Summary
Présentation d’un protocole de criblage de médicaments à haut débit pour améliorer le sommeil en surveillant le comportement de sommeil des mouches des fruits dans un modèle de drosophile âgée.
Abstract
Le sommeil, une composante essentielle de la santé et du bien-être général, présente souvent des défis pour les personnes âgées qui souffrent fréquemment de troubles du sommeil caractérisés par une durée de sommeil raccourcie et des schémas fragmentés. Ces perturbations du sommeil sont également corrélées à un risque accru de diverses maladies chez les personnes âgées, notamment le diabète, les maladies cardiovasculaires et les troubles psychologiques. Malheureusement, les médicaments existants pour les troubles du sommeil sont associés à des effets secondaires importants tels que des troubles cognitifs et une dépendance. Par conséquent, il est urgent de mettre au point de nouveaux médicaments plus sûrs et plus efficaces contre les troubles du sommeil. Cependant, le coût élevé et la longue durée expérimentale des méthodes actuelles de dépistage des drogues restent des facteurs limitatifs.
Ce protocole décrit une méthode de criblage rentable et à haut débit qui utilise Drosophila melanogaster, une espèce dont le mécanisme de régulation du sommeil est très conservé par rapport aux mammifères, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les troubles du sommeil chez les personnes âgées. En administrant divers petits composés à des mouches âgées, nous pouvons évaluer leurs effets sur les troubles du sommeil. Les comportements de sommeil de ces mouches sont enregistrés à l’aide d’un dispositif de surveillance infrarouge et analysés à l’aide du package de données open source Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Ce protocole offre une approche de dépistage peu coûteuse, reproductible et efficace pour la régulation du sommeil. Les mouches des fruits, en raison de leur cycle de vie court, de leur faible coût d’élevage et de leur facilité de manipulation, constituent d’excellents sujets pour cette méthode. À titre d’illustration, la réserpine, l’un des médicaments testés, a démontré sa capacité à favoriser la durée du sommeil chez les mouches âgées, soulignant l’efficacité de ce protocole.
Introduction
Le sommeil, l’un des comportements essentiels à la survie humaine, est caractérisé par deux états principaux : le sommeil paradoxal (REM) et le sommeil non rapide (NREM)1. Le sommeil NREM comprend trois stades : N1 (la transition entre l’éveil et le sommeil), N2 (sommeil léger) et N3 (sommeil profond, sommeil à ondes lentes), représentant la progression de l’éveil au sommeil profond1. Le sommeil joue un rôle crucial dans la santé physique et mentale2. Cependant, le vieillissement réduit la durée totale du sommeil, l’efficacité du sommeil, le pourcentage de sommeil à ondes lentes et le pourcentage de sommeil paradoxal chez les adultes3. Les personnes âgées ont tendance à passer plus de temps en sommeil léger qu’en sommeil à ondes lentes, ce qui les rend plus sensibles aux réveils nocturnes. Au fur et à mesure que le nombre de réveils augmente, le temps de sommeil moyen diminue, ce qui entraîne un rythme de sommeil fragmenté chez les personnes âgées, ce qui peut être associé à une excitation excessive des neurones Hcrt chez la souris4. De plus, les déclins des mécanismes circadiens liés à l’âge contribuent à un décalage plus précoce de la durée du sommeil 5,6. En combinaison avec la maladie physique, le stress psychologique, les facteurs environnementaux et l’utilisation de médicaments, ces facteurs rendent les personnes âgées plus sensibles aux troubles du sommeil, tels que l’insomnie, le trouble du comportement en sommeil paradoxal, la narcolepsie, les mouvements périodiques des jambes, le syndrome des jambes sans repos et les troubles respiratoires du sommeil 7,8.
Des études épidémiologiques ont montré que les troubles du sommeil sont étroitement liés aux maladies chroniques chez les personnes âgées9, notamment la dépression 10, les maladies cardiovasculaires11 et la démence12. La prise en charge des troubles du sommeil joue un rôle crucial dans l’amélioration et le traitement des maladies chroniques et l’amélioration de la qualité de vie des personnes âgées. À l’heure actuelle, les patients s’appuient principalement sur des médicaments tels que les benzodiazépines, les non-benzodiazépines et les agonistes des récepteurs de la mélatonine pour améliorer la qualité du sommeil13. Cependant, les benzodiazépines peuvent entraîner une régulation négative des récepteurs et une dépendance après une utilisation à long terme, provoquant de graves symptômes de sevrage lors de l’arrêtdu traitement. Les médicaments autres que les benzodiazépines comportent également des risques, notamment la démence16, les fractures 17 et le cancer18. L’agoniste des récepteurs de la mélatonine couramment utilisé, le ramelteon, réduit la latence du sommeil mais n’augmente pas la durée du sommeil et présente des problèmes liés à la fonction hépatique en raison de l’élimination importante du premier passage19. L’agomélatine, un agoniste des récepteurs de la mélatonine et un antagoniste des récepteurs de la sérotonine, améliore l’insomnie liée à la dépression, mais présente également un risque de lésions hépatiques20. Par conséquent, il y a un besoin urgent de médicaments plus sûrs pour traiter ou soulager les troubles du sommeil. Cependant, les stratégies actuelles de criblage des drogues, basées sur des expériences moléculaires et cellulaires combinées à des systèmes automatisés et à des analyses informatiques, sont coûteuses et prennent beaucoup de temps21. Les stratégies de conception de médicaments basées sur la structure, qui s’appuient sur la structure et les propriétés des récepteurs, nécessitent une compréhension claire de la structure tridimensionnelle des récepteurs et manquent de capacités prédictives pour les effets des médicaments22.
En 2000, sur la base des critères de sommeil proposés par Campbell et Tobler en 198423, les chercheurs ont établi des modèles animaux simples pour étudier le sommeil 24, y compris Drosophila melanogaster, qui présentait des états de sommeil25,26. Malgré les différences anatomiques entre la drosophile et l’homme, de nombreux composants neurochimiques et voies de signalisation régulant le sommeil chez la drosophile sont conservés dans le sommeil des mammifères, ce qui facilite l’étude des maladies neurologiques humaines27,28. La drosophile est également largement utilisée dans les études sur le rythme circadien, malgré les différences d’oscillateurs de base entre les mouches et les mammifères 29,30,31. Par conséquent, la drosophile sert d’organisme modèle précieux pour l’étude du comportement du sommeil et le dépistage des drogues liées au sommeil.
Cette étude propose une approche rentable et simple basée sur le phénotype pour le criblage de médicaments à petites molécules pour traiter les troubles du sommeil à l’aide de mouches âgées. La régulation du sommeil chez la drosophile est très conservée25, et le déclin du sommeil observé avec l’âge peut être réversible par l’administration de médicaments. Ainsi, cette méthode de dépistage basée sur le phénotype du sommeil peut intuitivement refléter l’efficacité du médicament. Nous nourrissons les mouches avec un mélange du médicament à l’étude et de la nourriture, surveillons et enregistrons le comportement de sommeil à l’aide du moniteur d’activité de la drosophile (DAM)32 et analysons les données acquises à l’aide du package de données SCAMP2020 open source de MATLAB (Figure 1). L’analyse statistique est effectuée à l’aide d’un logiciel de statistiques et de graphiques (voir le tableau des matériaux). À titre d’exemple, nous démontrons l’efficacité de ce protocole en présentant des données expérimentales sur la réserpine, une petite molécule inhibitrice du transporteur vésiculaire de la monoamine qui augmenterait le sommeil33. Ce protocole fournit une approche précieuse pour identifier les médicaments pour traiter les problèmes de sommeil liés à l’âge.
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Protocol
Ce protocole utilise les mouches w1118 âgées de 30 jours du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, voir le tableau des matériaux).
1. Préparation des mouches des fruits âgées
- Préparation des aliments
- Préparez le milieu de culture standard de l’amidon de maïs en mélangeant 50 g/L de flocons de maïs, 110 g/L de sucre, 5 g/L de gélose et 25 g/L de levure. Faites chauffer les cornflakes et la levure avec de l’eau pour gélatiniser, puis dissolvez complètement toutes les substances.
- Lorsque le milieu refroidit à 50-60 °C, ajoutez 6 mL/L d’acide propionique et emballez-les rapidement dans des flacons de culture.
- Élevage de mouches et préparation de mouches âgées
- Élevez la souche de mouche w1118dans des bouteilles contenant un milieu de culture standard d’amidon de maïs et placez les bouteilles dans un incubateur à température constante à 25 ° C, 68 % d’humidité relative, des conditions d’éclairage de 500 à 1000 lux et un cycle lumière : obscurité de 12 h : 12 h.
- Transférez les mouches dans une nouvelle bouteille tous les 7 jours en fonction du cycle de croissance des mouches, en gardant l’âge des individus dans la même bouteille constant.
- Récupérez le nouveau lot de mouches qui éclosent de la bouteille d’origine 3 jours après leur transfert et mettez-les dans une nouvelle bouteille. Suivant le principe de changer le biberon tous les 7 jours, ils seront cultivés jusqu’à l’âge de 30 jours environ.
2. Préparation d’aliments médicinaux et de tubes en verre pour la surveillance
NOTE : La procédure de préparation des tubes de verre suit les travaux de Jin et al. avec les modifications34.
- Nettoyage et séchage de tubes en verre
- Placez le tube de verre (5 mm de diamètre x 65 mm de longueur, voir tableau des matériaux) dans un grand bécher, faites-le tremper et faites-le bouillir avec de l’eau distillée pendant 20 min. Répétez 3 fois.
- Retirez et regroupez le tube en verre, rincez l’intérieur avec de l’eau distillée double 3 à 5 fois et placez-le dans un four pour le séchage.
- Préparation d’un milieu de culture simple (100 mL)
- Dissoudre 1,5 g d’agar-agar et 5 g de saccharose dans de l’eau distillée double, chauffer et concentrer jusqu’à 100 ml.
- Ajouter 600 μL d’acide propionique lorsque le milieu refroidit à environ 70 °C, ce qui l’empêche de se solidifier à l’aide d’un bain-marie à température constante.
- Ajouter environ 4 mL de milieu simple et de réserpine (voir le tableau des matériaux) dans un petit bécher de 10 mL jusqu’à ce que le médicament atteigne 20 μM ou 50 μM. Ajouter le diméthylsulfoxyde (DMSO) à la concentration de 0,2 % dans le groupe témoin négatif.
- Préparation des tubes de verre contenant les médicaments
- Pour faciliter l’écoulement du milieu, insérez soigneusement une longueur appropriée de tube de verre dans un petit bécher. Le milieu entrera naturellement dans le tube de verre en raison de la pression atmosphérique.
- Retirez le tube de verre lorsque le milieu de culture est complètement solidifié et essuyez la paroi extérieure pour obtenir un tube de verre de surveillance avec un milieu de culture contenant des médicaments à une extrémité.
- Chauffez la paraffine solide dans un bécher jusqu’à ce qu’elle fonde à 70 °C, placez l’extrémité du tube de verre près de l’aliment dans le liquide de paraffine sur environ 5 mm et retirez-la rapidement. Attendez que la paraffine se solidifie pour sceller l’extrémité alimentaire du tube en verre.
3. Conception expérimentale et traitement des mouches
- Concevez l’expérience pour le traitement des mouches en suivant le tableau 1.
4. Assemblage de la drosophile et surveillance du sommeil
NOTE : La procédure d’assemblage de la drosophile suit les travaux de Jin et al.34 avec des modifications.
- Anesthésiez les mouches avec du gaz CO2 , mettez-les dans des tubes en verre scellés à la paraffine (un par tube) et bloquez l’extrémité non alimentaire avec une boule de coton absorbante pour empêcher les mouches de s’échapper et assurer la circulation de l’air.
- Chargez les tubes sur le moniteur infrarouge pour les surveiller.
- Assemblez les tubes de verre contenant les mouches sur un moniteur infrarouge dans la même direction, et notez le numéro du moniteur et le numéro de trou correspondant à chaque médicament.
- Ajustez l’alignement de chaque tube et faites passer les rayons infrarouges verticalement à travers le centre de la plage d’activité de la mouche.
- Placez le moniteur à l’intérieur d’un incubateur à 25 °C situé dans la chambre noire du sommeil des mouches, en suivant les paramètres spécifiés : température de 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (équivalent à l’heure locale de 20h00) et ZT24 (équivalent à l’heure locale de 08h00). Cette configuration garantit que les mouches connaissent des périodes alternées de 12 h de lumière et d’obscurité.
REMARQUE : Essayez de ne pas ouvrir la porte tant que la collecte des données de surveillance n’est pas terminée afin de maintenir un environnement stable dans l’incubateur pendant la surveillance. - Démarrez la surveillance à l’aide du système DAM2 (voir le tableau des matériaux).
- Une fois la surveillance terminée, téléchargez les données collectées au format .txt à partir du système.
5. Traitement des données
REMARQUE : Le traitement des données à l’aide du système DAM, DAMFileScan107 et SCAMP a été effectué conformément aux instructions figurant sur leurs sites Web officiels (voir le tableau des matériaux).
- Importez le fichier txt ci-dessus dans le logiciel DAMFileScan107 pour le numériser et divisez-le au besoin pour obtenir des données de sommeil.
- Définissez l’heure de début des données de segmentation sur 8 h 01 (segmentation de 1 min) ou 8 h 00 (segmentation de 30 min) le troisième matin suivant le démarrage des moniteurs, et l’heure de fin est de 8 h 00 trois jours après l’heure de début (Figure 2A1).
REMARQUE : Les mouches doivent s’adapter à l’environnement de surveillance pendant au moins une journée. Ainsi, on peut régler l’heure de début des données fractionnées à 8 heures du matin le troisième jour après le démarrage du moniteur. - Divisez les données à des intervalles de 1 min et 30 min. Changez l’option « Bin Length » sur 1 minute, changez l’option « Output File Type » en Channel files, renommez et sortez. La méthode de segmentation des données en 30 minutes est la même que ci-dessus (Figure 2A2-5).
REMARQUE : Lors de la segmentation des données à des intervalles de 1 min et 30 min, le renommage final des deux fichiers doit être cohérent ; sinon, il risque d’être illisible lors d’un traitement Matlab ultérieur. Si nécessaire, le nom du fichier peut être modifié après la sortie pour faciliter la différenciation.
- Définissez l’heure de début des données de segmentation sur 8 h 01 (segmentation de 1 min) ou 8 h 00 (segmentation de 30 min) le troisième matin suivant le démarrage des moniteurs, et l’heure de fin est de 8 h 00 trois jours après l’heure de début (Figure 2A1).
- Traitement des données à l’aide de SCAMP2020
- Ouvrez le package de programmes SCAMP2020 dans Matlab, puis double-cliquez sur Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figure 2B).
- Ajoutez son sous-dossier « Vecsey SCAMP Scripts » au chemin d’accès, recherchez le fichier « scamp.m » dans ce dossier et exécutez-le. Dans la fenêtre contextuelle suivante, sélectionnez les dossiers de processus 1 min et 30 min dans l’ordre (Figure 2C,D).
- Sélectionnez un moniteur, cliquez sur Charger les tracés individuels à prévisualiser (Figure 3A1) et vérifiez l’image qui s’affiche. Décochez le canal correspondant des mouches mortes (Figure 3A2, Figure 3B).
- Répétez les étapes ci-dessus pour vérifier tous les moniteurs.
- Renommez chaque canal de chaque moniteur en fonction de la drogue correspondante à tester (Figure 3A3), sélectionnez tous les moniteurs et cliquez sur ANALYSER les données sélectionnées pour l’analyse (Figure 3A4).
- Par défaut, choisissez l’option sélectionnée, cliquez sur Analyser pour le groupe choisi, cochez la case Exporter les données, et enfin cliquez sur GRAPHIQUE 30 min Types de données pour tous les jours pour les groupes sélectionnés et EXPORTER toutes les données pour afficher les résultats (Figure 3C).
- Sélectionnez le fichier nommé s30 dans le fichier CSV, recherchez la valeur moyenne et les données d’erreur standard correspondantes pour chaque moniteur, sauvegardez-le dans Excel pour le modifier et l’ajuster, puis collez-le dans GraphPad Prism (voir la table des matériaux) pour dessiner un diagramme d’état de veille (Figure 4A,B).
- Recherchez le fichier nommé « stdur » et calculez les valeurs moyennes du sommeil diurne, nocturne et total pour chaque mouche dans les trois jours (Figure 4A,C). Collez les données dans le logiciel Prism pour effectuer le test de différence et dessiner un graphique.
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Representative Results
La réserpine est une petite molécule inhibitrice du transporteur vésiculaire de la monoamine (VMAT), qui inhibe la recapture des monoamines dans les vésicules présynaptiques, ce qui entraîne une augmentation du sommeil33. Les effets favorisant le sommeil de la réserpine ont été examinés chez des mouches âgées de 30 jours, le groupe témoin étant nourri uniquement avec le solvant diméthylsulfoxyde (DMSO). Dans le groupe Réserpine, les mouches plus âgées ont montré une augmentation significative du sommeil pendant la journée et la nuit par rapport au groupe DMSO. Les figures 5A et E illustrent les habitudes de sommeil des mouches de la réserpine et du DMSO sur trois jours consécutifs, tandis que les figures 5B-D et 5F-H montrent les résultats du test différentiel sur les données de sommeil. Pour éliminer la possibilité que le médicament agisse exclusivement sur un sexe, les expériences ont été répétées en utilisant des mouches mâles. Différentes concentrations de réserpine, 20 μM et 50 μM, ont été administrées, démontrant une corrélation positive entre la concentration de réserpine et la promotion du sommeil.
Figure 1 : Processus expérimental de criblage de médicaments à petite molécule pour les troubles du sommeil liés à l’âge. Les mouches âgées ont été placées dans un petit tube de verre avec de la nourriture contenant les médicaments à tester. Les habitudes de sommeil ont été surveillées en continu pendant trois jours à l’aide du système DAM. Les données acquises ont été importées dans un ordinateur pour traitement, visualisation et analyse, ce qui a conduit à des conclusions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Numérisation et division des données. (A) Sélection et balayage des données, suivis d’une segmentation temporelle séquentielle. (B) Emplacement du dossier « Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) ». (C) Ajout du sous-dossier « Vecsey SCAMP Scripts » au chemin. (D) Emplacement du fichier « scamp.m ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Sélection et traitement des données de sommeil. (A) Aperçu des conditions de sommeil des mouches, décochant le canal pour les mouches mortes, et regroupement et analyse des données sélectionnées. (B) Aperçu du sommeil de la drosophile, où un rectangle bleu uniforme indique un sommeil actif, tandis qu’un certain moment d’un rectangle bleu uniforme suggère que la mouche est morte. Les mouches mortes sont marquées par des rectangles rouges. (C) Analyse et sortie de données sélectionnées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats de l’analyse des données sur le sommeil. (A) Sélection des fichiers s30 et stdur à partir du fichier CSV. (B) La valeur moyenne et l’erreur-type de la moyenne (SEM) du sommeil pour chaque groupe en « s30.csv ». (C) Valeurs du jour (Bin1, Bin3, Bin5), de la nuit (Bin2, Bin4, Bin6) et du sommeil total pour chaque mouche dans les trois jours en « stdur.csv ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Conditions de sommeil des mouches âgées traitées à la réserpine. (A) Représentation schématique du temps de sommeil dans les 3 jours chez les femelles âgées nourries avec 0,2 % de DMSO, 20 μM de réserpine et 50 μM de réserpine. (B-D) Analyse quantitative de la durée moyenne de sommeil diurne, nocturne et totale dans les 3 jours avec ou sans médicaments. Les résultats démontrent une augmentation significative du temps de sommeil chez les femelles âgées nourries avec de la réserpine. N = 8 pour chaque groupe, ANOVA à un facteur, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Représentation schématique du temps de sommeil dans les 3 jours chez les hommes âgés nourris avec 0,2 % de DMSO, 20 μM de réserpine et 50 μM de réserpine. (F-H) Analyse quantitative de la durée moyenne de sommeil diurne, nocturne et totale dans les 3 jours avec ou sans médicaments. Les résultats indiquent que le temps de sommeil a augmenté chez les hommes nourris avec de la réserpine. n = 16 pour chaque groupe, ANOVA à un facteur, *p < 0,05, **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Comparaison de la durée du sommeil entre les jeunes et les vieilles mouches. (A) Schéma de principe illustrant le suivi de la durée du sommeil sur 3 jours chez les mâles jeunes et âgés. (B-D) L’analyse quantitative de la durée moyenne de sommeil diurne, nocturne et totale sur 3 jours chez les hommes jeunes et âgés n’a révélé aucune différence significative. n = 32 pour chaque groupe, test t non apparié, n.s., non significatif. (E) Surveillance schématique de la durée du sommeil sur 3 jours chez les femmes jeunes et âgées. (F-H) L’analyse quantitative de la durée moyenne de sommeil diurne, nocturne et totale sur 3 jours chez les femmes jeunes et âgées a démontré une diminution significative du temps de sommeil diurne, nocturne et total chez les femmes âgées par rapport aux jeunes femmes. n = 32 pour chaque groupe, test t non apparié, ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Groupe | Groupe d’étude | Traitement | Âge et sexe des mouches | Nombre de mouches | |||||
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Contrôles normaux | 4 mL de milieu de culture simple avec 0,2 % de DMSO pendant 4 jours | 30 jours mâles/femelles | 16 mouches par groupe | |||||
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Test de dépistage de drogue à faible dose |
4 mL de milieu de culture simple avec 20 μM de réserpine pendant 4 jours | 30 jours femelles | 16 mouches par groupe | |||||
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Test de dépistage de drogue à forte dose |
4 mL de milieu de culture simple avec 50 μM de réserpine pendant 4 jours | 30 jours femelles | 16 mouches par groupe | |||||
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Test de dépistage de drogue à faible dose |
4 mL de milieu de culture simple avec 20 μM de réserpine pendant 4 jours | 30 jours mâles | 16 mouches par groupe | |||||
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Test de dépistage de drogue à forte dose |
4 mL de milieu de culture simple avec 50 μM de réserpine pendant 4 jours | 30 jours mâles | 16 mouches par groupe | |||||
Tableau 1 : Plan expérimental pour le traitement des mouches.
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Discussion
La méthode décrite est adaptée au dépistage rapide des somnifères de petite et moyenne taille. À l’heure actuelle, la plupart des méthodes courantes de criblage de médicaments à haut débit sont basées sur des niveaux biochimiques et cellulaires. Par exemple, la structure et les propriétés du récepteur sont examinées pour rechercher des ligands spécifiques qui peuvent s’y lier22. Une autre approche consiste à analyser le mode de liaison et la force des fragments moléculaires de certains médicaments à l’aide de la résonance magnétique nucléaire (RMN) avec la spectrométrie de masse35. Cependant, ces méthodes ont souvent un taux d’erreur de dépistage relativement élevé, et les médicaments sélectionnés par leur intermédiaire ne montrent souvent aucun effet dans les expériences animales ou cliniques. L’efficacité des médicaments dans l’organisme est influencée par divers facteurs, tels que l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’excrétion des médicaments, ce qui entraîne un taux élevé de faux dépistages. En revanche, bien que la méthode que nous proposons ait une échelle de criblage plus petite par rapport aux méthodes à haut débit, elle offre une approche plus simple et plus rentable en observant directement les effets des médicaments sur les phénotypes. Cela démontre le potentiel de l’utilisation du modèle de la drosophile pour le dépistage efficace des médicaments et l’identification des cibles médicamenteuses.
La drosophile possède un mécanisme de régulation du sommeil conservé et présente des troubles du sommeil associés au vieillissement. Nous avons observé que la durée du sommeil des mouches femelles de 30 jours était significativement plus courte que celle des mouches de 7 jours, tandis que la durée de sommeil des mouches mâles de 30 jours ne différait pas significativement de celle des mouches de 7 jours (Figure 6). Par conséquent, des mouches femelles âgées de 30 jours ont été sélectionnées pour les expériences actuelles. Le processus de dépistage en plusieurs rondes a été effectué afin de réduire au minimum le brouillage causé par des facteurs accidentels. La concentration du médicament dans le premier cycle a été fixée à 20 μM pour éviter les effets secondaires toxiques qui pourraient entraîner la mortalité des mouches. Lors de la deuxième série de criblage, la concentration du médicament a été augmentée à 50 μM afin d’évaluer les effets du médicament à différentes concentrations. Des médicaments sélectionnés lors de la deuxième série ont été administrés à des mouches mâles à la fois à 20 μM et à 50 μM afin d’évaluer les différences entre les sexes dans les effets des médicaments. Cela a permis de dépister les médicaments qui ont constamment démontré des effets liés au sommeil. Par exemple, il a déjà été démontré que la réserpine augmente le sommeil chez les mouches adultes âgées de 4 à 6 jours31. Nous avons réussi à reproduire ce résultat dans notre modèle en utilisant des mouches plus âgées, où les femelles plus âgées ont montré une augmentation significative du sommeil après avoir reçu de la réserpine (Figure 5).
Le DMSO a été utilisé pour dissoudre les médicaments, mais sa toxicité potentielle doit être prise en compte. Des études antérieures ont montré que des concentrations de 0,1 % à 0,25 % de DMSO dans le milieu de culture ne nuisent pas aux cellules ciliées de rat dans les 24 heures, tandis que des concentrations de 0,5 % à 6 % augmentent considérablement la mort cellulaire36. De même, il a été constaté que des concentrations de DMSO de 0,1 % ou moins n’affectent pas l’expression des enzymes ou des transporteurs clés liés au métabolisme des médicaments dans les hépatocytes humains. Pourtant, des concentrations plus élevées peuvent induire des changements dans l’expression37. Cependant, il convient de noter que 0,1 % de DMSO affecte de manière significative la durée de vie des mouches femelles, mais pas des mâles38. De plus, il a été démontré que l’administration intrapéritonéale de 15 % et 20 % de DMSO interfère avec le sommeil chez le rat39. Pour atténuer la toxicité potentielle du DMSO, nous avons maintenu sa concentration en dessous de 0,2 %.
Actuellement, il existe deux méthodes principales utilisées pour caractériser le comportement de la drosophile. L’une des méthodes est basée sur l’analyse vidéo, qui fournit une multitude de paramètres comportementaux, notamment la position de la mouche, la vitesse et les mouvements subtils des parties du corps. L’autre méthode est basée sur la rupture par faisceau infrarouge, comme le système DAM. 40. Cependant, il est important de noter que certains outils d’analyse vidéo comme PySolo sont conçus pour étudier plusieurs mouches résidentes uniques, ce qui limite le nombre de mouches pouvant être placées sous une caméra41. D’autres outils tels que C-trax42 et JAABA43 peuvent effectuer un suivi de la population, mais sont coûteux en calcul et prennent beaucoup de temps. Pour le criblage à haut débit, la capture de la durée globale du sommeil des mouches est généralement suffisante, et des paramètres de mouvement précis ne sont pas nécessaires. Par conséquent, la méthode largement utilisée et hautement évolutive basée sur la fracture du faisceau infrarouge est préférée. Cependant, cette méthode a aussi ses limites. Par exemple, si les mouches ne se déplacent qu’à une extrémité du tube sans interrompre le faisceau infrarouge, le système peut l’enregistrer par erreur comme un sommeil, ce qui conduit à une surestimation du sommeil44. De plus, il est important de tester soigneusement la motilité de la souche de mouche avant de l’utiliser dans le criblage afin d’éviter les influences involontaires.
Voici quelques conseils utiles pour une installation réussie : (1) Pour éviter que les aliments ne collent au tube de verre lors du retrait du petit bécher après solidification, on peut essayer d’insérer le tube de verre verticalement dans le fond du petit bécher avant que les aliments ne se solidifient. Tirer doucement le tube de verre d’avant en arrière, tapoter le fond du bécher pour permettre à l’air d’entrer, faire tourner lentement le bécher pour retirer tous les aliments et le tube de verre, puis essuyer soigneusement tous les aliments restants sur la paroi extérieure du tube de verre peut être efficace. (2) Lors de l’étanchéité de l’extrémité alimentaire du tube en verre avec un film de paraffine, il est recommandé d’utiliser un bain-marie pour chauffer lentement le film jusqu’à ce que la paraffine fonde. Cette approche permet d’éviter le problème des éclaboussures violentes de l’aliment médicinal à haute température et de la contamination du film de paraffine. Alternativement, on peut utiliser de petits bouchons en plastique pour le scellage, mais assurez-vous que l’air peut entrer pendant le scellage, ce qui fait pousser les aliments vers le haut dans l’ensemble. (3) Il convient de considérer que certains médicaments puissants favorisant le sommeil peuvent initialement conduire à un jugement erroné des mouches testées comme mortes. Pour surmonter ce problème, il est recommandé de définir un gradient de concentration, permettant d’explorer la concentration optimale du médicament et de répéter l’expérience. (4) Tenir compte du fait que l’odeur du médicament peut influencer la quantité de nourriture consommée par les mouches et leur consommation de médicament, ce qui peut affecter l’exactitude des résultats expérimentaux. Par conséquent, il peut être avantageux de prolonger la durée de l’expérience de manière appropriée, en veillant à ce que les mouches aient suffisamment de temps pour consommer autant de médicament que possible et en renforçant l’effet d’accumulation du médicament. (5) Pour le traitement des données, alors que de nombreuses universités et instituts ont accès à Matlab pour un usage public, il existe des alternatives moins coûteuses disponibles pour les particuliers ou les institutions de recherche qui n’ont pas encore acheté le programme. L’une des options recommandées est ShinyR-DAM v3.1 « Refresh»45.
En conclusion, nous avons développé une procédure étape par étape pour le dépistage des médicaments pour traiter les troubles du sommeil. À l’aide d’un modèle de mouche plus ancien présentant un phénotype de durée de sommeil plus courte, l’efficacité de la réserpine dans l’augmentation de la durée du sommeil chez les mouches femelles plus âgées est validée. Cette méthode offre une nouvelle approche du criblage de médicaments avec un potentiel d’application important et sert de base à la recherche sur les médicaments. Bien que les effets des médicaments soient évalués en fonction des phénotypes, le mécanisme sous-jacent de l’action des médicaments reste inconnu. D’autres études seront menées pour étudier la pathologie des troubles du sommeil et la régulation moléculaire du sommeil, mettant ainsi en lumière les mécanismes pharmacologiques impliqués. Bien que la machinerie circadienne de la drosophile présente des similitudes avec les oscillateurs humains, les différences dans les mécanismes de contrôle du sommeil entre les humains et les mouches ne doivent pas être négligées. Ce protocole fournit un cadre de base pour le dépistage des troubles du sommeil. Cependant, les recherches futures détermineront si l’un des médicaments examinés peut être utilisé pour un traitement clinique, ainsi que d’élucider leurs mécanismes d’action.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire du professeur Junhai Han pour leurs discussions et leurs commentaires. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine 32170970 à Y.T et le « Cyanine Blue Project » de la province du Jiangsu à Z.C.Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ager | BIOFROXX | 8211KG001 | |
| Artificial Climate Box | PRANDT | PRX-1000A | official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/ |
| DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKineics | DAM2 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAM2system | TriKineics | version:v3.03 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAMFileScan | TriKineics | version:1.0.7.0 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| Dimethyl Sulfoxide | SIGMA | 276855 | |
| Drosophila Activity Monitoring Incubator | Tritech Research | DT2-CIRC-TK | official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html |
| Drosophila Bottles | Biologix | 51-17720 | official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48 |
| Drosophila: w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC_3605 | |
| Excel | Microsoft | version:Excel 2016 | official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel |
| Glass tubes | TriKinetics | PPT5x65 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| MATLABR2022b | MathWorks | version:9.13.0.2049777 | official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html |
| Prism | GraphPad | Version:Prism 8.0.1 | official website:https://www.graphpad.com/features |
| Reserpine | MACKLIN | R817202-1g | |
| Saccharose | SIGMA | 1245GR500 | |
| SCAMP | Vecsey Lab | N/A | official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/ |
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