van geneesmiddelen op fenotypes direct te observeren. Dit toont het potentieel aan van het gebruik van het Drosophila-model voor effectieve screening van geneesmiddelen en identificatie van doelwitten voor geneesmiddelen.

Drosophila bezit een geconserveerd slaapregulatiemechanisme en vertoont slaapstoornissen die verband houden met veroudering. We zagen dat de slaapduur van vrouwelijke vliegen van 30 dagen oud significant korter was dan die van vliegen van 7 dagen oud, terwijl de slaapduur van mannelijke vliegen van 30 dagen oud niet significant verschilde van die van vliegen van 7 dagen oud (figuur 6). Daarom werden vrouwtjesvliegen van 30 dagen oud geselecteerd voor de huidige experimenten. Het screeningproces in meerdere rondes werd uitgevoerd om toevallige factorinterferentie tot een minimum te beperken. De geneesmiddelconcentratie in de eerste ronde werd vastgesteld op 20 μM om toxische bijwerkingen te voorkomen die tot vliegensterfte zouden kunnen leiden. In de tweede screeningsronde werd de concentratie van het geneesmiddel verhoogd tot 50 μM om de effecten van het geneesmiddel bij verschillende concentraties te beoordelen. Geneesmiddelen die uit de tweede ronde werden geselecteerd, werden toegediend aan mannelijke vliegen bij zowel 20 μM als 50 μM om sekseverschillen in geneesmiddeleffecten te evalueren. Hierdoor kon men screenen op medicijnen die consequent slaapgerelateerde effecten aantoonden. Van Reserpine is bijvoorbeeld eerder aangetoond dat het de slaap verhoogt bij volwassen vliegen van 4-6 dagen31 jaar. We hebben dit resultaat met succes gerepliceerd in ons model met oudere vliegen, waarbij oudere vrouwtjes een significante toename van de slaap vertoonden na toediening van Reserpine (Figuur 5).

DMSO werd gebruikt om de medicijnen op te lossen, maar er moet rekening worden gehouden met de mogelijke toxiciteit ervan. Eerdere studies hebben aangetoond dat concentraties van 0,1% tot 0,25% DMSO in het kweekmedium de haarcellen van ratten niet binnen 24 uur beschadigen, terwijl concentraties van 0,5% tot 6% de celdood aanzienlijkverhogen36. Evenzo is gebleken dat DMSO-concentraties van 0,1% of minder geen invloed hebben op de expressie van belangrijke enzymen of transporters die verband houden met het metabolisme van geneesmiddelen in menselijke hepatocyten. Toch kunnen hogere concentraties veranderingen in expressie veroorzaken37. Er moet echter worden opgemerkt dat 0,1% DMSO de levensduur van vrouwelijke vliegen aanzienlijk beïnvloedt, maar niet die van mannetjes38. Bovendien is aangetoond dat intraperitoneale toediening van 15% en 20% DMSO de slaap bij rattenverstoort39. Om de potentiële toxiciteit van DMSO te beperken, hebben we de concentratie onder de 0,2% gehouden.

Momenteel zijn er twee hoofdmethoden die worden gebruikt om het gedrag van Drosophila te karakteriseren. Eén methode is gebaseerd op video-analyse, die een schat aan gedragsparameters biedt, waaronder vliegpositie, snelheid en subtiele bewegingen van lichaamsdelen. De andere methode is gebaseerd op infraroodbundelbreuk, zoals het DAM-systeem. 40. Het is echter belangrijk op te merken dat bepaalde videoanalyse-instrumenten, zoals PySolo, zijn ontworpen voor het bestuderen van meerdere enkelvoudige vliegen, waardoor het aantal vliegen dat onder een camera kan worden geplaatst41 wordt beperkt. Andere tools zoals C-trax42 en JAABA43 kunnen populatietracking uitvoeren, maar zijn rekenkundig duur en tijdrovend. Voor high-throughput screening is het vastleggen van de totale slaapduur van vliegen meestal voldoende en zijn nauwkeurige bewegingsparameters niet nodig. Daarom wordt de voorkeur gegeven aan de veelgebruikte en zeer schaalbare methode op basis van infraroodstraalbreuk. Deze methode heeft echter ook zijn beperkingen. Als vliegen bijvoorbeeld slechts aan één uiteinde van de buis bewegen zonder de infraroodstraal te onderbreken, kan het systeem dit ten onrechte als slaap registreren, wat leidt tot een overschatting van slaap44. Bovendien is het belangrijk om de beweeglijkheid van de vliegenstam zorgvuldig te testen voordat deze bij het screenen wordt gebruikt om onbedoelde invloeden te voorkomen.

Hier zijn enkele handige tips voor een succesvolle installatie: (1) Om te voorkomen dat voedsel aan het glazen buisje blijft plakken wanneer het na het stollen uit het bekertje wordt gehaald, kan men proberen het glazen buisje verticaal in de bodem van het bekerglas te steken voordat het voedsel stolt. Het kan effectief zijn om de glazen buis voorzichtig heen en weer te trekken, op de onderkant van het bekerglas te tikken om lucht binnen te laten, het bekerglas langzaam te draaien om al het voedsel en de glazen buis te verwijderen en vervolgens voorzichtig het resterende voedsel aan de buitenwand van de glazen buis weg te vegen. (2) Bij het afsluiten van het voedseluiteinde van de glazen buis met paraffinefolie, wordt aanbevolen om een waterbad te gebruiken om de film langzaam te verwarmen totdat de paraffine smelt. Deze aanpak helpt het probleem te voorkomen dat het medicinale voedsel bij hoge temperaturen hevig spat en de paraffinefilm besmet. Als alternatief kan men kleine plastic doppen gebruiken om te sealen, maar zorg ervoor dat er tijdens het sealen lucht kan binnendringen, waardoor het voedsel in zijn geheel omhoog duwt. (3) Het is de moeite waard om te overwegen dat sommige krachtige slaapbevorderende medicijnen in eerste instantie kunnen leiden tot het onjuiste oordeel dat geteste vliegen dood zijn. Om dit probleem op te lossen, wordt aanbevolen om een concentratiegradiënt in te stellen, zodat de optimale geneesmiddelconcentratie kan worden onderzocht en het experiment kan worden herhaald. (4) Houd er rekening mee dat de geur van het medicijn van invloed kan zijn op de hoeveelheid voedsel die door de vliegen wordt geconsumeerd en hun inname van het medicijn, wat mogelijk de nauwkeurigheid van de experimentele resultaten kan beïnvloeden. Daarom kan het nuttig zijn om de duur van het experiment op de juiste manier te verlengen, ervoor te zorgen dat vliegen voldoende tijd hebben om zoveel mogelijk medicijn te consumeren en het accumulatie-effect van het medicijn te versterken. (5) Voor gegevensverwerking, hoewel veel universiteiten en instituten toegang hebben tot Matlab voor openbaar gebruik, zijn er goedkopere alternatieven beschikbaar voor individuen of onderzoeksinstellingen die het programma nog niet hebben gekocht. Een aanbevolen optie is ShinyR-DAM v3.1 «Refresh»45.

Tot slot hebben we een stapsgewijze procedure ontwikkeld voor het screenen van medicijnen om slaapstoornissen te behandelen. Met behulp van een ouder vliegmodel dat een fenotype van kortere slaapduur vertoont, wordt de werkzaamheid van Reserpine bij het verlengen van de slaapduur bij oudere vrouwtjesvliegen gevalideerd. Deze methode biedt een nieuwe benadering van het screenen van geneesmiddelen met een aanzienlijk toepassingspotentieel en dient als basis voor verder geneesmiddelenonderzoek. Hoewel de effecten van geneesmiddelen worden beoordeeld op basis van fenotypes, blijft het onderliggende werkingsmechanisme van het geneesmiddel onbekend. Verdere studies zullen worden uitgevoerd om de pathologie van slaapstoornissen en de moleculaire regulatie van slaap te onderzoeken, waardoor licht wordt geworpen op de farmacologische mechanismen die hierbij betrokken zijn. Hoewel de circadiane machinerie in Drosophila overeenkomsten vertoont met menselijke oscillatoren, mogen verschillen in slaapcontrolemechanismen tussen mensen en vliegen niet over het hoofd worden gezien. Dit protocol biedt een basiskader voor het screenen van geneesmiddelen op slaapstoornissen. Toekomstig onderzoek zal echter bepalen of een van de gescreende geneesmiddelen kan worden gebruikt voor klinische behandeling, en hun werkingsmechanismen ophelderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Acknowledgments

We danken de lableden van Prof. Junhai Han voor hun discussie en commentaar. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 32170970 aan Y.T en het "Cyanine Blue Project" van de provincie Jiangsu aan Z.C.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer's disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep - a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

High-throughput Screening van geneesmiddelen met kleine moleculen Leeftijdsgebonden slaapstoornissen Drosophila melanogaster Slaapduur Gefragmenteerde patronen Ouderen Ziekten Diabetes Hart- en vaatziekten Psychische stoornissen Bestaande medicijnen Bijwerkingen Cognitieve stoornissen Verslaving Veiligere medicijnen Effectieve medicijnen voor slaapstoornissen Kosteneffectieve screeningsmethode Slaapregulatiemechanisme Modelorganisme Infraroodbewakingsapparaat Slaap- en circadiane analyse MATLAB-programma 2020 (SCAMP2020) Low-cost Screening Protocol
High-Throughput Small Molecule Drug Screening voor leeftijdsgebonden slaapstoornissen met behulp van <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han,… More

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter